动物细胞工程实验指导.docx

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动物细胞工程实验指导

实验时间

实验内容

4月11日

实验一培养用液的配制、除菌与分装

4月18日

实验二细胞的传代培养

4月25日

实验三鱼类细胞原代培养（组织块法）（1-5组）401

实验四染色体制备（6-10组）301

5月2日

实验三鱼类细胞原代培养（组织块法）（6-10组）401

实验四染色体制备（1-5组）301

5月9日

实验五细胞的复苏与冻存

实验一培养用液的配制、除菌与分装

【实验目的】

1.掌握常见培养用液的配制方法。

2.掌握常用的灭菌方法。

3.了解每种培养用液的作用。

【实验原理】

常用细胞培养用液包括磷酸盐平衡盐溶液（PhosphateBufferedSaline，PBS）、液体培养基、胰蛋白酶（Trypsin）和EDTA溶液。

PBS用于清洗细胞、配制胰蛋白酶和EDTA。

培养基含有细胞生长需要的各种营养元素，使用时通常还需填加血清和抗生素。

鱼类细胞培养的培养基常用种类是MEM和L-15；用于动物的一般是DMEM和RPMI-1640。

胰蛋白酶可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。

EDTA用于清洗细胞表面，螯合Ca2+等二价离子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。

细胞培养用的试剂必需是无菌的，PBS和EDTA可以采用高压灭菌，而培养基和胰蛋白酶溶液含生物活性物质，配制好后通过过滤除菌。

【试剂、材料与仪器】

试剂：

NaCl，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，EDTA，胰蛋白酶，HEPES，碳酸氢钠，盐酸，MEM或PRMI-1640培养基干粉，GPS

材料：

三蒸水，蒸馏水瓶，药匙，称量纸，烧杯（250mL、1000mL），玻棒，精密pH试纸（6.8-8.0），容量瓶（250mL、1000mL），移液管（5mL、10mL），一次性注射器，一次性过滤器，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，酒精喷壶，消毒纱布，已高压灭菌试剂瓶（500mL、250mL、100mL），记号笔，标签纸，橡胶手套，封口膜

仪器：

精密天平，高压灭菌锅，超净工作台，加液枪，4℃冰箱

【实验分组】

实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。

配制PBS并高压灭菌，配制胰蛋白酶溶液并过滤除菌和分装，配制EDTA溶液高压灭菌并分装，配制培养基，过滤除菌培养基并分装。

每个实验小组需准备试剂有：

胰酶50mL；EDTA50mL；培养基90mL（使用前加入10mL血清）。

【实验步骤】

1．PBS（1000mL）的配制

分别称取NaCl8g；KCl0.2g；Na2HPO4·12H2O2.9g；KH2PO40.2g于烧杯，加入800mL三蒸水，玻棒搅动充分溶解后，倒入1000mL容量瓶中，用三蒸水定容至刻度。

PBS用于2胰蛋白酶溶液和3EDTA溶液的配制，余下高压灭菌备用。

2．胰蛋白酶溶液（0.25%）的配制、除菌与分装

称取0.625g胰蛋白酶于250mL烧杯，加入1配制的PBS200mL，玻棒搅拌充分溶解后，倒入250mL容量瓶中，用PBS定容至刻度。

拿入超净工作台过滤除菌，并分装至5个试剂瓶（100mL），每瓶50mL。

试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放4℃冰箱保存备用。

标签上标明：

0.25%胰蛋白酶液、配制日期、以及组号与组长姓名。

3．EDTA（0.2％）的配制、除菌与分装

称取0.5gEDTA于250mL烧杯，加入1配制的PBS200mL，溶解时加少量NaHCO3，调整pH为8.0，玻棒搅拌使EDTA充分溶解。

再用PBS定容到250mL容量瓶里，终浓度为0.2%，用浓盐酸，调pH为7.2-7.4。

装于250mL试剂瓶中，高压灭菌备用。

在超净工作台内，将已灭菌的EDTA溶液分装至5个无菌试剂瓶（100mL），每瓶50mL。

试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放4℃冰箱保存备用。

标签上标明：

0.2%EDTA、配制日期、以及组号与组长姓名。

4．培养基的配制、除菌与分装

将培养基干粉（MEM或PRMI-1640）倒入1000mL烧杯，加800mL三蒸水，玻棒搅拌充分溶解；再加入加1.8gHEPES和2.2g碳酸氢钠，玻棒搅拌充分溶解，溶液呈橙色（弱酸性，pH在7.0左右）；再倒入1000mL容量瓶，用三蒸水定容至刻度。

