04001非无菌产品微生物限度检查微生物计数法.docx
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04001非无菌产品微生物限度检查微生物计数法
1.简述
微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。
当本法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合相应的微生物限度标准时，应按下述规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。
除另有规定外，本法不适用于活菌制剂的检査。
微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。
检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。
如供试品有抗菌活性，应尽可能去除或中和。
供试品检査时，若使用了中和剂或灭活剂，应确认其有效性及对微生物无毒性。
供试液制备时如果使用了表面活性剂，应确认其对微生物无毒性以及与所使用中和剂或灭活剂的相容性。
2计数方法
计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（Most-Probable-NumberMethod,简称MPN法）。
MPN法用于微生物计数时精确度较差，但对于某些微生物污染量很小的供试品，MPN法可能是更适合的方法。
供试品检查时，应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。
所选方法的适用性须经确认。
2.1计数培养基适用性检査和供试品计数方法适用性试验
供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查。
供试品的微生物计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。
若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。
2.2菌种及菌液制备
2.2.1菌种
试验用菌株的传代次数不得超过5代（从菌种保藏中心获得的干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。
计数培养基适用性检查和计数方法适用性试验用菌株见表1。
2.2.2菌液制备
按表1规定程序培养各试验菌株。
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌的新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的菌悬液；取黑曲霉的新鲜培养物加人3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的pH7.0无菌氣化钠-蛋白胨缓冲液或0.9%无菌氯化钠溶液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。
菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。
黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃,在验证过的贮存期内使用。
2.2.3阴性对照
为确认试验条件是否符合要求，应进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。
如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。
2.2.4培养基适用性检査
微生物计数用的成品培养基、由脱水培养基或按处方配制的培养基均应进行培养基适用性检查。
按表1规定，接种不大于lOOcfu的菌液至胰酪大豆胨液体培养基管或胰酪大豆胨琼脂培养基平板或沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，置表1规定条件下培养。
每一试验菌株平行制备2管或2个平皿。
同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。
被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值应在0.5～2范围内，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；被检液体培养基管与对照培养基管比较，试验菌应生长良好。
2.2.5计数方法适用性试验
2.2.5.1供试液制备
根据供试品的理化特性与生物学特性，采取适宜的方法制备供试液。
供试液制备若需加温时，应均匀加热，且温度不应超过45℃。
供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。
常用的供试液制备方法如下。
如果下列供试液制备方法
经确认均不适用，应建立其他适宜的方法。
（1）水溶性供试品取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基溶解或稀释制成1:
10供试液。
若需要，调节供试液pH值至6～8。
必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。
水溶性液体制剂也可用混合的供试品原液作为供试液。
