动物细胞工程实验指导.docx

1、动物细胞工程实验指导 实验时间实验内容4月11日实验一 培养用液的配制、除菌与分装4月18日实验二 细胞的传代培养4月25日实验三 鱼类细胞原代培养（组织块法）（1-5组）401实验四 染色体制备（6-10组）3015月2日实验三 鱼类细胞原代培养（组织块法）（6-10组）401实验四 染色体制备（1-5组）3015月9日实验五 细胞的复苏与冻存实验一 培养用液的配制、除菌与分装【实验目的】1. 掌握常见培养用液的配制方法。2. 掌握常用的灭菌方法。3. 了解每种培养用液的作用。【实验原理】 常用细胞培养用液包括磷酸盐平衡盐溶液（Phosphate Buffered Saline，PBS）、液

2、体培养基、胰蛋白酶（Trypsin）和EDTA溶液。PBS用于清洗细胞、配制胰蛋白酶和 EDTA。培养基含有细胞生长需要的各种营养元素，使用时通常还需填加血清和抗生素。鱼类细胞培养的培养基常用种类是MEM 和L-15；用于动物的一般是DMEM和RPMI-1640。胰蛋白酶可将贴壁的细胞从培养瓶壁上消化下来，通常使用浓度为0.25%或0.125%。EDTA 用于清洗细胞表面，螯合Ca2+等二价离子，使细胞易于为胰蛋白酶消化。细胞培养用的试剂必需是无菌的，PBS和EDTA可以采用高压灭菌，而培养基和胰蛋白酶溶液含生物活性物质，配制好后通过过滤除菌。【试剂、材料与仪器】试剂：NaCl，KCl，Na2

3、HPO4，KH2PO4，EDTA，胰蛋白酶，HEPES，碳酸氢钠，盐酸，MEM或PRMI-1640培养基干粉，GPS材料：三蒸水，蒸馏水瓶，药匙，称量纸，烧杯（250 mL、1000 mL），玻棒，精密pH试纸（6.8-8.0），容量瓶（250 mL、1000 mL），移液管（5 mL、10 mL），一次性注射器，一次性过滤器，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，酒精喷壶，消毒纱布，已高压灭菌试剂瓶（500 mL、250 mL、100 mL），记号笔，标签纸，橡胶手套，封口膜仪器：精密天平，高压灭菌锅，超净工作台，加液枪，4冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。配制PBS并

4、高压灭菌，配制胰蛋白酶溶液并过滤除菌和分装，配制EDTA溶液高压灭菌并分装，配制培养基，过滤除菌培养基并分装。每个实验小组需准备试剂有：胰酶 50 mL；EDTA 50 mL；培养基90 mL（使用前加入10 mL血清）。 【实验步骤】 1PBS（1000mL）的配制分别称取NaCl 8g；KCl 0.2g；Na2HPO412H2O 2.9g ；KH2PO4 0.2g于烧杯，加入800 mL三蒸水，玻棒搅动充分溶解后，倒入1000mL容量瓶中，用三蒸水定容至刻度。PBS用于2胰蛋白酶溶液和3 EDTA溶液的配制，余下高压灭菌备用。2胰蛋白酶溶液（0.25%）的配制、除菌与分装 称取0.625g

5、胰蛋白酶于250 mL烧杯，加入1配制的PBS 200 mL，玻棒搅拌充分溶解后，倒入250 mL容量瓶中，用PBS定容至刻度。拿入超净工作台过滤除菌，并分装至5个试剂瓶（100 mL），每瓶50 mL。试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放4 冰箱保存备用。标签上标明：0.25%胰蛋白酶液、配制日期、以及组号与组长姓名。 3EDTA（0.2）的配制、除菌与分装 称取0.5 g EDTA 于250 mL烧杯，加入1配制的PBS 200 mL，溶解时加少量NaHCO3，调整pH为8.0，玻棒搅拌使EDTA充分溶解。再用 PBS定容到250 mL容量瓶里，终浓度为0.2%，用浓盐