工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。

在超净工作台中摆放好试剂瓶和滤器。

将培养液拿入超净工作台过滤除菌，并分装至5个无菌试剂瓶（100mL），每瓶90mL，余下装入500mL无菌试剂瓶，每瓶内需加入无菌的GPS（谷氨酰胺-青霉素-链霉素），轻轻摇匀，使之终浓度为1%。

试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放4℃冰箱保存备用。

标签上标明：

MEM或PRMI-1640、配制日期、以及组号与组长姓名。

用于细胞培养时，培养基内需要加入血清，生长培养基内血清浓度为10%。

【注意事项】

1.滤过除菌时，将容量瓶内的液体倒入烧杯内，再拿到超净台里，采用一次性滤器或是抽滤法除菌。

2.培养基中的抗生素可在配置时加入青霉素和链霉素的粉末，也可在过滤除菌后加入无菌的液体，终浓度为100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。

【思考题】

1.配制细胞生长培养液时，需要添加哪些物质，为什么？

如何调节培养液的pH？

2.生长培养基中的血清一般在什么时候添加，为什么？

3.细胞培养中的各种试剂的灭菌和除菌方法有哪些，如何使用？

实验二细胞的传代培养

【实验目的】

1.掌握贴壁细胞换液和细胞传代的方法。

2.了解细胞传代培养的意义。

【实验原理】

细胞在培养瓶里的生长，分为贴壁生长和悬浮生长。

贴壁生长细胞在培养瓶中生长数天后，就会在培养瓶底部长满，如果不进行处理，就会继续生长而产生堆积，最后因缺乏营养供给而死亡。

因此当细胞生长贴满瓶底时，就需要将细胞消化下来，并接种成多瓶细胞，使细胞继续生长。

这一处理接种的过程就叫传代，每接种一次就叫做传一代。

细胞传代培养使得细胞增殖，可获得大量细胞供实验所需。

传代培养是组织培养常规保种方法之一，是几乎所有细胞生物学实验的基础。

接种后的细胞放在培养箱里静置培养，培养的温度视动物种类而定。

一般，温水性鱼类细胞的最适培养温度为25-28℃，冷水鱼类细胞为15-20℃，水生哺乳动物细胞为37℃。

细胞培养过程中常出现培养基营养缺乏、代谢产物增多、变酸等不适宜细胞生长因素，而此时细胞还未生长达到饱和密度（没有贴满底部），仍需继续培养，因而需要更新营养液来更新营养成分，以满足细胞继续生长繁殖的需要，这一过程叫换液。

单纯换液不需要接种细胞。

【试剂、材料与仪器】

试剂：

生长培养基（PRMI-1640或MEM，添加10%小牛血清或胎牛血清），0.25%胰蛋白酶，0.2%EDTA

材料：

细胞培养瓶，移液管（5mL、10mL），无菌离心管，废液缸，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，酒精喷壶，消毒纱布，记号笔，橡胶手套，封口膜

