HLA.docx

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【摘要】克隆表达可生物素化的HLA-A*0201的重链胞外区是制备HLA-A*0201-肽四聚体的先决条件。

本研究构建重组HLA-A*0201-BSP融合基因的表达载体，以制备HLA-A2四聚体。

根据已报道的序列设计特异引物，利用逆转录聚合酶链反应方法从已鉴定为HLA-A*0201基因型的健康人白细胞中克隆HLA-A*0201重链胞外区的基因，拼接上依赖生物素-蛋白连接酶的可生物素化序列，构建HLA-A*0201-BSP的原核表达载体，在大肠杆菌DH5α中进行表达。

结果表明：

成功扩增出HLA-A*0201-BSP融合基因并测序证实，构建的pBV220-HLA-A*0201-BSP可在大肠杆菌DH5α中高效表达HLA-A*0201-BSP融合蛋白，表达量占菌体总蛋白的28%，以包涵体的形式表达，经洗涤、变性后，以SepharcylS-300HR柱层析纯化，纯度可达90%以上。

结论：

获得了高效表达HLA-A*0201-BSP的大肠杆菌工程菌株，建立了简便有效的包涵体纯化方法，为制备HLA-A*0201-肽四聚体奠定了基础。

【关键词】HLA-A*0201；HLA-A*0201-BSP融合基因；HLA-A2四聚体；可生物素化序列

　　CloningandExpressionofHLA-A*0201-BSP

　　AbstractHigh-yieldproductionofHLA-A*0201heavychainisaprerequisitetothepreparationofHLA-A2tetramer.ThepresentstudywasaimedtoconstructtheexpressionvectorofrecombinantHLA-A*0201-BSPfusiongeneforpreparingHLA-A2tetramers.TheextracellularregionHLA*0201wasclonedbyRT-PCRfromHLA-A2+donor,anda15-aminoacidbiotin-proteinligase（BirA）substratepeptide（BSP）forBirA-dependentbiotinylationwasaddedtotheCOOH-terminusofHLA-A*0201heavychain.ThenthefusiongenewasclonedintopBV220vectoratEcoRⅠandBamHⅠsitesanditssequencewasconfirmedbyDNAsequenceanalysis.TherecombinantplasmidpBV220-HLA-A*0201-BSPwastransformedtothecompetentcellsof　DH5α.TheresultsshowedthattheHLA-A*0201-BSPfusionproteinwassuccessfullyexpressedintheformofinclusionbodyandamountedtoover28%oftotalcellproteinsviainductionat42℃.AfterwashedwithtritonX-100andurea,theinclusionbodywasdissolvedwith8mol/LureaandthenpurifiedwithSepharcylS-300HR,andthefinalpurityreachedabove90%.ItisconcludedthattheHLA-A*0201-BSPfusiongenewasclonedsuccessfullyandexpressedefficientlyin　DH5α.ThisworkestablishesaconvenientapproachforpurificationoflargequantityofrecombinantHLA-A*0201-BSP.ThisprovidesthebasisforthepreparationofHLA-A2tetramers.

　　KeywordsHLA-A*0201;HLA-A*0201-BSPfusiongene;HLA-A2tetramers;BirAsubstratepeptide

　　主要组织相容性复合体-Ⅰ类分子分布在所有有核细胞的表面，其作用是将细胞内经过加工的抗原肽呈递到细胞表面，并充当T细胞受体识别抗原肽的限制性分子。

在抗原呈递细胞表面的MHC-Ⅰ类分子与抗原肽组成的复合物被TCR识别后，抗原特异性CD8+T细胞在共刺激分子的辅助作用下被激活，发生细胞增殖并分泌细胞因子，进而在机体抗肿瘤、抗感染及抗移植物等免疫反应中发挥重要作用。