6、酸，调pH为7.2-7.4。装于250 mL试剂瓶中，高压灭菌备用。在超净工作台内，将已灭菌的EDTA溶液分装至5个无菌试剂瓶（100 mL），每瓶50 mL。试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放4 冰箱保存备用。标签上标明：0.2% EDTA、配制日期、以及组号与组长姓名。4培养基的配制、除菌与分装 将培养基干粉（MEM或PRMI-1640）倒入1000 mL烧杯，加800mL三蒸水，玻棒搅拌充分溶解；再加入加1.8g HEPES和2.2g碳酸氢钠，玻棒搅拌充分溶解，溶液呈橙色（弱酸性，pH在7.0左右）；再倒入1000 mL容量瓶，用三蒸水定容至刻度。工作前打开超净工作

7、台上的紫外灯，灭菌30分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。在超净工作台中摆放好试剂瓶和滤器。将培养液拿入超净工作台过滤除菌，并分装至5个无菌试剂瓶（100 mL），每瓶90 mL，余下装入500 mL无菌试剂瓶，每瓶内需加入无菌的GPS（谷氨酰胺-青霉素-链霉素），轻轻摇匀，使之终浓度为1%。试剂瓶均在酒精灯火焰上烧口加盖，贴好标签，封口膜封口，放4 冰箱保存备用。标签上标明：MEM或PRMI-1640、配制日期、以及组号与组长姓名。 用于细胞培养时，培养基内需要加入血清，生长培养基内血清浓度为10%。 【注意事项】1

8、. 滤过除菌时，将容量瓶内的液体倒入烧杯内，再拿到超净台里，采用一次性滤器或是抽滤法除菌。 2. 培养基中的抗生素可在配置时加入青霉素和链霉素的粉末，也可在过滤除菌后加入无菌的液体，终浓度为100 U/mL 青霉素和100 g/mL链霉素。 【思考题】1. 配制细胞生长培养液时，需要添加哪些物质，为什么？如何调节培养液的pH？2. 生长培养基中的血清一般在什么时候添加，为什么？ 3. 细胞培养中的各种试剂的灭菌和除菌方法有哪些，如何使用？ 实验二 细胞的传代培养【实验目的】 1. 掌握贴壁细胞换液和细胞传代的方法。2. 了解细胞传代培养的意义。【实验原理】细胞在培养瓶里的生长，分为贴壁生长和悬

9、浮生长。贴壁生长细胞在培养瓶中生长数天后，就会在培养瓶底部长满，如果不进行处理，就会继续生长而产生堆积，最后因缺乏营养供给而死亡。因此当细胞生长贴满瓶底时，就需要将细胞消化下来，并接种成多瓶细胞，使细胞继续生长。这一处理接种的过程就叫传代，每接种一次就叫做传一代。细胞传代培养使得细胞增殖，可获得大量细胞供实验所需。传代培养是组织培养常规保种方法之一，是几乎所有细胞生物学实验的基础。接种后的细胞放在培养箱里静置培养，培养的温度视动物种类而定。一般，温水性鱼类细胞的最适培养温度为25-28，冷水鱼类细胞为15-20，水生哺乳动物细胞为37。细胞培养过程中常出现培养基营养缺乏、代谢产物增多、变酸等不

10、适宜细胞生长因素，而此时细胞还未生长达到饱和密度（没有贴满底部），仍需继续培养，因而需要更新营养液来更新营养成分，以满足细胞继续生长繁殖的需要，这一过程叫换液。单纯换液不需要接种细胞。 【试剂、材料与仪器】试剂：生长培养基（PRMI-1640或 MEM，添加10% 小牛血清或胎牛血清），0.25% 胰蛋白酶，0.2% EDTA材料：细胞培养瓶，移液管（5 mL、10 mL），无菌离心管，废液缸，普镊，酒精灯，打火机，医用酒精，酒精喷壶，消毒纱布，记号笔，橡胶手套，封口膜仪器：生化培养箱或CO2培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，低速离心机，4冰箱【实验分组】 实验分组进行，每组4人，每

11、班20人，共分5组。【实验步骤】工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。在超净工作台中摆放好移液管、离心管和培养瓶等。1 观察细胞：倒置显微镜下观察细胞形态，确定细胞是否需要传代，当细胞长满瓶底时可以传代；2 超净工作台准备：将试剂瓶、培养瓶等培养用具用酒精喷洒，用消毒纱布擦净，置于超净工作台酒精灯左侧；3 开盖：旋开细胞培养瓶瓶盖，将瓶盖侧立于（严禁倒扣放置）酒精灯旁，将培养瓶内液体（旧培养基）倒入15 mL离心管，3000 rpm/min 离心5 min 备用。培养瓶瓶口、瓶盖以