仪器：

生化培养箱或CO2培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，低速离心机，4℃冰箱

【实验分组】

实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。

【实验步骤】

工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。

在超净工作台中摆放好移液管、离心管和培养瓶等。

1．观察细胞：

倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代，当细胞长满瓶底时可以传代；

2．超净工作台准备：

将试剂瓶、培养瓶等培养用具用酒精喷洒，用消毒纱布擦净，置于超净工作台酒精灯左侧；

3．开盖：

旋开细胞培养瓶瓶盖，将瓶盖侧立于（严禁倒扣放置）酒精灯旁，将培养瓶内液体（旧培养基）倒入15mL离心管，3000rpm/min离心5min备用。

培养瓶瓶口、瓶盖以及离心管管口、管盖均需过酒精灯火焰后再盖好；

4．清洗细胞表面：

打开移液管盒，用普镊捏住移液管（5mL）后部从盒子中拖出（注意移液管的管壁和管口不能碰到其他物品），安装好加液枪，移液管管口和管壁均过酒精灯火焰。

酌情吸取2-4mLEDTA溶液，清洗细胞表面，去掉残留的旧培养基以及漂浮的死细胞，再倒弃EDTA溶液；

5．胰酶消化：

用移液管吸取2mL胰蛋白酶，从培养瓶侧面加入细胞培养瓶内，盖好瓶盖后，在倒置显微镜下观察，当80%的细胞收回突起变圆时，立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶；

6．中和消化：

用移液管吸取旧培养基上清液3mL（也可用新鲜生长培养基），加入细胞培养瓶中，终止胰酶消化，并反复轻轻吹打消化好的细胞使其脱离瓶壁并分散；

7．沉淀细胞：

将细胞悬液吸入15mL的离心管中，1000rpm/min离心8分钟，获得细胞沉淀；

8．加入新鲜培养基：

倒弃上清液，保留细胞沉淀（注意只能倒一次，不能反复倒），然后用另一新移液管吸取10mL的新鲜培养基加入培养瓶中5mL，余下5mL加入离心管内悬浮细胞沉淀，吸取离心管中的细胞悬液加入细胞培养瓶中，与另外5mL培养基混匀；

9．接种细胞：

吸取5mL上述的细胞悬液，加入另一个新细胞培养瓶中，接种后2个培养瓶中的悬液各5mL；

10.静置培养：

盖上瓶盖，拧紧，标记（包括细胞名称、代数、传代日期），放入常规的生化培养箱静置培养（如果放入CO2培养箱，瓶盖拧紧后再稍回转）；

11.观察细胞：

每天观察细胞生长状况，并确定是否进行第2代的传代。

【注意事项】

1.传代培养时要注意无菌操作，所有操作要尽量靠近酒精灯火焰，手不能在瓶口上方操作，以免污染气体进入瓶内。

要防止细胞之间的交叉污染，每次最好只进行一种细胞的操作，每一种细胞使用一套器材。

每种试剂使用一个移液管，培养用液要严格分开。

2.坚持每天观察细胞，生长致密时即可传代。

如发现有污染迹象，应丢弃污染的细胞。

3.细胞消化时要注意观察，不要消化过度，否则细胞不宜存活。

吹打细胞时，确保瓶壁所有地方均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，以防细胞破碎。

4.培养箱不要反复多次开关，以免影响温度的稳定和增加污染的机率。

【思考题】

1.贴壁细胞的传代培养方法及注意事项。

2.常用的细胞消化液有哪些？

各种消化液的作用原理分别是什么？

3.悬浮生长的细胞如何传代培养？

实验三鱼类细胞原代培养（组织块法）

【实验目的】

1.掌握鱼类细胞原代培养的组织块法。

2.了解细胞原代培养的酶消化法和机械分离法。

【实验原理】

细胞培养分为原代培养和传代培养。

原代培养常用方法有组织块法、酶消化法和机械分离法等。

组织块法是直接从生物体获取组织，切割成微小的组织块，然后贴附于培养瓶底部，通过培养液供给营养，在合适的温度中孵育，让组织块周边慢慢地长出细胞来，经消化传代，获得大量均一的细胞，用于传代培养和相关细胞实验。

【试剂、材料与仪器】

试剂：

MEM培养基，GPS，两性霉素B，硫酸庆大霉素，表皮生长因子（EGF），成纤维生长因子（FGF）

材料：

试验幼鱼，原代培养瓶，无菌培养皿，移液管（5mL），无菌离心管（15ml），解剖探针，手术剪，眼科剪，眼科镊，手术刀，医用酒精，烧杯（250mL），废液缸，普镊，酒精灯，打火机，消毒纱布，酒精喷壶，记号笔，橡胶手套，封口膜

