分子生物学实验论文.docx

1、分子生物学实验论文小鼠-actin基因的克隆【摘要】 -actin基因是肌动蛋白的一种，在各种细胞和组织当中，-actin基因表达相对稳定【1】，且-actin基因在核DNA中有多个拷贝，增加了核DNA的检测率【2】，在PCR当中常常被作为内参使用。本次实验通过对从小鼠肝脏中提取得到的RNA进行PT-PCR、扩增、克隆、筛选以及PCR鉴定和酶切鉴定等，获得纯度较好的-actin基因，为以后的实验打下了基础。【Abstract】 -actin gene is a kind of actin，In all sorts of cells and tissues，-actin gene express

2、 relatively stable【1】，and -actin genes in nuclear DNA has multiple copies，increased nuclear DNA detection rate【2】，so that it is often used as the reference in PCR。This experiment by making PT-PCR, amplification, clone, filter, and PCR identification and endonuclease identification, etc.of RNA,which

3、is extracted from the livers of the mice , gets the good purity of -actin genes, lay the foundation of the later experiment.【关键词】RT-PCR，克隆，酶切 目录1、前言.22、实验仪器、试剂与材料.32.1实验仪器.32.2试剂与材料.33、方法与结果分析.43.1小鼠肝脏总RNA提取43.1.1 实验步骤43.2 RTPCR、扩增产物纯化与琼脂糖凝胶电泳鉴定53.2.1 实验步骤.53.2.2结果分析.53.3 RT-PCR产物克隆.63.3.1 实验步骤63.3.

4、2结果分析.63.4转化子的筛选及PCR鉴定.83.4.1 实验步骤83.4.2结果分析.93.5重组质粒提取与酶切鉴定.103.5.1 实验步骤.103.5.2结果分析.114、结论.12参考文献.131、前言-actin在不同长生条件和不同生长阶段稳定表达，因而常作为一种内参基因被广泛使用，对于-actin基因的研究也有很多的实验【3】，然而纸上得来终觉浅，觉知此事要鞠行，正所谓实践出真知，通过这次小鼠-actin基因的克隆的实验，我们不仅了解到了-actin基因的作用，同时实验操作能力大大增强，更重要的是，我们获得了独立思考的能力和懂得了团队合作精神的重要性。这正是我们开展大实验的初衷。

5、2、实验仪器、试剂与材料2.1实验仪器:低温高速离心机（Anke TGL-16B，上海安亭科学仪器厂），组织研磨棒，DEPC水处理的EP管与枪头，移液器（0.5-10微升、10-200微升，100-1000微升的量程），一次性手套，眼科剪，眼科镊，止血钳，PCR仪(2720 Thermal Cycler，AB Applied Biosystems)； 恒温水浴箱（HWS 26型电热恒温水浴箱，上海一恒科技有限公司，上海一恒科学仪器有限公司），微波炉（WG700TL20-K6,佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司），电泳仪（DYY-8C型电泳仪，北京市六一仪器厂），紫外分析仪（北京市六一仪器厂）

6、； 净化超净台（SW-CJ-IF，苏净集团苏州安泰空气技术有限公司），冰盒，培养箱（MODEL，SGSP-02，黄石市恒丰医疗器械有限公司），摇床（气浴恒温振荡器，SHZ-82A，金坛市宏华仪器厂），玻璃试管，离心机，玻璃棒； 涂布器，灭菌试管。 2.2试剂与材料：小鼠，Trizd试剂，氯仿（三氯甲烷CHCL3,天津市富宇精细化工有限公司），异丙酮（CH3）2CHOH,江苏强盛化工有限公司出品，上海润捷化学试剂有限公司总代理，75乙醇（DEPC处理的水配制），无水乙醇（CH3）2CHOH,江苏强盛化工有限公司出品，上海润捷化学试剂有限公司总代理，5RT Buffer，dNTP Mixture，

7、RNase Inhibitor，AMV Reverse Transcriptase，Oligo dT-Adaptor Primer； MgCl2、10RT Buffer、RNase Free H2O、dNTP Mixture 、RNase Inhibitor、AMV Reverse Transcriptase、Oligo dT-Adaptor Primer、5PCR Buffer、dH2O、dNTP Mixture、TaKaRa Ex Taq HS、上下游PCR引物（10pmol/L） 、凝胶回收试剂盒、TAE Buffer、电泳上样缓冲液、EB、DNA Marker； pMD19-T载体试剂