12、及离心管管口、管盖均需过酒精灯火焰后再盖好；4 清洗细胞表面：打开移液管盒，用普镊捏住移液管（5mL）后部从盒子中拖出（注意移液管的管壁和管口不能碰到其他物品），安装好加液枪，移液管管口和管壁均过酒精灯火焰。酌情吸取 2-4 mL EDTA溶液，清洗细胞表面，去掉残留的旧培养基以及漂浮的死细胞，再倒弃EDTA溶液；5 胰酶消化：用移液管吸取2 mL 胰蛋白酶，从培养瓶侧面加入细胞培养瓶内，盖好瓶盖后，在倒置显微镜下观察，当80%的细胞收回突起变圆时，立即翻转培养瓶，使细胞脱离胰酶；6 中和消化：用移液管吸取旧培养基上清液3 mL（也可用新鲜生长培养基），加入细胞培养瓶中，终止胰酶消化，并反复轻

13、轻吹打消化好的细胞使其脱离瓶壁并分散；7 沉淀细胞：将细胞悬液吸入15 mL的离心管中，1000 rpm/min离心8分钟，获得细胞沉淀；8 加入新鲜培养基：倒弃上清液，保留细胞沉淀（注意只能倒一次，不能反复倒），然后用另一新移液管吸取10 mL的新鲜培养基加入培养瓶中5mL，余下5mL加入离心管内悬浮细胞沉淀，吸取离心管中的细胞悬液加入细胞培养瓶中，与另外5mL培养基混匀；9 接种细胞：吸取5 mL上述的细胞悬液，加入另一个新细胞培养瓶中，接种后2个培养瓶中的悬液各5 mL；10. 静置培养：盖上瓶盖，拧紧，标记（包括细胞名称、代数、传代日期），放入常规的生化培养箱静置培养（如果放入CO2培

14、养箱，瓶盖拧紧后再稍回转）；11. 观察细胞：每天观察细胞生长状况，并确定是否进行第2代的传代。【注意事项】1. 传代培养时要注意无菌操作，所有操作要尽量靠近酒精灯火焰，手不能在瓶口上方操作，以免污染气体进入瓶内。要防止细胞之间的交叉污染，每次最好只进行一种细胞的操作，每一种细胞使用一套器材。每种试剂使用一个移液管，培养用液要严格分开。2. 坚持每天观察细胞，生长致密时即可传代。如发现有污染迹象，应丢弃污染的细胞。3. 细胞消化时要注意观察，不要消化过度，否则细胞不宜存活。吹打细胞时，确保瓶壁所有地方均吹打到，吹打时动作要轻柔，不要用力过大，以防细胞破碎。4. 培养箱不要反复多次开关，以免影响

15、温度的稳定和增加污染的机率。 【思考题】1. 贴壁细胞的传代培养方法及注意事项。2. 常用的细胞消化液有哪些？ 各种消化液的作用原理分别是什么？3. 悬浮生长的细胞如何传代培养？实验三 鱼类细胞原代培养（组织块法）【实验目的】1. 掌握鱼类细胞原代培养的组织块法。2. 了解细胞原代培养的酶消化法和机械分离法。【实验原理】细胞培养分为原代培养和传代培养。原代培养常用方法有组织块法、酶消化法和机械分离法等。组织块法是直接从生物体获取组织，切割成微小的组织块，然后贴附于培养瓶底部，通过培养液供给营养，在合适的温度中孵育，让组织块周边慢慢地长出细胞来，经消化传代，获得大量均一的细胞，用于传代培养和相关

16、细胞实验。 【试剂、材料与仪器】试剂：MEM培养基，GPS，两性霉素B，硫酸庆大霉素，表皮生长因子（EGF），成纤维生长因子（FGF）材料：试验幼鱼，原代培养瓶，无菌培养皿，移液管（5 mL），无菌离心管（15 ml），解剖探针，手术剪，眼科剪，眼科镊，手术刀，医用酒精，烧杯（250 mL），废液缸，普镊，酒精灯，打火机，消毒纱布，酒精喷壶，记号笔，橡胶手套，封口膜仪器：生化培养箱或CO2培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，4冰箱【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组，每组中分别取肌肉、鳍条、肝和鳔4种组织。 【实验步骤】1. 试剂配制抗生素培养基（AIM）： 90