（2）水不溶性非油脂类供试品取供试品，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基制备成1:
10供试液。
分散力较差的供试品，可在稀释液中加人表面活性剂如0.1%的聚山梨酯80,使供试品分散均匀。
若需要，调节供试液pH值至6～8。
必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。
（3）油脂类供试品取供试品，加人无菌十四烷酸异丙酯使溶解，或与最少量并能使供试品乳化的无菌聚山梨酯80或其他无抑菌性的无菌表面活性剂充分混匀。
表面活性剂的温度一般不超过40℃：
（特殊情况下，最多不超过45℃），小心混合，若需要可在水浴中进行，然后加人预热的稀释液使成1:
10供试液，保温，混合，并在最短时间内形成乳状液。
必要时，用稀释液或含上述表面活性剂的稀释液进一步10倍系列稀释。
（4）需用特殊方法制备供试液的供试品
a、膜剂供试品
取供试品，剪碎，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，或pH7.2磷酸盐缓冲液，或胰酪大豆胨液体培养基，浸泡，振摇，制成1:
10的供试液。
若需要，调节供试液pH值至6～8。
必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。
b、肠溶及结肠溶制剂供试品
取供试品，加人pH6.8无菌磷酸盐缓冲液（用于肠溶制剂）或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（用于结肠溶制剂），置45℃水浴中，振摇，使溶解，制成1:
10的供试液。
必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。
c、气雾剂、喷雾剂供试品
取供试品，置一20℃或其他适宜温度冷冻约1小时，取出，迅速消毒供试品开启部位，用无菌钢锥在该部位钻一小孔，放至室温，并轻轻转动容器，使抛射剂缓缓全部释出。
供试品亦可采用其他适宜的方法取出。
用无菌注射器从每一容器中吸出药液于无菌容器中混合，然后取样检査。
d、贴膏剂供试品
取供试品，去掉防粘层，将粘贴面朝上放置在无菌玻璃或塑料器皿上，在粘贴面朝上覆盖一层适宜的无菌多孔材料（如无菌纱布），避免贴膏剂粘贴在一起。
将处理后的贴膏剂放入盛有适宜体积并含有表面活性剂（如聚山梨酯80或卵磷脂）稀释液的容器中，振荡至少30分钟。
必要时，用同一稀释液将供试液进一步10倍系列稀释。
2.2.5.2接种和稀释
按下列要求进行供试液的接种和稀释，制备微生物回收试验用供试液。
所加菌液的体积应不超过供试液体积的1%。
为确认供试品中的微生物能被充分检出，首先应选择最低稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。
（1）试验组取上述制备好的供试液，加入试验菌液，混匀，使每lml供试液或每张滤膜所滤过的供试液中含菌量不大于lOOcfu。
（2）供试品对照组取制备好的供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作。
（3）菌液对照组取不含中和剂及灭活剂的相应稀释液替代供试液，按试验组操作加人试验菌液并进行微生物回收试验。
若因供试品抗菌活性或溶解性较差的原因导致无法选择最低稀释级的供试液进行方法适用性试验时，应采用适宜的方法对供试%液进行进一步的处理。
如果供试品对微生物生长的抑制作用无法以其他方法消除，供试液可经过中和、稀释或薄膜过滤处理后再加人试验菌悬液进行方法适用性试验。
2.2.5.3抗菌活性的去除或灭活
供试液接种后，按下列“微生物回收”规定的方法进行微生物计数。
若试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值小于菌液对照组菌落数值的50%,可采用下述方法消除供试品的抑菌活性。
（1）增加稀释液或培养基体积。
（2）加人适宜的中和剂或灭活剂。
中和剂或灭活剂（表2）可用于消除干扰物的抑菌活性，最好在稀释液或培养基灭菌前加入。
若使用中和剂或灭活剂，试验中应设中和剂或灭活剂对照组，即取相应量稀释液替代供试品同试验组操作，以确认其有效性和对微生物无毒性。
中和剂或灭活剂对照组的菌落数与菌液对照级的菌落数的比值应在0.5～2范围内。
表2常见干扰物的中和剂或灭活剂
干扰物
可选用的中和剂或灭活方法
戊二醛、汞制剂
酚类、乙醇、醛类、吸附物
醛类
季铵化合物、对羟基苯甲酸、双胍类化合物
季铵化合物、碘、对羟基苯甲酸
水银
水银、汞化物、醛类
EDTA、喹喏酮类抗生素
磺胺类
β－内酰胺类抗生素
亚硫酸氢钠
稀释法
甘氨酸
卵磷脂
聚山梨酯
巯基醋酸盐
硫代硫酸盐
镁或钙离子
对氨基苯甲酸
β－内酰胺酶
（3）采用薄膜过滤法
（4）上述几种方法的联合使用
若没有适宜消除供试品抑菌活性的方法，对特定试验菌回收的失败，表明供试品对该试验菌具有较强抗菌活性，同时也表明供试品不易被该类微生物污染。
但是，供试品也可能仅对特定试验菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。
因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行计数方法适用性试验。
若方法适用性试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检査。
2.2.5.4供试品中微生物的回收
表1所列的计数方法适用性试验用的各试验菌应逐一进行微生物回收试验。
微生物的回收可采用平皿法、薄膜过滤法或MPN法。