1996年，Altman等［1］首创的

　　MHC-肽四聚体技术正是基于对这一体内识别过程的体外模拟，获得了对抗原特异性CD8+T细胞的精确定量，成为定量检测抗原特异性T细胞的金标准。

本研究应用基因工程技术，在成功克隆了HLA-A*0201重链胞外区基因后，将依赖生物素-蛋白连接酶的可生物素化序列连接到其胞外区末端，构建成融合表达载体，在大肠杆菌DH5α中获得了高效表达，并对获得的融合蛋白进行了纯化，为进一步制备抗原特异性的HLA-A*0201四聚体奠定了基础。

　　材料和方法

　　材料

　　大肠杆菌DH5α和质粒pBV220均为军事医学科学院基础医学研究所基因工程研究室保存。

TRIZOL试剂、RT-PCR试剂、限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ、T4DNA连接酶、DNA凝胶回收试剂盒、质粒小量快速提取试剂盒购自Promega公司。

淋巴细胞分离液购自GibcoBRL公司。

SephacrylS-300HR胶为Pharmacia公司产品。

尿素、二硫苏糖醇等为进口或国产分析纯试剂。

　　方法

　　HLA-A*0201基因型健康人白细胞总RNA抽提及cDNA合成取HLA配型检查鉴定为HLA-A*0201基因型的健康成年志愿者肝素抗凝静脉血2ml，按常规方法以淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，以TRIZOL试剂提取总RNA，直接进行逆转录反应。

反应体积为20μl。

首先在6μlDEPC水中加入2μg总RNA，10μmol/LOligo1μl，在70℃变性5分钟后置冰浴。

再加入5×反应缓冲液4μl，mmol/LdNTP混合物2μl，RNasin40U，及AMV逆转录酶10U，42℃反应1小时后，于85℃温育5分钟终止反应，合成的cDNA即可用于PCR扩增或存-20℃。

RNA完整性以1%琼脂糖凝胶电泳及扩增管家基因GAPDH进行验证。

　　HLA-A*0201重链胞外区基因的PCR扩增根据IMGT/HLA数据库中的HLA-A*020101的cDNA序列设计引物。

上游引物P1为：

5‘-GCGAATTCATGGGCTCTCACTCCATGAGGTATTTC-3‘，含起始密码子，EcoRⅠ识别位点。

下游引物P2为：

5‘-TGAGGGGCTTGGGCAAACC-3‘。

引物由上海博亚生物技术有限公司合成。

该对引物扩增出的片段为HLA-A*020101重链胞外区基因1-811碱基序列。

PCR反应在20μl体积中进行，以μlcDNA第一链为模板，反应条件为在94℃变性5分钟，然后94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸40秒，共进行32次循环后，于72℃延伸7分钟。

获得的PCR产物称为A2‘。

　　融合BSP序列的HLA-A*0201重链胞外区基因的重叠延伸PCR扩增为在HLA-A*020101重链胞外区羧基端连接可生物素化序列，设计的引物P35‘-CGGGATCCTTAACGATGATTCCACACCATTTTCTGTGCATCCAGAATATGATGCAGAGAGCCCGGCTCCCATCTCAGGGTGAGGGGCTTGGGCAAACC-3‘，其中包含HLA-A*020101重链胞外区基因812-828碱基、编码Gly-Ser接头和BSP的DAN序列，以及终止密码子、BamHⅠ识别位点。

重叠延伸PCR反应在20μl体积中进行，以μl上述获得的PCR产物A2‘为模板，仅加入1μl引物P3，在94℃变性5分钟，然后94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸40秒，共进行8次循环；之后，在上述反应体系中加入引物P1，在94℃变性3分钟，然后94℃变性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸40秒，共进行25次循环；再于72℃延伸7分钟。

获得的PCR产物即为HLA-A*0201-BSP融合基因片段。

　　HLA-A*0201-BSP融合表达载体的构建及测序鉴定质粒提取、酶切、连接、转化和鉴定等，均按Sambrook实验手册［2］进行。

将扩增的HLA-A*0201-BSP融合基因片段回收后，以EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，与经相应酶切后的质粒pBV220连接，转化DH5α感受态细胞，涂板，挑克隆及小量扩增后，以碱裂解法提取质粒，双酶切法筛选接入HLA-A*0201-BSP融合基因的转化子，提交上海博亚生物技术有限公司进行测序。

