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第六章生物化学
§6.生物氧化与氧化磷酸化
6-1生物氧化概念
一切生命活动都需要能量，维持生命活动的能量主要有两个来源：
光能（太阳能）：
绿色植物和光合细菌等自养生物通过光合作用将光能有机物中稳定的化学能。
化学能：
动物和某些微生物等异养生物或光合组织通过生物氧化作用将有机物质氧化分解，使储存的稳定的化学能转变成ATP中活跃的化学能，ATP直接用于需要能量的各种生命活动。
一．生物氧化概念
（一）生物氧化的定义
生物细胞将有机化合物（糖、脂、蛋白质等）氧化分解，最终生成CO2和水并释放出能量的过程称为生物氧化（biologicaloxidation）
生物氧化又称为细胞氧化或细胞呼吸。
（二）生物氧化的特点
生物氧化发生在细胞内的氧化还原反应，因而具有氧化还原反应的共同特征。
（1）共同点
1.化学本质相同，都是得失电子的反应，如脱氧、加氢、传出电子等。
2.物质被氧化时总伴随着能量的释放，并且总值相等。
（2）不同点
1.生物氧化是酶促反应，反应条件温和；而体外燃烧则是剧烈的游离基反应，需要在高温高压及干燥的条件下进行。
2.生物氧化是在一系列酶、辅酶和中间传递体的作用下逐步进行的。
3.氧化反应分阶段进行，能量逐步释放；体外燃烧能量是爆发式释放出来的。
4.生物氧化释放的能量有相当多的转换成ATP中活跃的化学能，用于各种生命活动；体外燃烧产生的能量则转换成光和热，散发在环境中。
（三）生物氧化中CO2和H2O的生成
1.CO2的生成
直接脱羧：
丙酮酸脱羧酶，酪氨酸脱羧酶
氧化脱羧：
丙酮酸脱氢酶复合物
2.H2O的生成
代谢底物脱下的氢和氧结合而成。
主要是在包括脱氢酶、传递体和氧化酶组成的生物氧化体系催化下生成的。
二.生物化学反应的自由能
（一）自由能
一切生命活动都需要能量，而生物体在生命活动过程中所需的能量都来自体内生物化学反应释放的自由能。
自由能（freewenergy）:
在恒温恒压下，生物体用来对环境做功的那部分能量。
用符号G表示，单位为kJ/mol
Gibbs在热力学第一定律和第二定律的基础上，推出了在恒温恒压下体系自由能的公式：
△G=△H-T△S（式中△G表示体内自由能的变化，△H表示总体系焓变、总热能变化，△S表示总体熵变化）可以用自由能的变化△G判断一个在恒温恒压下进行的化学反应的方向：
△G＜0时，体系未达到平衡，反应可自发正向进行
△G＞0时，体系未达到平衡，必须提供能量反应才能正向进行
△=0时，反应处于平衡状态
（二）标准自由能变化
在25℃、0.1MP、ph=0;反应物浓度为1mol/L时，反应体系自由能变化称为标准自由能变化，用△G°表示；因为生物体内的ph接近7，所以在ph=7和上述条件下，标准自由能变化用△G°’表示。
△G°’=-2.303RTlgk’
如果已知一个生物反应的平衡常数，就用上式计算其标准自由能变化，自由△G=△G°’+2.303RTlgB/A计算出△G，经而判断该反应能否自发进行。
（三）氧化还原电位
在氧化还原反应中，自由能变化与反应物提供电子或得到电子的趋势成比例。
这种趋势用数字来表示，称为氧化还原电位。
用E表示。
在25℃、ph=0,压力为0.1MP和所有反应物、产物浓度为1mol/L的半反应的电极电位能为标准氧化还原电位用△E°表示，△E°’=标准氧化电极电位-标准还原电极电位。
△E°’越小，电负性越大，供出电子的倾向越大，即还原能力越强
