微生物限度检查法.docx
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微生物限度检查法
微生物限度检查法
信息来源：
中国药典2000年版二部附录 更新时间：
2006-12-100:
26:
42
标题
微生物限度检查法
附录序号
附录ⅩⅢ
内容全文
C.微生物限度检查法
微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法。
包括染菌量及控制菌的检查。
供试品应随机抽样。
如遇有异常或可疑的样品，须选取有疑义的样品。
一般抽样量为检验用量（2个以上最小包装单位）的3倍量。
供试品在检验前不得开启，在检查前及检查中应防止供试品污染菌受损、致死或繁殖。
凡能从药品、瓶口（外盖内侧及瓶口周围）外观看出发霉、变质的药品，可直接判为不合格，无需再抽样检查。
检查的全部过程均应严格遵守无菌操作，严防再污染。
除另有规定外，本检查法中细菌培养温度为30～35℃，霉菌、酵母菌培养温度为25℃～28℃，控制菌培养温度为36±1℃。
细菌、霉菌（酵母菌）计数和控制菌检查，均应作对照试验。
检验结果的报告以1g、1ml或10cm<2>为单位。
培养基及其制备方法：
1、营养琼脂培养基与营养肉汤培养基
见无菌检查法（附录ⅩⅢＢ）
2、虎红琼脂培养基
胨
5g
虎红（四氯四碘荧光素）
0.0133g
葡萄糖
10g
（或0.133％虎红溶液10ml）
磷酸二氢钾（KH2PO4）
1g
琼脂
15～20g
硫酸镁（MgSO4.7H2O）
0.5g
水
1000ml
除葡萄糖、虎红外，取上述成分，混合，加热溶化后，滤过，加入葡萄糖、虎红，分装，115℃灭菌30分钟。
3、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）
胨
10g
琼脂
15～20g
酵母浸出粉
5g
水
1000ml
葡萄糖
20g
除葡萄糖外，取上述成分，混合，加热融化后，滤过，加入葡萄糖，分装，115℃灭菌15分钟。
4、胆盐乳糖培养基（BL）
胨
20g
牛胆盐
1.3g
乳糖
5g
（或去氧胆酸钠0.25g）
氯化钠
5g
水
100ml
磷酸氢二钾（K2HPO4）
4.0g
磷酸二氢钾（KH2PO4）
1.3g
除乳糖、牛胆盐外，取上述成分,混合,加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.4±0.2,煮沸，滤清，加入乳糖、牛胆盐，分装，115℃灭菌30分钟。
5、曙红美亚甲蓝琼脂培养基（EMB）
营养琼脂培养基
100ml
2％曙红溶液
2ml
20％乳糖溶液 5ml
0.5％亚甲蓝溶液
1.3～1.6ml
取营养琼脂培养基，加热融化后，冷至60℃,按无菌操作加入灭菌的其它三种溶液,摇匀，倾注平皿。
6、麦康凯琼脂培养基（MaCC）
胨
20g
1％中性红溶液
2.5ml
乳糖
10g
琼脂
15～20g
牛胆盐
5g
水
1000ml
氯化钠
5g
除乳糖、1％中性红溶液、牛胆盐及琼脂外、取上述成分,混合，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，加入琼脂，加热融化后，再加入其余各成分，摇匀，分装，115℃灭菌30分钟，冷至约60℃，倾注平皿。
7、三糖铁琼脂培养基（TSI）
胨
20g
硫酸亚铁
0.2g
牛肉浸出粉
5g
硫代硫酸钠
0.2g
乳糖
10g
0.2％酚红溶液
12.5ml
蔗糖
10g
琼脂
12～15g
葡萄糖
1g
水
1000ml
氯化钠
5g
除三糖、0.2％酚红溶液、琼脂外，取上述成分，混合，加热使溶解,调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入琼脂，加热融化后，滤过，再加入其余成分，摇匀，分装,115℃灭菌30分钟，制成高底层（2～3cm）短斜面。
8、四硫磺酸钠亮绿增菌液（TTB）
胨
5g
硫代硫酸钠
30g
牛胆盐
1g
水
1000ml
碳酸钙10g
取上述成分，混合，微温使溶解，121℃灭菌20分钟。
临用前，取上述培养基，每10ml中加入碘溶液（取碘6g与碘化钾5g，溶于20ml水中）0.2ml和0.1％亮绿溶液0.1ml，混匀。
9、沙门氏、志贺氏菌属琼脂培养基（SS）
胨