仪器：

生化培养箱或CO2培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，4℃冰箱

【实验分组】

实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组，每组中分别取肌肉、鳍条、肝和鳔4种组织。

【实验步骤】

1.试剂配制

抗生素培养基（AIM）：

90mL培养液（2×MEM）+5mLGPS（10×）+5mL两性霉素B（250μg/mL）+1mL硫酸庆大霉素（50mg/mL）混合，4℃保存备用。

原代培养基：

80mL培养液+2mLGPS（10×）+20mLFBS+EGF（2μg/mL）+FGF（25ng/mL）混合，4℃保存备用。

传代培养基：

90mL培养液+1mLGPS（10×）+10mLFBS混合，4℃保存备用。

2.组织分离和细胞培养

工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。

在超净工作台中摆放好培养皿、移液管和培养瓶。

将灭过菌的手术器械（解剖刀2把，眼科镊2把，眼科剪1把）插入盛有医用酒精的玻璃烧杯中浸泡备用。

以下操作均在超净台里进行：

1）杀幼鱼与消毒体表：

用解剖探针破坏幼鱼脑后，将幼鱼置于酒精中，浸泡30秒。

2）取肌肉与鳍条：

用消毒纱布托住鱼体，用手术剪取下鳍条或背部肌肉，并置于盛有AIM培养基的培养皿

（1）内浸泡消毒，培养皿上写上组织名称。

3）用纱布擦去手术器械上的残余组织，将手术器械放入盛有医用酒精的烧杯中涮洗浸泡。

用眼科剪打开体腔，用眼科镊取出肝或鳔，并置于盛有AIM的培养皿

（2）内浸泡消毒，培养皿上写上组织名称。

注意：

取体表和体内不同的组织时，手术器械应分开并浸泡消毒，防止组织细胞交叉污染。

4）组织块在AIM内浸泡2小时，每半小时换1次AIM培养基。

换液方法：

涮洗AIM中的组织块，倒去旧液，用移液管吸取新鲜AIM加入培养皿内。

5）用眼科镊夹取组织块，移入无菌培养皿（3）内，用手术刀切除和刮去多余的组织，如脂肪和坏死组织，血液、筋膜等，再用新移液管吸AIM清洗组织块1-2次。

6）将组织块移入无菌培养皿（4）内，用手术刀将组织块切成约1mm2的小块，用新移液管吸取AIM少量，将组织碎块浸润。

7）打开培养瓶盖，用新移液管吸取湿润的微小组织块（约20-30个），接种于25cm2培养瓶底部，用移液管将组织块涂抹均匀，培养瓶瓶口和瓶盖过酒精灯火焰后再盖好拧紧，培养瓶上做好标记（包括组织名称和原代培养日期）。

8）将培养瓶拿到培养箱内，静置贴壁2小时，再将培养瓶侧放半小时，用移液管将残余液体吸出。

9）用新移液管从细胞培养瓶侧面缓慢加入4-5mL原代培养基，培养瓶保持竖立，培养瓶瓶口和瓶盖过酒精灯火焰后再盖好拧紧。

小心将细胞培养瓶拿入培养箱内，缓慢轻柔地将培养瓶平放（让培养基慢慢浸润组织块，避免组织块脱离瓶壁漂浮），静置培养。

10）注意观察细胞生长情况，大约1-2周后，细胞开始从组织块底部延伸出来。

当细胞长满时，可消化传代，原瓶可保留继续生长细胞。

【注意事项】

1．尽量选取幼年的生物体组织或者繁殖能力较强的组织，如幼鱼、胚胎、肿瘤组织等，作为实验材料。

2．原代培养时要注意无菌操作，所有操作要尽量靠近酒精灯火焰，手不能在瓶口上方操作，以免污染气体进入瓶内。

要防止组织之间的交叉污染，注意更换移液管。

3．组织块要静置贴壁2小时，能黏附于瓶壁时，再与加入培养液，操作要轻且缓慢，勿使组织块漂浮起来。

如果组织块没有贴壁，细胞则不易生长。

如组织块漂浮，需重新贴壁！

【思考题】

1.细胞原代培养（组织块法）的方法及注意事项。

2.常用的细胞原代培养方法有哪些？

分别适用于哪些组织？

实验四细胞的冻存

【实验目的】

1.掌握细胞保存的方法

2.熟悉细胞冻存的原理

【实验原理】

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。

利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而保持细胞特性，在需要的时候再复苏细胞用于实验。

冻存细胞还起到了细胞保种的作用，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种。

细胞冻存时向培养基中加入保护剂二甲基亚砜（DMSO，终浓度5-15%），可使溶液冰点降低，在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。