（1）平皿法
平皿法包括倾注法和涂布法。
表1中每株试验菌每种培养基至少制备2个平皿，以算术均值作为计数结果。
倾注法取照上述“供试液的制备”“接种和稀释”和“抗菌活性的去除或灭活”制备的供试液lml，置直径90mm的无菌平皿中，注人15～20ml温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。
若使用直径较大的平皿，培养基的用量应相应增加。
按表1规定条件培养、计数。
同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。
计算各试验组的平均菌落数。
涂布法取15～20ml温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，注人直径90mm的无菌平皿，凝固，制成平板，采用适宜的方法使培养基表面干燥。
若使用直径较大的平皿，培养基用量也应相应增加。
每一平板表面接种上述照“供试液的制备”“接种和稀释”和“抗菌活性的去除或灭活”制备的供试液不少于0.1ml。
按表1规定条件培养、计数。
同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。
计算各试验组的平均菌落数。
（2）薄膜过滤法
薄膜过滤法所采用的滤膜孔径应不大于0.45pm，直径一般为50mm，若采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。
供试品及其溶剂应不影响滤膜材质对微生物的截留。
滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。
使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。
水溶性供试液过滤前先将少量的冲洗液过滤以润湿滤膜。
油类供试品，其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。
为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。
供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100ml。
总冲洗量不得超过1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。
取照上述“供试液的制备”“接种和稀释”和“抗菌活性的去除或灭活”制备的供试液适量（一般取相当于lg、lml或10cm2的供试品，若供试品中所含的菌数较多时，供试液可酌情减量），加至适量的稀释液中，混匀，过滤。
用适量的冲洗液冲洗滤膜。
若测定需氧菌总数，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平板上；若测定霉菌和酵母总数，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上。
按表1规定条件培养、计数。
每株试验菌每种培养基至少制备一张滤膜。
同法测定供试品对照组及菌液对照组菌数。
（3）MPN法
MPN法的精密度和准确度不及薄膜过滤法和平皿计数法，仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下使用，本法不适用于霉菌计数。
若使用MPN法，按下列步骤进行。
取照上述“供试液的制备”“接种和稀释”和“抗菌活性的去除或灭活”制备的供试液至少3个连续稀释级，每一稀释级取3份lml分别接种至3管装有9～10ml胰酪大豆胨液体培养基中，同法测定菌液对照组菌数。
必要时可在培养基中加入表面活性剂、中和剂或灭活剂。
接种管置30～35℃培养3天，逐日观察各管微生物生长情况。
如果由于供试品的原因使得结果难以判断，可将该管培养物转种至胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基，在相同条件下培养1～2天，观察是否有微生物生长。
根据微生物生长的管数从表3查被测试品每1g或每1ml中需氧菌总数的最可能数。
2.2.5.5结果判断
计数方法适用性试验中，采用平皿法或薄膜过滤法时，试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内；采用MPN法时，试验组菌数应在菌液对照组菌数的95%置信限内。
若各试验菌的回收试验均符合要求，照所用的供试液制备方法及计数方法进行该供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数计数。
方法适用性确认时，若采用上述方法还存在一株或多株试验菌的回收达不到要求，那么选择回收最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检査。
3供试品检查
3.1检验量
检验量即一次试验所用的供试品量（g、ml或cm2）。
一般应随机抽取不少于2个最小包装的供试品，混合，取规定量供试品进行检验。
除另有规定外，一般供试品的检验量为10g或10ml；膜剂为100cm2；贵重药品、微量包装药品的检验量可以酌减。
检验时，应从2个以上最小包装单位中抽取供试品，大蜜丸还不得少于4丸，膜剂还不得少于4片。
3.2供试品的检査
按计数方法适用性试验确认的计数方法进行供试品中需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的测定。
胰酪大豆胨琼脂培养基或胰酪大豆胨液体培养基用于测定需氧菌总数；沙氏葡萄糖琼脂培养基用于测定霉菌和酵母总数。