17、mL培养液（2MEM）+ 5 mL GPS（10）+5 mL两性霉素B（250 g/mL）+1 mL硫酸庆大霉素（50 mg/mL）混合，4保存备用。原代培养基：80 mL培养液 + 2 mL GPS (10) + 20 mL FBS + EGF（2 g/mL）+ FGF（25 ng/mL）混合，4保存备用。传代培养基：90 mL培养液 + 1 mL GPS (10) + 10 mL FBS混合，4保存备用。2. 组织分离和细胞培养工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。在超净工作台

18、中摆放好培养皿、移液管和培养瓶。将灭过菌的手术器械（解剖刀2把，眼科镊2把，眼科剪1把）插入盛有医用酒精的玻璃烧杯中浸泡备用。以下操作均在超净台里进行： 1) 杀幼鱼与消毒体表：用解剖探针破坏幼鱼脑后，将幼鱼置于酒精中，浸泡30秒。 2) 取肌肉与鳍条：用消毒纱布托住鱼体，用手术剪取下鳍条或背部肌肉，并置于盛有AIM培养基的培养皿（1）内浸泡消毒，培养皿上写上组织名称。3) 用纱布擦去手术器械上的残余组织，将手术器械放入盛有医用酒精的烧杯中涮洗浸泡。用眼科剪打开体腔，用眼科镊取出肝或鳔，并置于盛有AIM的培养皿（2）内浸泡消毒，培养皿上写上组织名称。注意：取体表和体内不同的组织时，手术器械应分

19、开并浸泡消毒，防止组织细胞交叉污染。4) 组织块在AIM内浸泡2小时，每半小时换1次AIM培养基。换液方法：涮洗AIM中的组织块，倒去旧液，用移液管吸取新鲜AIM加入培养皿内。5) 用眼科镊夹取组织块，移入无菌培养皿（3）内，用手术刀切除和刮去多余的组织，如脂肪和坏死组织，血液、筋膜等，再用新移液管吸AIM清洗组织块1-2次。6) 将组织块移入无菌培养皿（4）内，用手术刀将组织块切成约1mm2的小块，用新移液管吸取AIM少量，将组织碎块浸润。7) 打开培养瓶盖，用新移液管吸取湿润的微小组织块（约20-30个），接种于25 cm2培养瓶底部，用移液管将组织块涂抹均匀，培养瓶瓶口和瓶盖过酒精灯火焰

20、后再盖好拧紧，培养瓶上做好标记（包括组织名称和原代培养日期）。8) 将培养瓶拿到培养箱内，静置贴壁2小时，再将培养瓶侧放半小时，用移液管将残余液体吸出。9) 用新移液管从细胞培养瓶侧面缓慢加入 4-5 mL原代培养基，培养瓶保持竖立，培养瓶瓶口和瓶盖过酒精灯火焰后再盖好拧紧。小心将细胞培养瓶拿入培养箱内，缓慢轻柔地将培养瓶平放（让培养基慢慢浸润组织块，避免组织块脱离瓶壁漂浮），静置培养。10) 注意观察细胞生长情况，大约1-2周后，细胞开始从组织块底部延伸出来。当细胞长满时，可消化传代，原瓶可保留继续生长细胞。【注意事项】1 尽量选取幼年的生物体组织或者繁殖能力较强的组织，如幼鱼、胚胎、肿瘤组

21、织等，作为实验材料。2 原代培养时要注意无菌操作，所有操作要尽量靠近酒精灯火焰，手不能在瓶口上方操作，以免污染气体进入瓶内。要防止组织之间的交叉污染，注意更换移液管。3 组织块要静置贴壁2小时，能黏附于瓶壁时，再与加入培养液，操作要轻且缓慢，勿使组织块漂浮起来。如果组织块没有贴壁，细胞则不易生长。如组织块漂浮，需重新贴壁！【思考题】1. 细胞原代培养（组织块法）的方法及注意事项。2. 常用的细胞原代培养方法有哪些？分别适用于哪些组织？实验四 细胞的冻存【实验目的】1. 掌握细胞保存的方法2. 熟悉细胞冻存的原理【实验原理】细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196液氮中低