采用“慢冻快融”的方法能较好地保证细胞的存活。

标准冷冻速度开始为-1---2℃/min，当温度低于-25℃时可加速，到-80℃之后可直接投入液氮内（-196℃）。

【试剂、材料与仪器】

试剂：

生长培养基（PRMI-1640或MEM，添加10%小牛血清或胎牛血清），0.25%胰蛋白酶，0.2%EDTA，二甲基亚砜（DMSO），液氮，异丙醇

材料：

冻存管，移液管（2mL、5mL），无菌离心管，废液缸，普镊，酒精灯，打火机，消毒纱布，医用酒精，酒精喷壶，记号笔，橡胶手套，封口膜

仪器：

倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，低速离心机，4℃冰箱，-80℃冰箱，程序降温盒，液氮罐，制冰机

【实验分组】

实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。

【实验步骤】

工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。

程序降温盒盛装异丙醇，使用前4℃预冷。

在超净工作台中摆放好冻存管、移液管、离心管和试剂瓶。

冻存管上作好标记，包括细胞名称，代数和冻存日期。

1.收集细胞：

取待冻存的细胞，倒弃旧液，用移液管吸取2-4mLEDTA清洗细胞表面，弃去，再吸取2mL胰蛋白酶加入细胞培养瓶，消化1-2分钟，轻轻拍打瓶侧，使细胞脱离瓶底。

加入2mL培养基将细胞轻轻吹打冲洗下来，移入15mL离心管，1000rpm/min离心7min，弃上清，保留离心管底部细胞沉淀。

2.细胞冻存液的配制：

在15mL离心管中依次加入：

DMSO0.6mL、新鲜培养液1.8mL和血清0.6mL，作为A液（3mL）。

轻轻吹打混匀，离心管加盖后立即插入冰里。

注意吸取试剂时，移液管均需更换，不能混用。

3.冻存细胞：

在1步获得的细胞沉淀中，加入3mL培养液，轻轻吹打混匀，制成细胞悬浮（B液）。

吸取细胞悬液（B液）与A液均匀混合。

混合时，从离心管底部向上缓慢拖着滴加，边加边转动移液管，使细胞与冻存液充分混匀。

混合后细胞悬液为6mL，分装于冻存管中，每管1-1.5mL，盖好冻存管盖，放入盛有异丙醇的程序降温盒中，立即放入-80℃，24小时后，将装有细胞的冻存管转移到液氮内，并做好记录。

【注意事项】

1．冻存液需现配现用，配制好后放置在冰中，保持低温。

冻存液中含20%血清和10%DMSO，配制时添加血清和DMSO要错开，即血清和DMSO二者不能直接混合。

2．程序降温盒要提前装好异丙醇，且4℃预冷。

3．冻存管内细胞的密度通常为105-106个/mL，一般铺满一个25cm2的细胞培养瓶的细胞量可以冻存1-2mL。

4．准备进行冻存的细胞，要处于对数生长期，即细胞传代后24h左右，且细胞生长状态良好，这样才能保证冻存细胞复苏时，有较高的存活率。

5．要准确记录冻存细胞的种类，代数，冻存时间和冻存者的姓名。

【思考题】

1．为什么要配制细胞冻存（A液），并将细胞悬液（B液）与之混合？

2．冻存细胞时，为什么要加入二甲基亚砜？

为什么要缓慢降温？

实验五细胞的复苏

【实验目的】

1.掌握细胞复苏的方法

2.熟悉细胞复苏的原理

【实验原理】

细胞复苏时要快速融化，必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化，使细胞冻存时产生的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。