3.3阴性对照试验
以稀释液代替供试液进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长，如果阴性对照有菌生长，应进行偏差调査。
3.4平皿法
平皿法包括倾注法和涂布法。
除另有规定外，取规定量供试品，按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和菌数测定，每稀释级每种培养基至少制备2个平板。
3.4.1培养和计数
除另有规定外，胰酪大豆胨琼脂培养基平板在30～35℃培养3～5天，沙氏葡萄糖琼脂培养基平板在20～25℃培养5～7天，观察菌落生长情况，点计平板上生长的所有菌落数，计数并报告。
菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。
点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。
若同稀释级两个平板的菌落数平均值不小于15，则两个平板的菌落数不能相差1倍或以上。
3.4.2菌数报告规则
需氧菌总数测定宜选取平均菌落数小于300cfu的稀释级、霉菌和酵母菌总数测定宜选取平均菌落数小于lOOcfu的稀释级，作为菌数报告的依据。
取最髙的平均菌落数，算lg、lml或10cm2供试品中所含的微生物数，取两位有效数字报告。
如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。
3.5薄膜过滤法
除另有规定外，按计数方法适用性试验确认的方法进行供试液制备。
取相当于lg、lml或10cm2供试品的供试液，若供试品所含的菌数较多时，可取适宜稀释级的供试液，照方法适用性试验确认的方法加至适量稀释液中，立即过滤，冲洗，冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基上培养。
3.5.1培养和计数
培养条件和计数方法同平皿法，每张滤膜上的菌落数应不超过100cfu。
3.5.2菌数报告规则
以相当于lg、lml或10cm2供试品的菌落数报告菌数；若滤膜上无菌落生长，以＜1报告菌数（每张滤膜过滤lg、lml或10cm2供试品），或＜1乘以最低稀释
倍数的值报告菌数。
3.6MPN法
取规定量供试品，按方法适用性试验确认的方法进行供试液制备和供试品接种，所有试验管在30～35℃：
培养3～5天，如果需要确认是否有微生物生长，按方法适用性试验确定的方法进行。
记录每一稀释级微生物生长的管数，从表3査每lg或lml供试品中需氧菌总数的最可能数。
3.7结果判断
需氧菌总数是指胰酪大豆胨琼脂培养基上生长的总菌落数（包括真菌菌落数）；霉菌和酵母菌总数是指沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的总菌落数（包括细菌菌落数）。
若因沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的细菌使霉菌和酵母菌的计数结果不符合微生物限度要求，可使用含抗生素（如氯霉素、庆大霉素）的沙氏葡萄糖琼脂培养基或其他选择性培养基（如玫瑰红钠琼脂培养基）进行霉菌和酵母菌总数测定。
使用选择性培养基时，应进行培养基适用性检查。
若采用MPN法，测定结果为需氧菌总数。
各品种项下规定的微生物限度标准解释如下：
101cfu：
可接受的最大菌数为20；
102cfu：
可接受的最大菌数为200;
103cfu：
可接受的最大菌数为2000，依此类推。
若供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检査结果均符合该品种项下的规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合
规定。
4稀释液、冲洗液及培养基
稀释液配制后，应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液、pH6.8无菌磷酸盐缓冲液、pH7.2无菌磷酸盐缓冲液、pH7.6无菌磷酸盐缓冲液照缓冲液配制后，过滤，分装，灭菌。
如需要，可在上述稀释液灭菌前或灭菌后加人表面活性剂或中和剂等。
0.9%无菌氯化钠溶液取氯化钠9.0g,加水溶解使成1000ml，过滤，分装，灭菌。
5培养基及其制备方法
培养基可按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合要求的脱水培养基。
配制后，应按验证过的高压灭菌程序灭菌。
5.1胰酪大豆胨液体培养基（TSB）
胰酪胨17.0g氯化钠5.0g
大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g磷酸氢二钾2.5g
葡萄糖/无水葡萄糖2.5g/2.3g水1000ml
胰酷胨17.0g氯化钠5.0g
大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g磷酸氢二钾2.5g
葡萄糖/无水葡萄糖2.5g/2.3g水1000ml
除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，滤过，调节pH使灭菌后在25℃的pH值为7.3±0.2，加入葡萄糖，分装，灭菌。
胰酪大豆胨液体培养基置20～25℃培养。
5.2胰酪大豆胨琼脂培养基（TSA）
胰酪胨15.0g琼脂15.0g
大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g水1000ml
氯化钠5.0g
除琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后在25℃的pH值为7.3±0.2，加人琼脂，加热溶化后，摇匀，分装，灭菌。
5.3沙氏葡萄糖液体培养基（SDB）
动物组织胃蛋白酶水解物葡萄糖20.0g
和胰酪胨等量混合物10.0g水1000ml
除葡萄糖外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后在25℃的pH值为5.6±0.2，加人葡萄糖，摇匀，分装，灭菌。
5.4沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）
动物组织胃蛋白酶水解物琼脂15.0g
和胰酪胨等量混合物10.0g水1000ml
葡萄糖40.0g
除葡萄糖、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后在25℃的pH值为5.6±0.2，加人琼脂，加热溶化后，再加入葡萄糖，摇匀，分装，灭菌。
如使用含抗生素的沙氏葡萄糖琼脂培养基，应确认培养基中所加的抗生素量不影
响供试品中霉菌和酵母菌的生长。
5.5马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）
马铃薯（去皮）200g琼脂14.0g
葡萄糖20.0g水1000ml
取马铃薯，切成小块，加水1000ml,煮沸20～30分钟，用6～8层纱布过滤，取滤液补水至1000ml,调节pH使灭菌后在25℃的pH值为5.6±0.2,加入琼脂，加热溶化后，再加入葡萄糖，摇匀，分装，灭菌。
5.6玫瑰红钠琼脂培养基
胨5.0g玫瑰红钠0.0133g
葡萄糖10.0g琼脂14.0g
磷酸二氢钾l.Og水1000ml
硫酸镁0.5g
除葡萄糖、玫瑰红钠外，取上述成分，混合，微温溶解，加入葡萄糖、玫瑰红钠，摇匀，分装，灭菌。
5.7硫乙酵酸盐流体培养基
胰酪胨15.0g氯化钠2.5g
酵母浸出粉5.0g新配制的0.1%刃天青溶液1.0ml
无水葡萄糖5.0gL-胱氨酸0.5g
硫乙醇酸钠0.5g琼脂0.75g
（或硫乙醇酸）（0.3ml）水1000ml
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加人葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH,使灭菌后在25℃的pH值为7.1土0.2。
分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。
灭菌。
在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。
除另有规定外，硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。
5.8肠道菌增菌液体培养基
明胶胰酶水解物10.0g二水合磷酸氢二钠8.0g
牛胆盐20.0g亮绿5mg
葡萄糖5.0g水1000ml
磷酸二氢钾2.0g
除葡萄糖、亮绿外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使加热后在25℃的pH值为7.2±0.2,加人葡萄糖、亮绿，加热至100°C30分钟，立即冷却。
5.9紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基
酵母浸出粉3.0g中性红30mg
明胶胰酶水解物7.0g结晶紫2mg
脱氧胆酸钠1.5g琼脂15.0g
葡萄糖10.0g水1000ml
氯化钠5.0g
除葡萄糖、中性红、结晶紫、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使加热后在25℃的pH值为7.4±02。
加入葡萄糖、中性红、结晶紫、琼脂，加热煮沸（不能在高压灭菌器中加热）。
5.10麦康凯液体培养基
明胶胰酶水解物20.0g溴甲酚紫10mg
乳糖10.0g水1000ml
牛胆盐5.0g
除乳糖、溴甲酚紫外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后在25℃的pH值为7.3±0.2，加入乳糖、溴甲酚紫，分装，灭菌。
5.11麦康凯琼脂培养基
明胶胰酶水解物17.0g中性红30.Omg
胨5.0g结晶紫1mg
乳糖10.0g琼脂13.5g
脱氧胆酸钠1.5g水1000ml
氯化钠5.0g
除乳糖、中性红、结晶紫、琼脂外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后在25℃的pH值为7.1±0.2，加人乳糖、中性红、结晶紫、琼脂，加热煮沸1分钟，并不断振摇，分装，灭菌。
5.12RV沙门菌增菌液体培养基
大豆胨 4.5g六水合氯化镁29.Og
氯化钠8.0g孔雀绿36mg
磷酸氢二钾0.4g水1000ml
磷酸二氢钾0.6g
除孔雀绿外，取上述成分，混合，微温溶解，调节pH使灭菌后在25℃的pH值为5.2±0.2。
加人孔雀绿，分装，灭菌，灭菌温度不能超过115℃。
5.13木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基不
酵母浸出粉3.0g氯化钠5.Og
L-赖氨酸5.0g硫代硫酸钠6.8g
木糖3.5g枸橼酸铁铵0.8g
乳糖7.5g酚红80mg
蔗糖7.5g琼脂13.5g
脱氧胆酸钠2.5g水1000m
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