△E°’越大，电正性越大，得到电子的倾向越大，即氧化能力越强
因而电子总是较低的△E°’向较高的△E°’流动。
（四）氧化还原电位与自由能的关系
标准自由能变化△G°’与标准氧化还原电位变化△E°’之间存在下列关系：
△G°’=-nF△E°’
式中：
n为转移电子数，F为法拉第常数（96.403KJ/Vmol）
根据上面公式即可根据△E°’计算出△G°’
三.高能磷酸化合物
（一）概念：
1.高能化合物
在标准条件下发生水解时，可释放出大量自由能的化合物
2.高能磷酸化合物
分子中含磷酸基团，他被水解时释放出大量的自由能，这类高能化合物。
3。
高能键
在高能化合物分子中，被水解断裂时释放出大量自由能的活波共价键。
用∽表示
（二）高能化合物的类型
根据分子结构和高能键的特征，高能化合物可分为以下几种
1.（O∽P）型
（1）焦磷酸化合物：
如ATP
（2）酰基磷酸化合物：
如1，3-二磷酸甘油酸
（3）烯醇式磷酸化合物：
如磷酸烯醇式丙酮酸
2.（N∽P）
（4）胍基磷酸化合物：
磷酸肌酸
3.（C∽S）型
（5）硫酸化合物：
如乙酰辅酶
（6）甲硫键化合物：
如S-腺苷甲硫氨酸
（三）最重要的高能磷酸化合物—ATP在能量转换中的作用
1.ATP为生物体内的“能量货币”，它是生命活动最重要的能量供应体。
原因：
（1）与结构特点有关：
他的两个磷酸酐键很不稳定，水解时放出大量的自由能。
（2）是生物细胞内能量代谢的偶联剂。
生物细胞放能和吸能反应往往要通过ADP和ATP的相互转变而偶联起来。
2.ATP作为磷酸基团能够反应的中间载体
磷酸基团转移势能：
反映磷酸化合物中磷酸基团释放的势力学趋势，在数值上等于其水解反应的-△G°’。
在磷酸基团转移反应中，磷酸基团从转移势能高的供体转移到势能较低的受体分子。
ATP的磷酸基团转移势能处于中间位置，所以它充当磷酸基团转移反应的中间载体。
见图：
在生物体内ATP处于不断消耗和不断补充的动态平衡之中。
在一般组织中，ADP消耗过程的加速必然导致ATP合成的加速。
但在动物肌肉、脑和神经等易兴奋的组织中，当发生快速反应时对高能磷酸化合物的立即需要大于ATP的合成能力。
为了维持这些组织的快速反应和ATP的动态平衡，有一种便于利用的高能磷酸贮能物质。
这种以高能磷酸形式贮能的物质？
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包括磷酸肌酸、磷酸精氨酸等。
磷酸肌酸存在于肌肉、脑和神经组织中，它可与ATP相互转化。
§6-2（呼吸链）电子传递链
线粒体的结构：
线粒体在结构上的突出特征是有两层膜
外膜平滑，透性高，仅有少量酶结合其上
内膜形成许多向内折叠的嵴，嵴上有一层球形颗粒。
内膜是能量转换的重要部位，电子传递链和氧化磷酸化有关的组织都存在于此。
线粒体的内膜充满版流动的基质，其中包含有大量的酶类以及线粒体DNA和线粒体。
这些酶类包括三羧酸循环酶类、氨基酸分解代谢
一.电子传递链的概念：
电子传递链是一系列电子载体对电子亲和力逐渐升高的顺序组成的电子传递系统，所有组成成分都嵌合于线粒体内膜。
1.黄素蛋白
黄素蛋白是指以黄素核苷酸为辅基的酶。
分别以FAD和FMN作为辅基。
黄素蛋白分布在线粒体的内膜上，是一个双电子传递体。
氧化性黄素蛋白从NADH接受两个电子和一个质子。
或从底物接受两个电子和两个原子而还原。
2.铁硫蛋白
铁硫蛋白是含铁硫络合物的蛋白质，又称外血红素铁蛋白。