8、盒，0.1M CaCl2， 菌株与培养基【大肠杆菌DH5；LB(Amp-)培养基，含X-gal和IPTG的LB(Amp+)平板】； LB（含Amp）液体培养基 ，PCR Buffer、dNTP mix、Primer 1# 、Primer 2#、 Taq DNA polymerase 、H2O、琼脂糖、TAE电泳缓冲液、上样缓冲液、DNA染料； 含质粒DNA的过夜培养的DH5菌株LB菌液1.5mL，溶液【50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)】，溶液（0.2 mol/L NaOH ，1% SDS），溶液【（乙酸

9、钾溶液）：5 mol/L KAc 60mL，冰醋酸 11.5mL，H2O 28.5mL，定容至100mL, 并高压灭菌，溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Ac 5mol/L】，异丙醇、无水乙醇、70乙醇，酶切鉴定试剂（限制性内切酶酶切所需试剂：质粒DNA、EcoR I、HindIII 和酶切反应缓冲液，琼脂糖凝胶电泳所需试剂：1的琼脂糖凝胶，TAE电泳缓冲液，10加样缓冲液，DNA染料。3、方法与结果分析3.1小鼠肝脏总RNA提取3.1.1 实验步骤3.1.1.1 解剖小鼠，取其肝脏，分成六份，取一份放入已含500ul Trizol的DEPC处理过的1.5ml EP管中；3.1.1.2 快

10、速研磨，再加500mlTrizol研磨，室温5min使其充分溶解；3.1.1.3 12000rpm离心5min，将上清转移至一新的DEPC处理后的 1.5mL EP中，加入200L 氯仿，振荡混匀，室温放置3 min；3.1.1.4 12000 rpm离心15 min；3.1.1.5 离心后混合物分为三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA无一例外地存在于水样层当中。小心移取上层无色水样层，转移至另一新EP管中；3.1.1.6 加入500L异丙醇，室温放置15 min；3.1.1.7 12000 rpm离心15 min，这时会在EP管的底部看到白色沉淀；轻轻弃去上清；3.

11、1.1.8 加入1 mL 75乙醇（用DEPC处理的水配制）洗涤RNA沉淀；3.1.1.9 7500 rpm离心5 min, 弃上清；将EP管倒置，干燥，挥发剩余的乙醇；3.1.1.10用20ul DEPC处理的水溶解RNA沉淀。3.2 RTPCR、扩增产物纯化与琼脂糖凝胶电泳鉴定3.2.1实验步骤3.2.1.1 RTPCR：配好并混匀反转录反应液（5RT Buffer 2L+dNTP Mixture 4L+RNase Inhibitor 0.5L+AMV Reverse Transcriptase 1L+Oligo dT-Adaptor Primer 0.5L+实验样品RNA 2L），然后进

12、行反转录反应（42 30min、99 5min、5 5min）；3.2.1.2 PCR反应：配好并混匀PCR反应液（10PCR Buffer 5L+ddH2O 28ul+dNTP Mixture 4L+ TaKaRa Taq HS 1L+上游PCR引物 1ul+下游PCR引物 1ul），然后进行PCR反应【94 2min、（94 30sec、61.5 30sec、72 1.5min）30 Cycle、72 7min、4】；3.2.1.3 琼脂糖凝胶电泳：称1g琼脂糖+100mlTAE缓冲液，微波炉加热2分钟熔化后取出，待其冷却到手可以忍受的温度时加入5ulEB混匀，然后倒入装好的胶槽内（一块大

13、胶两块小胶）。胶凝固后大胶上样（50ul样品+10ul Loading Buffer，混匀，因觉得加50ul梳子孔装不下，后来就只加了40ul，剩下的加到第二个孔）。电泳（109mA），指示剂跑到胶的一半时停止；3.2.1.4 扩增产物的纯化：将胶拍照后拿到紫外灯下观察，切取所需DNA条带于1.5mlEP管中+200ul Binding Buffer（xp2）59.9水浴熔化。将熔胶液转移至套在一个2mL收集管的HiBind DNA Mini柱子中10000转离心1min。弃滤液，+300ul Binding Buffer（xp2）10000转离心1min。弃滤液，+700ul SPW Was