复苏后的细胞可继续进行传代增殖，做实验材料和再次冻存。

【试剂、材料与仪器】

试剂：

生长培养基（PRMI-1640或MEM，添加10%小牛血清或胎牛血清）

材料：

细胞培养瓶，移液管（5mL、10mL），无菌离心管，废液缸，普镊，酒精灯，打火机，消毒纱布，医用酒精，酒精喷壶，记号笔，橡胶手套，封口膜

仪器：

生化培养箱或CO2培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，低速离心机，水浴锅，液氮罐

【实验分组】

实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。

【实验步骤】

工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。

将水浴锅预热至37℃，在超净工作台中摆放好移液管、离心管和培养瓶。

1.取出冻存管：

根据细胞冻存记录找到所需细胞存放之处，从液氮罐中取出待复苏细胞。

2.迅速解冻：

立即将冻存管放入37℃温水中迅速解冻，要不断晃动冻存管，大约在1min内使冻存管内液体完全溶解。

取出冻存管，酒精喷洒擦拭冻存管盖周边，拿入超净工作台。

3.加培养液：

吸取冻存管内的细胞悬液，加入离心管，再向离心管内加入5-8mL生长培养液，1000rpm/min离心8min，获得细胞沉淀。

倒弃上清，加入4-5mL生长培养基，轻轻吹打混匀细胞，将细胞移入细胞培养瓶。

4.贴壁与换液：

将细胞于培养箱中静置培养24小时，观察细胞贴壁情况。

吸去旧液，加入新鲜生长培养基。

【注意事项】

1.细胞复苏时，注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段（-5～0℃）。

这样复苏的冻存细胞存活率高，细胞生长及形态良好。

2.由于冻存的细胞中会有部分细胞死亡，静置培养24小时后，可将不贴壁、飘浮在培养液上的死细胞弃去，更换新鲜培养液。

3.如果冻存的细胞保存时间较长或之前细胞复苏时，细胞存活率不高，可以直接在培养瓶内加入冻存管内的细胞悬液和5mL的新鲜培养基，静置培养10-12h后，更换新鲜培养基。

【思考题】

1．复苏细胞时，为什么要快速融化？

2．如果冻存管内的细胞密度偏低，复苏时如何处理？

实验六染色体制备

【实验目的】

1.掌握培养细胞的染色体的制备方法

2.熟悉细胞染色体制备的原理

【实验原理】

每一物种的细胞一般都具有一定数目、形状和大小的染色体。

在秋水仙素的作用下可使分裂细胞阻断在中期，此时染色体形态最典型，然后通过低渗、固定、染色等步骤，便可在显微镜下呈现出其形态。

【试剂、材料与仪器】

试剂：

生长培养基（PRMI-1640或MEM，添加10%小牛血清或胎牛血清），0.25%胰蛋白酶，0.2%EDTA，PBS，冰醋酸，甲醇，秋水仙碱，95%乙醇，HCl，Giemsa染液，双蒸水

材料：

细胞培养瓶，移液管（5mL、10mL），无菌离心管，载玻片，胶头滴管，染色缸，废液缸，普镊，酒精灯，打火机，消毒纱布，医用酒精，酒精喷壶，记号笔，橡胶手套，封口膜

仪器：

生化培养箱或CO2培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，低速离心机，切片烘干机，制冰机，水浴锅

【实验分组】

实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。

【实验步骤】

1.细胞处理

1）将细胞接种于2个T75cm2培养瓶中生长约24h，形成80%融合的单层细胞；

2）弃去旧培养基，加入10mL新鲜含10%血清的生长培养基和0.1mL秋水仙碱溶液（1μg/mL，PBS配制），25°C下继续培养13~15h；

3）用EDTA和胰蛋白酶消化收集细胞，1000rpm/min离心5分钟；

4）收集沉淀细胞，加2mLPBS混匀细胞，移到T75cm2的培养瓶，慢慢加10mL预冷的双蒸水（4℃），室温孵育10min；

5）慢慢加入10mL固定液（现配的冰醋酸：

甲醇=1:

3），室温放置10min，移入2个离心管，每管11mL，1000rpm/min离心10min，弃上清，留约2mL，再加入3mL新