该络合物中是铁硫一般以等摩尔存在，通常构成铁硫中心Fe2S2和Fe4S4，常用“Fe-S”表示。
铁硫中心通过Fe与半胱氨酸残基连接。
铁硫中心只有一个Fe起氧化还原反应，在氧化型和还原型之间转变。
铁流蛋白在呼吸链中不传递氢，作为单电子传递体。
呼吸链中的铁硫蛋白通常与其他的电子传递体的蛋白质结合成复合物，从而具有不同的氧化还原电位，在呼吸链的不同部位传递电子。
3.细胞色素（cytochrome）
细胞色素是以铁吥啉为辅机的蛋白质，因为有颜色，又广泛存在于生物细胞中，故称为细胞色素。
细胞色素通过辅机中的铁离子价的可逆变化进行电子传递。
它在呼吸链中作为单电子传递体。
根据还原型细胞色素的吸收光谱的吸收峰位置不同，将细胞色素分为a、b、c三类，每一类又有不同的亚基。
高等动物线粒体电子传递链中至少有5种细胞色素：
b、c1、c、a、a3
三.电子传递链组分在线粒体内膜上的分布
电子传递链的各个部分都分布在线粒体内膜上，而且在膜上有着特定的不对称分布。
有一些组分常结合在一起，形成复合物嵌在膜内。
有4个复合物：
1.复合物Ⅰ（NADH脱氢酶）
相对分子质量约700000—900000，含有25种不同的蛋白质，包括以FMN为辅机的黄素蛋白和多种铁硫蛋白。
高分辨率电镜下，复合物Ⅰ呈L形，其中L的一个臂位于膜中，另一个臂伸展到基质中。
催化电子从NADH到泛醌：
即催化一个氢离子从NADH-FMN-2Fe-S-UQ,形成UQH2.每对电子的传递也驱使4个质子从基质中泵到膜间质。
2.复合物Ⅱ（琥珀酸脱氢酶）
相对分子质量约140000，含有4-5种不同的蛋白质，包括以FAD为辅机的黄素蛋白和铁流蛋白。
催化电子从琥珀酸--FAD--2Fe-S—UQ,形成UQA2。
3.复合物Ⅲ（细胞色素bc1复合体）
相对分子质量约250000，含有9-10种不同的蛋白质，包括细胞色素b、c1和铁硫蛋白。
催化电子从还原型泛醌到细胞色素c.
电子和质子的传递过程经过Q循环进行的：
Q循环由两个半循环组成：
第一个半循环中，在内膜的P侧1个UQH2上的2个电子“兵分两路”：
1个电子经Fe-S-Cy+/-c1—cy+/-c,同时将两个质子释放到膜间隙；
另一个电子经Cy+/-bc--Cy+/-Bh-uq—UQ-
第二个循环中，
4．复合物IV（细胞色素氧化酶）
相对分子质量均为160000~170000，至少含有13种不同的蛋白质，包括细胞色素aa3和含铜蛋白。
催化电子从还原细胞色素C~CuA种a~Cyta~Cyta3（Fe）~Cub中c~分子氧
与此同时，另外四个之子从基质中泵出到膜间隙。
四．电子传递链的排列顺序
呼吸链种的电子传递链有着严格的方向和顺序，即电子从氧化还原电位较低的传递体依次通过氧化还原电位较高的传递体逐步流向氧分子。
这些成员不可缺少，其顺序不可颠倒。
两条呼吸链：
NADH呼吸链：
1~3~4
FADH2呼吸链：
2~3~4
UQH2桌为一种可以动的电子和质子载体，将电子从复合物1或复合物2传递个复合物3，复合物3再将电子传递给另一种可移动的连接分子Cytc。
然后复合物4将电子从还原细胞色素C传递到氧分子。
电子流经复合物1~3~4的时候还伴随着从基质到膜间质的之子流动。
五．呼吸链的电子传递抑制剂
能够阻断呼吸链种某一特定部位电子传递的物质成为电子传递抑制剂。
常见的呼吸链的电子传递抑制剂及其作用部位：
1．鱼藤酮
是一种极青的植物色素，常用作杀虫剂。
它能抑制复合物1.阻断电子从NADH向UQ德传递。