14、h Buffer 10000转离心1min，重复一次。弃滤液，13000转离心2min。将柱子装到一个新EP管中，+20ul Elution Buffer 13000转离心1min洗脱DNA,重复一次。3.2.1.5 跑电泳（小胶）：5ul样品+1ul Loading Buffer，128mA电泳，因跑得太慢，中途改为143mA、103v。电泳结束拿胶去拍照。3.2.2结果分析3.2.2.1 图一 PCR扩增产物的凝胶电泳图首先加的是marker，左边标的数字对应表示marker的分子量。其余两孔上的样是RT-PCR扩增后的样品，可见每个孔道显示有两条条带，上面那条小的条带表示的是扩增后的DN

15、A，分子量为1.2kb，与marker的分子量对比相差不大，比较准确；下面大的条带表示的是PCR扩增后留下来的引物等杂质。50ul样品+10ul Loading Buffer配好上样液，隔孔加，本来每孔上样50ul，但一开始有的组加了50ul的样品溢了出来，后来就改为加40ul，我们组1孔加40ul，剩下的上样液就全部加到2孔了。可见这两个孔的DNA条带都很浅，由于荧光强度与DNA含量成正比，所以证明我们的样品中所含DNA量较少，可能是因为我们操作不够严谨，致使部分RNA被RNA酶降解了；或者PCR过程反应不充分，因为我们在PCR管上贴了标签，这会影响PCR的温度，使反应不能准确充分地进行；又

16、可能是因为我们分开加的量太少，这些因素都会影响DNA的含量。3.2.2.2 图二 扩增产物纯化后的凝胶电泳图这是纯化后的显示条带，对比图一，可见DNA含量条带基本相同，证明纯化效果较好，同时进一步鉴定了该条带确实表示的是DNA的含量，达到预期理想的效果。3.3 RT-PCR产物克隆3.3.1实验步骤3.3.1.1 PCR产物与T载体的连接：用0.2ml的PCR管做实验组（dd H2O 2 L+Solution 5 L+ pMD19-T载体 1 L+PCR产物 2 L）和对照组（dd H2O 3L+Solution 5 L+ pMD19-T载体 1 L+ Control Insert 1 L），

17、轻混，16连接反应30min以上。3.3.1.2 大肠杆菌感受态细胞的制备：接种10 L甘油菌至含有2ml 培养基（Amp-）的试管中，37振荡培养过夜。以1%的接种量将甘油菌种30 L接种到3ml LB培养基（Amp-）中，37振荡培养3h(此时菌液的A600值达到0.30.4)。室温下，以5000rpm离心2min，回收细胞。在超净工作台里用枪头吸取上清弃掉，再用100L预冷的0.1M CaCl2 溶液重悬菌体（重悬时操作要轻），冰浴放置。3.3.1.3 大肠杆菌的转化（无菌操作）：将连接产物（试验组和对照组）加入到制备好的感受态细胞里，用加样枪反复吹打，将质粒与感受态细胞混合均匀，冰浴1

18、0 min；42水浴热休克2 min，时间到后迅速在冰上冷却10 min；加入1mL LB培养基（Amp-），37静置半小时；5000rpm离心2min，在超净工作台中用枪头吸取800L上清弃掉，用剩余的液体将细胞悬浮；将悬浮细胞全部吸取并转移至含X-gal和IPTG的LB(Amp+)平板上，用无菌玻璃棒涂布均匀，37倒置培养过夜。 3.4转化子的筛选及PCR鉴定3.4.1实验步骤3.4.1.1 蓝白斑平板的制作：于1L烧杯中加入：Tryptone 10g、Yeast Extract 5g和NaCl 10g，加入约800mL 的去离子水，充分搅拌混匀。滴加5N NaOH(约0.2mL),调节P