22、温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而保持细胞特性，在需要的时候再复苏细胞用于实验。冻存细胞还起到了细胞保种的作用，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种。细胞冻存时向培养基中加入保护剂二甲基亚砜（DMSO，终浓度5 - 15%），可使溶液冰点降低，在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用“慢冻快融”的方法能较好地保证细胞的存活。标准冷冻速度开始为 -1- -2/min，当温度低于- 25时可加速，到- 80之后可直接投入液氮内（-196）。【试剂、材料与仪器】试剂：生长培养基（PRMI-1640或 MEM，添加10% 小牛血清或胎牛血清），0.

23、25% 胰蛋白酶，0.2% EDTA，二甲基亚砜（DMSO），液氮，异丙醇材料：冻存管，移液管（2 mL、5 mL），无菌离心管，废液缸，普镊，酒精灯，打火机，消毒纱布，医用酒精，酒精喷壶，记号笔，橡胶手套，封口膜仪器：倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，低速离心机，4冰箱，-80冰箱，程序降温盒，液氮罐，制冰机【实验分组】实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。 【实验步骤】工作前打开超净工作台上的紫外灯，灭菌30分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。程序降温盒盛装异丙醇，使用前4预冷。在超净工作台中摆放好冻存管

24、、移液管、离心管和试剂瓶。冻存管上作好标记，包括细胞名称，代数和冻存日期。1. 收集细胞：取待冻存的细胞，倒弃旧液，用移液管吸取2-4 mL EDTA清洗细胞表面， 弃去，再吸取2 mL胰蛋白酶加入细胞培养瓶，消化1-2分钟，轻轻拍打瓶侧，使细胞脱离瓶底。加入2 mL培养基将细胞轻轻吹打冲洗下来，移入15 mL离心管，1000 rpm/min离心7 min，弃上清，保留离心管底部细胞沉淀。2. 细胞冻存液的配制：在15 mL离心管中依次加入：DMSO 0.6 mL、新鲜培养液 1.8 mL和血清0.6 mL，作为A液（3 mL）。轻轻吹打混匀，离心管加盖后立即插入冰里。注意吸取试剂时，移液管均

25、需更换，不能混用。3. 冻存细胞：在1步获得的细胞沉淀中，加入3 mL培养液，轻轻吹打混匀，制成细胞悬浮（B液）。吸取细胞悬液（B液）与A液均匀混合。混合时，从离心管底部向上缓慢拖着滴加，边加边转动移液管，使细胞与冻存液充分混匀。混合后细胞悬液为6 mL，分装于冻存管中，每管1-1.5 mL，盖好冻存管盖，放入盛有异丙醇的程序降温盒中，立即放入-80，24小时后，将装有细胞的冻存管转移到液氮内，并做好记录。 【注意事项】1 冻存液需现配现用，配制好后放置在冰中，保持低温。冻存液中含20%血清和10% DMSO，配制时添加血清和DMSO要错开，即血清和DMSO二者不能直接混合。2 程序降温盒要提

26、前装好异丙醇，且4预冷。3 冻存管内细胞的密度通常为105-106个/ mL，一般铺满一个25 cm2的细胞培养瓶的细胞量可以冻存1-2mL。4 准备进行冻存的细胞，要处于对数生长期，即细胞传代后24h 左右，且细胞生长状态良好，这样才能保证冻存细胞复苏时，有较高的存活率。5 要准确记录冻存细胞的种类，代数，冻存时间和冻存者的姓名。【思考题】1 为什么要配制细胞冻存（A液），并将细胞悬液（B液）与之混合？ 2 冻存细胞时，为什么要加入二甲基亚砜？为什么要缓慢降温？实验五 细胞的复苏【实验目的】1. 掌握细胞复苏的方法2. 熟悉细胞复苏的原理【实验原理】细胞复苏时要快速融化，必须将冻存在-196

27、液氮中的细胞快速融化，使细胞冻存时产生的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。复苏后的细胞可继续进行传代增殖，做实验材料和再次冻存。【试剂、材料与仪器】试剂：生长培养基（PRMI-1640或 MEM，添加10% 小牛血清或胎牛血清）材料：细胞培养瓶，移液管（5 mL、10 mL），无菌离心管，废液缸，普镊，酒精灯，打火机，消毒纱布，医用酒精，酒精喷壶，记号笔，橡胶手套，封口膜仪器：生化培养箱或CO2培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，低速离心机，水浴锅，液氮罐【实验分组】 实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。 【实验步骤】 工作前打开超净工作台上