与鱼藤酮作用微点相同的抑制剂还有赤妥和杀粉蝶菌素A。
2．抗霉素A
是一种抗菌素，抑制复合物3的电子传递链。
3．氰化物、叠氰化物、一氧化碳和硫化氢
他们都含有孤对电子，一直复合物4，阻断电子从到的电子传递。
6-3氧化磷酸化
糖、脂肪和蛋白质是大多数生物赖以生存的主要能源物质，这些物质在生物氧化过程中会释放出大量的自由能，这些自由能会使ADP磷酸化为ATP。
府物水平林孙华：
通过府物质化形成的高能磷酸化合物直接将磷酸集团转移给ADP，使之形成ATP。
氧化磷酸化：
电子从NADH或FADH2经电子传递链转移到分子氧形成水，同时偶联ADP磷酸化生成ATP。
氧化磷酸化的过程需要氧气作为最终的电子受体，它是需要氧生物合成ATP的主要途径。
在光合作用过程中也能形成ATP，这种ADP的磷酸化方式叫光和磷酸化。
使ADP磷酸化为ATP的能量是光能。
通过计算可以看出电子从NADH传递到O2是方能反应：
合成ATP的反应是吸能反应：
如何将上述的放能反应与ATP合成的吸能反映偶连起来？
氧化磷酸化的机理。
二、氧化磷酸化的机理
呼吸链中的电子传递链是如何推动ADP磷酸化形成ATP的？
目前比较著名的假设有三个：
化学偶联假说
构想偶联假说
化学渗透假说
其中得到公认的是化学渗透假说。
<一>化学渗透学说
化学渗透学说是1961奶奶由英国生化学家P.Mitchelltichude.
1、呼吸链中的电子传递体在线立体内膜上有着特定的不对称分布，传氢体和电子传递体交替排列的，催化反应是定向；
2、再电子传递过程中，复合物1、3、4中的传氢体其质子泵的作用，将H从基质泵向内膜外侧，而将电子传给其后的电子传递体；
3、内膜对之子不具有通行，泵到内膜外侧的H不能自由返回，这样在内膜倒形成之子浓度梯度，这就是推动ATP合成的原动力；
4、当存在足够高的跨膜之子电化学提都市，强大的质子流通过F1~F0~ATPase进入机制时，释放的自由能推动ATP合成。
<二>F1~F0~ATPase复合物
是由两个主要部位分F1和F0组成，如图所示。
1、F1是她的球形头部，深入线粒体基质，由五种亚基组成，是ATP合成酶的催化部分。
2、F0横贯线粒体内膜，含有之子通道，由十多种亚基组成。
F0中的O代表队寡霉素敏感，寡霉素是一种抗生素，它可合在通道中，防止质子的进入，因此可抑制ATP的合成。
<三>ATP合酶的旋转催化模型
是由美国人PadBoyer提出的，后又经JohnWalker正式。
为此而人或得1997年诺贝尔化学奖。
“选注催化”模型认为认为，ATP和美的头部构成3个催化部位。
在任一给定时间，每一部位处于不同的构象。
一个处于–ATP构象（与ATP紧密结合，T）
一个处于–ADP构象（与ADP松散集合，L）
一个处于–缺（无松散结合，O）
当质子推动力驱使H经Fo质子通道进入时，引起中轴r亚基旋转，大约角旋转120度，r亚基就会与一个不同的亚基相碰撞。
结果，使处于T态（—ATP构象）的催化部位释放ATP变为O态（—），同时L态（—ADP）催化部位上生成ATP变为T态（-ATP）,O态（-）结合ADP+Pi变为L态（—ATP）。
见幻灯片。
〈四〉：
测定P/O比
从上面分子可以知道，质子流是推动ATP合成的原动力，那么由转移的质子数可以计算出NADH2经呼吸链所产生的ATP。
经实验测定，合成一分子ATP大约需要3个H经ATP合酶进入基质，所以NADH的氧化可产生约3个ATP，而琥珀的氧化可产生约2个ATPA。