5g
硫代硫酸钠
8.5g
牛肉浸出粉
5g 1％中性红溶液
2.5ml
乳糖
10g 0.1％亮绿溶液
0.33ml
牛胆盐
8.5g 琼脂
20g
枸橼酚钠
8.5g
水
1000ml
枸橼酸铁铵
1g
除糖、指示剂、琼脂外，取上述成分混合，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±0.1，滤过，加入琼脂，加热融化后，121℃灭菌20分钟，再加入其余成分，摇匀，冷至约60℃，倾注平皿。
10、胆盐硫乳琼脂培养基（DHL）
胨
20g
枸橼酸钠
1g
牛肉浸出粉
3g
枸橼酸铁铵
1g
乳糖
10g
1％中性红溶液
3ml
蔗糖
10g
琼脂
18～20g
去氧胆酸钠
1g
水
1000ml
硫代硫酸钠
2.3g
除糖、1％中性红溶液及琼脂外,取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.2±0.1，加入琼脂,加热融化后,再加入其余成分，摇匀，冷至约60℃，倾注平皿。
11、十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基
胨
10g
牛肉浸出粉3g
氯化钠
5g
琼脂
15～20g
十六烷三甲基溴化铵0.3g
水
1000ml
除琼脂外，取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.5±0.1，加入琼脂，加热熔化后，分装，121℃灭菌20分钟，冷至约60℃，倾注平皿。
12、亚碲酸盐肉汤培养基
临用前，取灭菌的营养肉汤培养基，每100ml中加入新配制的1％亚碲酸钠（钾）溶液0.2ml，混匀，即得。
13、卵黄高盐琼脂培养基
胨
6g
10％氯化钠卵黄液100ml
牛肉浸出粉1.8g
琼脂
23g
氯化钠
30g
水
650ml
除10％氯化钠卵黄液外，取上述成分混合，微温使溶解,调节pH值使灭菌后为7.6±0.1。
121℃灭菌20分钟，待冷至约60℃，以无菌操作加入10％氯化钠卵黄液,充分摇匀,倾注平皿。
10％氯化钠卵黄液的制备
取新鲜鸡蛋一个，以无菌操作取出卵黄，放入10％灭菌氯化钠溶液100ml中，充分振摇，即得。
14、甘露醇高盐琼脂培养基
胨
10g
1％酚红溶液
2.5ml
牛肉浸出粉1g
琼脂
15～20g
甘露醇
10g
水
1000ml
氯化钠
75g
除甘露醇、1％酚红溶液及琼脂外,取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.4±0.2，加入琼脂，加热融化后，滤过，分装，115℃灭菌30分钟，冷至约60℃,倾注平皿。
15、蛋白胨水培养基
胰蛋白胨
10g
水1000ml
氯化钠
5g
取上述成分混合，加热融化，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管中,121℃灭菌20分钟。
16、磷酸盐葡萄糖胨水培养基
胨
7g
葡萄糖5g
磷酸氢二钾（K2HPO4）3.8g
水1000ml
取上述成分混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管中，121℃灭菌15分钟。
17、枸橼酸盐培养基
氯化钠
5g
枸橼酸钠（无水）
2g
硫酸镁（MgSO4·7H2O）
0.2g
溴麝香草酚蓝指示液20ml
磷酸氢二钾（K2HPO4）
0.8g
琼脂
15～20g
磷酸二氢铵（NH4H2PO4）
1g
水
1000ml
除溴麝香草酚蓝和琼脂外，取上述成分，混微温使溶解,调节pH值使灭菌后为6.9±0.1，加入琼脂，加热融化，加入指示剂混匀。
分装于小试管中，121℃灭菌15分钟，置成斜面。
注：
所用琼脂应不含游离糖，用前用水浸泡冲洗。
18、糖、醇发酵培养基
基础液
胨
10g
0.5％酸性复红指示剂10ml
糖、醇0.5％
（或溴麝香草酚蓝指示液6ml）
氯化钠
5g
水
1000ml
取胨和氯化钠加入水中，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.4,加入指示剂混匀,分装每瓶100ml，121℃灭菌15分钟。
配制葡萄糖发酵管时，于100ml基础液中加入0.5g葡萄糖,分装于含杜氏管（Durham）的小试管中。