　　HLA-A*0201-BSP在中的表达、包涵体洗涤、溶解和纯化将含阳性重组质粒的DH5α接种于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，30℃培养过夜，然后以1%的比例转接，30℃培养至OD600值为时，转入42℃水浴摇床中诱导4小时，离心收集菌体，以20mmol/LTris-HCl重悬，在冰浴中以超声波破碎菌体，离心后分别收集上清和沉淀，其中沉淀部分以20mmol/LTris-HCl洗涤2次，以2mol/L尿素洗涤1次，再以8mol/L尿素变性溶解，以S-300为柱填料，对溶解上清液进行凝胶过滤层析，洗脱液为20mmol/LTris-HCl，上样体积为柱体积的2%，流速控制为毫升/分钟，用自动收集器分管收集洗脱液，以十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定各管组份。

　　SDS-PAGE浓缩胶浓度为5%，分离胶浓度为15%，以考马斯亮蓝R250染色显示蛋白条带。

　　结果

　　HLA-A*0201-BSP融合基因的PCR扩增

　　根据IMGT/HLA数据库中的HLA-A*020101的cDNA序列设计引物P1、P2，以HLA-A*0201基因型的健康人白细胞总RNA逆转录第一链cDNA为模板进行PCR反应，扩增出一条与预计大小相符的DNA片段。

该DNA片段为HLA-A*020101重链胞外区基因1-811碱基序列。

　　又以上述获得的PCR产物A2‘为模板，以引物P1、P3经重叠延伸PCR扩增出1条与预计大小相符的DNA片段。

该DNA片段可编码HLA-A*020101重链胞外区1-276氨基酸和BSP，并编码两者间的Gly-Ser接头。

　　HLA-A*0201-BSP融合表达载体的构建及鉴定

　　经PCR扩增出的长度为901bp的DNA片段经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，与同样酶切的pBV220连接，转化DH5α，筛选接入目的基因的阳性克隆，经测序证实插入序列为含起始密码ATG，且正确编码HLA-A*020101重链胞外区1-276氨基酸和BSP的基因，与IMGT/HLA数据库中公布的HLA-A*020101序列、Altman等［1］报道的BSP序列完全一致。

构建的表达载体称pBV220-HLA-A*0201-BSP。

　　HLA-A*0201-BSP在中的表达和纯化

　　将构建的pBV220-HLA-A*0201-BSP质粒转化DH5α，得到含重组质粒的基因工程菌。

DH5α表达的HLA-A*0201-BSP的SDS-PAGE图见图4。

SDS-PAGE分析表明，该工程菌在未诱导前无外源蛋白表达，经42℃热诱导4小时后，可表达相对分子量约34kD的外源蛋白，该外源蛋白分子量与预期理论值一致，经薄层灰度扫描分析，外源蛋白的表达量占菌体总蛋白的28%。

而转入pBV220空载体的DH5α在相同分子量部位无明显蛋白条带。

菌体经破碎后分为上清和沉淀，可见重组蛋白以包涵体形式存在于沉淀部分。

沉淀部分经洗涤、尿素溶解后，进行S-300柱层析纯化，目的蛋白纯度可达90%以上，平均收率为106%。

　　讨论

　　MHC-Ⅰ类分子是由具有高度多肽性的重链和保守的轻链,即β2-微球蛋白组成的异源二聚体。

在抗原呈递细胞内合成的抗原短肽，即结合于由MHC-Ⅰ类分子重链的α1和α2结构域构成的肽结合槽内，而β2-微球蛋白与重链的α3结构域的非共价结合使MHC-Ⅰ类分子-肽复合物更加稳定，最终定位于细胞表面，并通过与抗原特异性的CD8+T细胞表面的TCR相互作用使之激活，进而杀伤靶细胞。