换句话说，每消耗一个氧原子可以合成3个或2个ATP，常用P/O比来表示磷酸的ADP分子数与还原的氧原子数之比。
NADH氧化的P/O=3，而FADH2氧化的P/O=2。
〈五〉：
腺苷酸的转运
细胞内的ATP是需在线粒体内由ADP磷酸化而生成，大部分ATP是在线粒体外被利用后又转变为ADP。
由于ADP和ATP都不能自由地穿过线粒体内膜，所以必须有一种机制能将线粒体外的ADP运入，同时把线粒体内的ATP运出。
实验已经证明，在线粒体内膜上有一种腺苷酸载体负责双向转运。
这是一种有高度选择性的传递蛋白，以聚体的形成嵌入内膜，在跨膜电位（外正，内负）的推动下，把ADP运入基质，同时把ATP运到膜外侧。
见片。
三．氧化磷酸化的解偶联和抑制
一般正常情况下，电子传递和磷酸化是紧密结合的。
但为了证明氧化磷酸化的中间步骤，用特殊的试剂将氧化磷酸化过程分解成单个的反应。
根据这些试剂的作用方式，把它们分为3类：
1．解偶联剂
作用是使电子传递和ADP磷酸化两个过程分离，它只抑制ATP形成过程，而不抑制电子传递过程。
常见的解偶联剂有：
2，4—二硝机基苯酚（DNP）
在酸性环境中，DNP变为脂溶性的外解离形式，可以结合质子跨过线粒体内膜进入基质，破坏了电子传递产生的质子电化学梯度，使得驱动ATP合成的动力消失，抑制ATP的形成。
2.氧化磷酸化抑制剂
这类试剂既抑制氧化吸收利用，又抑制ATP的形成。
常见的氧化磷酸化抑制剂有
寡霉素，作用于ATP合酶的Fo部分，防止质子的进入，从而抑制ATP的合成。
3.离子载体抑制剂
这是一类脂溶性物质，它们能插入线粒体内膜的脂质双分子层，能与H以外的其他一个个阴离子结合，并作为它们的载体使它们能够穿过膜，从而破坏了膜两侧的电位梯度，最终破坏了氧化磷酸化过程。
如缬氨霉素结合K，短杆菌肽可结合K、Na等。
四．线粒体穿棱系统
生物氧化和氧化磷酸化是需在线粒体内进行，NAD+或NADH却不能自由透过线粒体内膜，因此在细胞液中生成的NADH（如糖酵解产生的NADH）必须通过特殊的穿棱机制进入线粒体。
动物细胞内存在着两个穿棱系统：
1：
甘油—3—磷酸穿棱系统2：
苹果酸穿棱系统
1：
甘油—3—磷酸穿棱系统
主要存在于肌细胞中，特别是昆虫飞行肌中这一穿棱系统占优势，能维持很高速度的氧化磷酸化。
甘油—3—磷酸穿棱系统涉及两个酶，一个是细胞液中的甘油—3—磷酸脱氢酶，以NAD+为辅酶。
另一个是与内膜结合的甘油—3—磷酸脱氢酶，以FAD为辅基。
在细胞液中的甘油—3—磷酸脱氢酶催化下，NADH使磷酸二羟丙酮还原生成甘油—3—磷酸，甘油—3—磷酸扩散至线粒体外膜与内膜之间，然后再内膜结合的甘油—3—磷酸脱氢酶的催化下，转换回磷酸二羟丙酮，将脱下的H转移到内膜中的FAD上生成FADH2。
经过电子传递链进行氧化。
P/O比为2.由此可看出，细胞液中的NADH通过这一途径转换后产生的ATP为2，比线粒体内NADH氧化的能量（3ATP）少。
2;苹果酸穿棱系统
主要存在于肝细胞中，特别是在哺乳动物的肝细胞中存在着活跃的这一系统。
苹果酸穿棱系统涉及两种苹果酸脱氢酶（一个在细胞液中，一个在线粒体基质中）。
两种谷草转氨酶（一个在细胞液中，一个在线粒体基质中）。
和一系列专一的透性酶。
首先，在细胞液苹果酸脱氢酶催化下，NADH将草酰乙酸还原成苹果酸，然后经苹果酸--酮戊二酸载体进入线粒体基质中，在线粒体基质苹果酸脱氢酶催化下，苹果酸重新氧化为草酰乙酸，同时线粒体内的NAD+还原为NADH,经电子传递链进行氧化。