19、H值至7.0。加去离子水将培养基定容至1L后，加入15g Agar。高温高压灭菌后，冷却至60度左右。加入1mL Ampicillin(100mg/mL)、1mL IPTG（24mg/mL）、2mL X-Gal（20 mg/mL）后均匀混合。 铺制平板（30-35mL培养基/90mm培养皿）。4度避光保存,一般存放24小时后才开始使用。次日从37度温箱中取出平板观察，蓝色菌落即初步认定为未转化菌，白色菌落初步认定为转化子。3.4.1.2 菌落PCR：按顺序在配PCR反应体系（10X PCR Buffer 2L+ dNTP mix 1.6L+Primer1# 1ul +Primer2# 1L+T

20、aq DNA polymerase 0.5L+dd H2O 13.9L），常温下随机挑选一个转化板上的转化子，用灭菌的小枪头挑取少量菌体；先将小枪头放入一支装有约3mL LB（Amp+）培养基的试管中洗涤2-3次，然后将同一枪头浸入装有PCR mixture的PCR管中反复吹打以作扩增培养细菌用，做两管；另取一PCR管，先进行操作（2）的操作，但不加转化子模板，作为阴性对照。将以上两个PCR管轻微离心后，放入PCR仪中反应【94 5 min 、（94 30sec、61.5 30sec、72 1.5min）30Cycle、72 7min、4 】。取少量10L PCR反应产物，1%琼脂糖电泳分析。

21、紫外检测仪下观察并记录扩增片段大小。注意：电泳时需有标准DNA 分子量Marker和不加模板的阴性对照样品。上述操作（2）中的洗涤过有菌枪头的试管，空气摇床37, 180-200rpm过夜（12-14hr）扩增培养，以备后续实验质粒提取及酶切使用。3.4.2结果分析图三 蓝白斑平板菌落图观察蓝白斑平板可以看到平板上有许多的菌落被克隆长出来，菌落布满整个平板，表明我们的平板涂布得很均匀；同时大部分菌落是白色的（转化子），只有少量甚至没有是蓝色菌（未转化菌），说明我们在转化这一步做得很成功；但是下午再观察的时候，发现蓝色菌好像又长了一些，可能因为菌落长得慢，同时也有可能是是因为放在桌面上暴露于空气

22、中污染影响所导致，这些差别表明我们上午挑菌的实验可能会有些少的错误，例如挑到了蓝色的未转化的但是还没有显示出蓝色的菌落，而拿这些菌落去培养的话，会造成实验结果的失败。图四 转化子PCR反应产物的凝胶电泳图第1、2孔加的是PCR反应产物，可见第1孔效果较为理想，第2孔条带颜色稍浅，可能是挑取菌落的枪头在LB培养基的试管中洗涤次数过多，以致枪头再放到PCR管中吹打时此时剩下的菌落已经很少了；亦有可能是在平板上挑取的菌落的时候挑到的菌落太少，反而把较多的琼脂挑了进来，稀释了溶液中DNA的浓度，因而DNA含量低，条带显示较淡。当然，第一孔太亮的话也有可能是因为挑的菌落太多，引起基因的非特异性扩增。重组

23、子PCR后之所以只显示1.2kb而不是3.9kb条带，是因为引物只是特异的扩增目的基因【4】。3.5重组质粒提取与酶切鉴定3.5.1实验步骤3.5.1.1 重组质粒提取：取1.5mL培养液分两次倒入1.5mL EP管中， 12000r/min离心1分钟，弃上清，将管倒置于吸水纸上数分钟，使液体流尽。 加入100L溶液，用枪头充分重悬菌体沉淀。加入新配制的溶液200L, 盖紧管口，立即轻柔上下颠倒4-5次。（3min左右，别超过5min）加入150L溶液，盖紧管口，上下颠倒EP管5-10次。12000r/min离心5分钟。用黄枪头小心将上清转移到一新EP管中（分别得400ml、400ml和430