28、的紫外灯，灭菌30分钟后，关闭紫外灯，打开吹风和照明灯；带橡胶手套，用酒精擦拭消毒双手；超净工作台面用酒精喷洒，再用消毒纱布擦净。将水浴锅预热至37，在超净工作台中摆放好移液管、离心管和培养瓶。1. 取出冻存管：根据细胞冻存记录找到所需细胞存放之处，从液氮罐中取出待复苏细胞。2. 迅速解冻：立即将冻存管放入37温水中迅速解冻，要不断晃动冻存管，大约在1min内使冻存管内液体完全溶解。取出冻存管，酒精喷洒擦拭冻存管盖周边，拿入超净工作台。3. 加培养液：吸取冻存管内的细胞悬液，加入离心管，再向离心管内加入5-8 mL生长培养液，1000 rpm/min 离心8 min，获得细胞沉淀。倒弃上清，加

29、入4-5 mL 生长培养基，轻轻吹打混匀细胞，将细胞移入细胞培养瓶。4. 贴壁与换液：将细胞于培养箱中静置培养24小时，观察细胞贴壁情况。吸去旧液， 加入新鲜生长培养基。【注意事项】1. 细胞复苏时，注意融化冻存细胞速度要快，可不时摇动冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段（-50）。这样复苏的冻存细胞存活率高，细胞生长及形态良好。2. 由于冻存的细胞中会有部分细胞死亡，静置培养24小时后，可将不贴壁、飘浮在培养液上的死细胞弃去，更换新鲜培养液。3. 如果冻存的细胞保存时间较长或之前细胞复苏时，细胞存活率不高，可以直接在培养瓶内加入冻存管内的细胞悬液和5 mL的新鲜培养基，静置培养10-12h后

30、，更换新鲜培养基。【思考题】1 复苏细胞时，为什么要快速融化？ 2 如果冻存管内的细胞密度偏低，复苏时如何处理？ 实验六 染色体制备【实验目的】1. 掌握培养细胞的染色体的制备方法2. 熟悉细胞染色体制备的原理【实验原理】每一物种的细胞一般都具有一定数目、形状和大小的染色体。在秋水仙素的作用下可使分裂细胞阻断在中期，此时染色体形态最典型，然后通过低渗、固定、染色等步骤，便可在显微镜下呈现出其形态。 【试剂、材料与仪器】试剂：生长培养基（PRMI-1640或 MEM，添加10% 小牛血清或胎牛血清），0.25% 胰蛋白酶，0.2% EDTA，PBS，冰醋酸，甲醇，秋水仙碱，95%乙醇，HCl ，

31、Giemsa染液，双蒸水材料：细胞培养瓶，移液管（5 mL、10 mL），无菌离心管，载玻片，胶头滴管，染色缸，废液缸，普镊，酒精灯，打火机，消毒纱布，医用酒精，酒精喷壶，记号笔，橡胶手套，封口膜仪器：生化培养箱或CO2培养箱，倒置生物显微镜，超净工作台，加液枪，低速离心机，切片烘干机，制冰机，水浴锅【实验分组】 实验分组进行，每组4人，每班20人，共分5组。 【实验步骤】1. 细胞处理1) 将细胞接种于2个T 75cm2培养瓶中生长约24 h，形成80%融合的单层细胞；2) 弃去旧培养基，加入10 mL新鲜含10%血清的生长培养基和0.1 mL秋水仙碱溶液（1 g/mL，PBS配制），25C下继续培养1315 h；3) 用EDTA和胰蛋白酶消化收集细胞，1000 rpm/min离心5分钟；4) 收集沉淀细胞，加 2 mL PBS 混匀细胞，移到T 75cm2 的培养瓶，慢慢加10 mL 预冷的双蒸水（4），室温孵育10 min；5) 慢慢加入10 mL 固定液（现配的冰醋酸：甲醇=1:3），室温放置10 min，移入2个离心管，每管11 mL，1000 rpm/min离心10 min，弃上清，留约2 mL，再加入3 mL 新