如果在体外制备MHC-肽复合物，模拟APC/特异性靶细胞表面MHC呈递的多肽复合物，通过与体内T细胞的TCR特异性结合，就可达到直接检测抗原特异性T细胞的目的。

但可溶性的MHC-肽复合物单体与TCR结合的亲和力很低、解离速度快。

MHC-肽四聚体技术则克服了这一难题，其精巧之处在于利用基因工程技术获得MHC-Ⅰ类分子重链时，在其羧基端融合1段由15个氨基酸组成的BirA酶依赖的可生物素化序列，从而可以利用BirA酶在BSP序列内的赖氨酸残基上接一个生物素分子［3］。

在此融合蛋白与β2m、抗原肽折叠成可溶性MHC-肽单体分子后，即可对其生物素化。

利用1分子链亲和素可结合4分子生物素的性质，进一步与荧光标记的链亲和素结合，便可获得均一的四聚体。

结合流式细胞术，即可用于抗原特异性T细胞的定性和定量分析［4,5］。

为制备HLA-A*0201-肽四聚体，首先需克隆表达可生物素化的HLA-A*0201的重链胞外区。

之所以选择HLA-A*0201，是因为汉族群体中此基因频率在Ⅰ类分子中最高，超过30%的个体表达此分子［6］。

目前对MHC-肽单体的生物素化主要采取BirA酶对可识别序列的生物素化和化学试剂生物素化两种模式［7］。

本研究亦采取了在HLA-A*0201的重链胞外区羧基端融合BSP序列的策略来实现生物素化目的。

在进一步的实验中，我们又探索了对HLA-A*0201的重链胞外区实施化学试剂生物素化的模式，也获成功。

选择合适的载体-宿主系统是外源基因在原核体系内高效表达的关键之一。

本研究选用了含有PRPL启动子的表达载体pBV220构建融合表达载体pBV220-HLA-A*0201-BSP，主要是考虑该载体为温控型表达载体，相对于需使用异丙基硫代-β-D半乳糖苷进行诱导的表达载体而言，其诱导方法简便、成本低廉，且目的蛋白表达稳定。

这对于制备大量纯化的目的蛋白以构建HLA-A*0201-肽四聚体无疑是具有相当优势的。

在转化至pBV220最适宿主菌DH5α诱导后发现，目的蛋白主要存在于包涵体中，表达量约占菌体总蛋白的28%。

形成包涵体使目的蛋白免受胞内酶的降解作用，易于以高纯度和高浓度方式分离。

在获得HLA-A*0201-BSP包涵体后，经洗涤、尿素溶解，以S-300柱层析纯化，即可获得较高纯度的重组蛋白，方法简便，完全满足制备四聚体的需要。

因此，无需为了纯化方便而在HLA-A*0201-BSP的C端融合His6标签［8］，且末端引入外源氨基酸，从而可能对折叠形成HLA-肽复合物单体造成影响，使最终获得的四聚体特异性发生改变。

通过原核表达获得的HLA-A2重链分子本身无生物学活性，也不能单独在复性中获得正确的构象。

只有在β2-M、抗原肽均存在的前提下才能复性，并与之折叠形成正确的HLA-A2单体构象［9］。

本研究获得的纯化HLA-A*0201-BSP重组蛋白，纯度为90%，浓度达2mg/ml，可直接用于制备HLA-A2四叠体。

本研究成功克隆了HLA-A*0201的重链胞外区基因，构建的HLA-A*0201-BSP融合表达载体在大肠杆菌DH5α中可高效表达目的蛋白，为进一步制备抗原特异性的HLA-A*0201四聚体奠定了基础。

【参考文献】

　　1AltmanJD,MossPA,GoulderPJ,etal.Phenotypicanalysisofantigen-specificTlymphocytes.Science,1996；274（5284）:

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　　8钱丽,钱书兵,钱关祥.可生物素化HLA-A2-生物素化序列融合基因的构建与表达.上海免疫学杂志,2002；22:

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