121℃灭菌15分钟,配制其它糖醇发酵管时,将各种糖醇分别配成10％溶液,与基础液同时于121℃灭菌15分钟。
以无菌操作将5ml糖醇溶液加入100ml基础液内,分装于灭菌小试管中。
注：
糖醇溶液亦可采用薄膜过滤法除菌。
19、5％乳糖发酵管
胨
0.2g
乳糖
5g
氯化钠
0.3g
溴麝香草酚蓝指示液
0.6ml
磷酸氢二钠（Na2·HPO4·12H2O）
0.2g
水
1000ml
除乳糖和指示剂外，取上述成分，混合，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.4,加入乳糖及指示剂，混匀，分装于含杜氏管的灭菌小试管中，115℃灭菌15分钟。
20、尿素琼脂培养基
胨
1g
葡萄糖
1g
氯化钠
5g
20％尿素溶液1000ml
磷酸二氢钾（KH2PO4）2g
琼脂
20g
0.2％酚红溶液
6ml
水
1000ml
除尿素和琼脂外，取上述成分，混合，调节pH值使灭菌后为7.2±0.1，加入琼脂，加热溶化并分装于锥形瓶，121℃灭菌20分钟。
冷至50～55℃,加入经薄膜过滤除菌的尿素溶液，混匀。
尿素的最终浓度为2％，分装于灭菌试管中，置成斜面。
21、氰化钾培养基
胨
3g
磷酸氢二钠（Na2HPO4）5.64g
氯化钠
5g
氰化钾试液
磷酸二氢钾（KH2PO4）0.225g
水
1000ml
除氰化钾试液外，取上述成分，混合,调节pH值使灭菌后为7.5±0.1，121℃灭菌20分钟，冷却后，每100ml培养基中加入氰化钾试液1.5ml,分装于12×100mm灭菌试管内，每管4ml，立即用灭菌橡皮塞塞紧，置4℃保存。
同时，以不加氰化钾试液的培养基作为对照培养基，分装于灭菌试管中。
22、赖氨酸脱羧酶试验培养基
胨
5g
1.6％溴甲酚紫乙醇溶液
1ml
酵母浸出粉3g
L-赖氨酸（DL-赖氨酸）0.5（1g）/100ml
葡萄糖
1g
水
1000ml
除赖氨酸外，取上述成分，混合，加热溶解后分装，每瓶100ml。
加入L-赖氨酸0.5g（DL-赖氨酸1g）调节pH值使灭菌后为6.8,同时以不加赖氨酸培养基作为对照。
分装于灭菌的小试管内，每管1ml并滴加一层液体石蜡，121℃灭菌10分钟。
23、绿脓菌素（pyocyanin）测定用培养基（PDP琼脂）
胨
20g
甘油
10ml
氯化镁（无水）1.4g
琼脂
18～20g
硫酸钾（无水）
10g
水
1000ml
取胨、氯化镁和硫酸钾加入水中，微温使深解。
调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入甘油及琼脂，加热溶解，121℃灭菌20分钟，置成斜面。
24、明胶培养基
胨
5g
明胶120g
牛肉浸出粉3g
水1000ml
取上述成分加入水中，浸泡约20分钟，随时搅拌，加热使溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，分装于小试管中，115℃灭菌20分钟。
25、硝酸盐胨水培养基
胨
10g
亚硝酸钠
0.5g
酵母浸出粉3g
水
1000ml
硝酸钾
2g
取胨及酵母浸出粉加入水中，微温使溶解，调节pH值使灭菌后为7.3±0.1，加入硝酸钾和亚硝酸钠溶解，混匀。
分装于含杜氏管的小试管中，115℃灭菌20分钟。
试药
牛肉浸出粉“Lab-lemco”powder
本品为米色粉末在水中溶解。
牛胆盐BileSaltOx
本品为淡黄色或黄棕色粉末；味苦而甜；具吸湿性。
在水和醇中易溶。
沙黄（番红）SafranineT[C20H19ClN4=350.85]
本品为红棕色粉末，现红光；为碱基性染料。
在水中溶解，在乙醇中易溶。
虎红（四氯四碘荧光素钠盐）Rosebengal
[C20H2Cl4I4Na2O5=1017.6]
本品为棕红色粉末。
在水中溶解，溶液呈紫色，无荧光；在硫酸中溶解，溶液为棕色。
枸橼酸铁铵
Ammoniumferriccitrate
[C12H22FeN3）O14=488.16]
本品为棕红色或绿色鳞片或粉末；易潮解，见光易还原成亚铁。
在水中溶解，在醇和醚中不溶。
胰蛋白胨Tryptone
本品为米黄色粉末。
在水中溶解。
酚红PhenolRed
[C19H14O5S＝354.38]
本品为深红色结晶性粉末。
在乙醇中溶解，在水、三氯甲烷和醚中不溶。
DL-赖氨酸DL-Lysine