24、ml），再加入等体积酚氯仿(下层)，混匀。12000r/min 离心2分钟。 将上清移至一新EP管中（分别得350ml、250ml和400ml），加入两倍体积的无水乙醇，12000r/min 离心5分钟，弃上清。加入1mL 70的乙醇，用枪头轻轻吹打洗涤沉淀，注意不要将沉淀打碎或吸走。12000r/min 离心5分钟，小心用弃去上清，注意不要将沉淀倒走。将EP管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，室温自然干燥。用20L 含RNaseA的无菌蒸馏水溶解提取物，室温放置，充分溶解DNA。3.5.1.2 酶切鉴定：在EP管内配酶切反应体系（质粒DNA 10L+10酶切反应缓冲液 2L+EcoR I 1L+Hi

25、ndIII 1L+无菌蒸馏水 6L）。离心混匀，37水浴反应34小时。制备1的琼脂糖凝胶板。取酶切后全部DNA样品10ul加入上样缓冲液2ul混匀。上样进行琼脂糖凝胶电泳（131mA，103U）。3.5.1.3 电泳胶拍照，紫外监测仪观察3.5.2结果分析图五 质粒酶切鉴定图 该电泳图中第1、2、3孔分别是没有酶切的样品5-1、5-2、5-3，第4、5、6孔分别是酶切以后的样品5-1、5-2、5-3，最左边的是marker及其各条带分子量大小。由图可知，没有酶切的第1孔和对应的有酶切的第4孔电泳之后都没有条带显示，分析原因得知，最大可能是由于第1管即5-1是最早做的，可能因为时间太长了而导致D

26、NA被降解，不过也有可能是溶液量少使DNA释放不出来或者溶液没有很好的中和前面的碱性溶液而使得质粒的DNA复性变得不可溶。重组子的分子量大小未3.9kb，其中质粒的是2.7kb，目的基因的是1.2kb。然而没有经过酶切的2、3孔都同时显示出了3.9kb和2.7kb的条带出来，这进一步证明了在电泳之前已经有部分目的基因被降解了。第2、3孔道的条带的位置有偏差，则与质粒DNA的构象有关，质粒DNA的存在形式有三种：共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；开环DNA，此种质粒DNA两条链中有一条发生一处或多处断裂；线性DNA,因质粒的两条链在同一处断裂而造成。质粒DNA的三种形式泳动速度：超螺旋线性开环

27、。因而出现了同一物质条带在泳道上的位置偏差。再看第5孔道，经过酶切以后的，很好的分离出了2.7kb和1.2kb的条带，而且没有3.9kb的条带出现，说明这是一个很好的完全切除；而第6孔道的现象与第2、3孔道差不多，显然是受第2孔道部分目的基因降解的影响，但第6孔道的3.9kb带又明显比第2孔道的亮，同时考虑到第5孔的没有出现3.9kb的条带，这充分说明了第2、3孔的样品是在酶切反应的时间里被就降解的。当然，影响酶切效果的因素有很多，除了酶反应条件外，最主要的是DNA的纯度。例如，样品中含有大量的RNA杂质、某些杂蛋白未除净而结合在DNA上，都会影响酶切效果。至于提取过程中未除净的各种影响因素就

28、更多了，例如微量的氯仿、SDS、EDTA、酚、EB、乙醇或者琼脂糖凝胶之中的硫酸根离子等。【5】4、结论 这次实验最后结果显示我们组克隆的小鼠-actin基因与质粒的重组子大部分没有切除和不完全切除，得不到比较理想的结果，说明我们的实验操作能力和团队合作精神尚有待加强，警示我们在实验过程中更要注意一些细节和时间的控制。不过所幸，我们还是有一孔的条带清楚显示了质粒与目的基因的完全切除，证明我们的能力还是有的，缺乏的只是实践能力，只要多动手，相信我们以后会做得更好。总的来说，第一次做此类大实验，我们有这样的成绩，还是值得鼓励的。参考文献【1】 周国燕，陈唯实，冉姝，等，用DSC测定小鼠看家基因-actin的PCR反应体系的比热，上海理工大学食品与低温生物技术研究所，食品科学-生物工程348第10期，2007，vol.28.【2】 袁正杰，张改生，孙瑞，等，内参法在线粒体DNA纯度鉴定中的应用，麦类作物学报，2009，29（6）：1088-1093.【3】 杨爱馥，周遵春，董颖，等，仿刺参cytb和-actin基因表达稳定性比较，中国农业科技导报，2010.12（1）;79-84.【4】 http：XX百科【5】