P/O比为3.生成的草酰乙酸必须被运回细胞液中，所以在基质谷草转氨酶催化下，草酰乙酸与谷氨酸反应生成天冬氨酸和–酮戊二酸，天冬氨酸和–酮戊二酸经两种不同的载体转运至细胞液中，再由细胞液谷草转氨酶催化下，生成草酰乙酸和谷氨酸。
谷氨酸又重新进入线粒体，而草酰乙酸又参与下一轮穿棱运输。
五．能荷
生物体不断合成ATP，也不断消耗利用ATP。
在细胞中存在着三种腺苷酸，即ATP、ADP和AMP,它们在某一时间的相对数量控制着细胞的代谢活动。
为了从量上表示细胞内ATP、ADP、AMP的存在状况，Atkinson（1968）提出了能荷的概念。
能荷是指在总的腺苷酸系统中（即ATP、ADP和AMP浓度之和）所负荷的离能磷酸基数量。
用下式表示：
能荷=[ATP]+0.5[ADP]/[ATP]+[ADP]+[AMP]
能荷的大小决定于ATP和ADP的多少。
当细胞内全部腺苷酸均以ATP形式存在时，能荷最大值为1；则全以ADP存在时能荷为0.5；以AMP存在时能荷为0。
在某些条件下，能荷值可以作为细胞产能和需能代谢过程向别构调节的信号。
即能荷的大小决定ＡＴＰ和ＡＤＰ的多少。
当细胞内全部腺苷酸均以ＡＴＰ形成存在时，能荷最大，能荷值为１.0；全以AMP存在时，能荷值为0；全以ADP形式存在时，能荷值为0.5；三者并存时，能荷随三者含量的比例而变化。
范围为1.0~0.
大多数细胞的稳态能荷状态在0.8~0.95之间。
ATP生成和消耗的途径与细胞内的能荷状态相呼应：
高能荷时，ATP生成过程被抑制，而ATP得利用过程被激发；低能荷时，其效应相反。
所以说，能荷对代谢起着重要的调控作用。
6—4其他末端氧化酶系统
前面我们介绍的是线粒体氧化系统，即通过线粒体细胞系统进行氧化的体系，是一切动物、植物、微生物的主要氧化途径，它与ATP的生成紧密相关。
除此之外，生物体内还存在外线粒体氧化系统，其特点是从底物脱氢到H2O的生产时经过其他末端氧化酶完成的，与ATP的生产无关，但各自具有重要的生理功能。
一．多酚氢化酶系统
存在于微粒体中，是含Cu的末端氧化酶、由脱氢酶、醌还原酶、酚氧化酶组成。
催化多酚类（对苯二酚、邻苯二酚、邻苯三酚）的氧化，作用如下：
在植物体内普遍存在。
二．抗坏血酸氧化酶系统
是一种含铜的氧化酶，广泛存在于植物中。
在又氧的条件下，催化抗坏血酸的氧化，反应如下：
抗坏血酸+1/2O2——脱氢抗坏血酸+H2O
抗环血酸氧化酶系统，可以防止含硫的氧化，延缓衰老进程。
三．黄素蛋白氢化酶系统
存在于微粒体中，其催化特点是不需要经过细胞色素等传递体，将脱下的氢直接交给O2生成H2O2.
四．超氧化物歧化酶系统
清除细胞内的活性氧。
活性氧是细胞内产生的会对蛋白质、膜质等生物大分子进行攻击，严重时会导致代谢紊乱和疾病。
是由超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）组成。
超氧化物歧化酶有三种形式：
Cu、Zn-SOD（存在于高等植物的叶绿体和细胞质中）
Mn-SOD（真核生物线粒体中）Fe-SOD（细菌中），它们在清除活性氧时生成H2O2.而H2O2由过氧化氢酶催化形成H2O和O2.
五．植物抗氰氢化酶系统
是一种非血红素铁蛋白，它不受氰化物的抑制。
抗氰呼吸途径的电子传递是在正常呼吸链中，电子从Cytb分出来，通过抗氰氢化酶直接传递到氢：
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