[C6H14N2O2＝146.19]
本品为白色结晶；极易潮解。
在水中溶解。
L-赖氨酸L-Lysine
[C6H14N2O2=146.19]
本品为白色针状结晶；在空气中易吸收二氧化碳。
在水中易溶解，在醇中微溶解，在醚中不溶。
酸性复红FuchsinAcid[C20H17N3Na2O9S3=585.54]
本品为绿色有金属光泽的颗料或深红色粉末。
在水中溶解，在醇中不溶。
磷酸二氢铵
AmmoniumPhosphateMonobasic[NH4H2PO4=115.03]
本品为无色结晶或白色结晶性粉末。
在水中溶解，在乙醇中不溶。
试液
二盐酸二甲基对苯二胺试液
取二盐酸二甲基对苯二胺0.1g，加水10ml，即得。
需新鲜少量配制，于冷处避光保存，如试液变成红褐色，不可使用。
甲基红试液
取甲基红0.1g，加入乙醇300ml，使溶解后，加水至500ml，即得。
无菌对氨基苯甲酸试液
取对氨基苯甲酸0.1g，加入含有10ml水的带塞试管中，121℃灭菌20分钟。
亚碲酸钠（钾）试液
取亚碲酸钠（钾）0.1g，加新鲜煮沸后冷至50℃的水10ml使溶解。
沙黄（番红）试液
取沙黄（番红）0.25g,加乙醇10ml，使完全溶解后,加水至100ml。
无菌尿素试液
取尿素20.0g，加水100ml，充分摇匀使溶解，滤过除菌。
或在尿素试液中加麝香草酚1.0g，于室温放置1～2天，即得。
配制时需无菌操作。
亚甲蓝试液
取亚甲蓝0.5g，加水溶解使成100ml。
虎红试液
取虎红0.1g，加水使溶解成75ml。
无菌枸橼酸钠－氯化钠试液
取枸橼酸钠0.5g，加0.9％氯化钠溶液10ml，121℃灭菌20分钟。
草酸铵试液
取草酸铵1.0g，加水使溶解成100ml。
亮绿试液
取亮绿0.1g，加水100ml使溶解。
结晶紫试液
取结晶紫1.0g，加乙醇20ml使溶解，加1％草酸铵水溶液80ml,混匀。
静置48小时使用，置密闭棕色瓶中储存。
氢氧化钾试液
取氢氧化钾40.0g，加水使溶解成100ml。
盐酸试液
取盐酸8.4ml，加水稀释至100ml。
α-萘酚的乙醇试液
取α-萘酚6.0g，加无水乙醇使溶解成100ml。
氰化钾试液
取氰化钾0.5g，加水使溶解成100ml。
氯化三苯四氮唑试液
取氯化三苯四氮唑0.1g，加水使溶解10ml。
碘试液
取碘化钾2.0g，加水3～5ml使溶解，加入碘片1.0g，使全部溶解后，加水稀释至300ml。
置密闭棕色瓶储存。
曙红钠试液
取曙红钠20g，加水使溶解成100ml。
靛基质试液
取对二甲氨基苯甲醛5.0g，加入戊醇（或丁醇）75ml，充分振摇，使完全溶解后，再取浓盐酸25ml徐徐滴入，加滴边振摇，以免骤热导致溶液色泽变深；或取对二甲氨基苯甲醛1.0g，加入乙醇95ml，充分振摇，使完全溶解后，取盐酸20ml徐徐滴入。
稀释剂
0.9％无菌氯化钠溶液
取氯化钠9.0g，加水使溶解成1000ml，121℃灭菌20分钟。
无菌吐温80－氯化钠溶液
取吐温801ml，加0.9％氯化钠溶液使成100ml,121℃灭菌20分钟。
无菌磷酸盐缓冲液（pH7.2）
取磷酸氢二钠25.8g与磷酸二氢钠4.4g，加水稀释至1000ml，121℃灭菌20分钟。
指示液
中性红指示液
取中性红1.0g，细研，加乙醇60ml使溶解，再加水至100ml。
变色范围
pH6.8～8.0（红→黄）。
酚红指示液
取酚红1.0g，加1mol/L氢氧化钠2.82ml使溶解,再加水稀释至100ml。
变色范围
pH6.8～8.4（黄→红）。
溴甲酚紫指示液
取溴甲酚紫1.6g，加乙醇使溶解成100ml。
变色范围
pH5.2～6.8（黄→紫）。
溴麝香草酚蓝指示液
取溴麝香草酚蓝0.4g,加1mol/L氢氧化钠溶液0.64ml使溶解,再加水稀释至100ml。
变色范围
pH6.0～7.6（黄→蓝）。
酸性复红指示液（Andrade指示剂）
取酸性复红0.5g，加水100ml,使溶解，再逐渐加入1mol/L氢氧化钠溶液16ml，每加1滴均应将溶液充分摇匀后再加第二滴,直至溶液呈草黄色；于沸水内保持15分钟，再静置2小时，滤过，即得。
变色范围
pH6.0～7.4（黄→红）。
供试品的检验量
每批供试品检验量一般为10g或10ml。
化学药膜剂为100cm2,贵重的或微量包装的供试品检验量可以酌减，但口服药品不得少于3g，外用药品不得少于5g。
供试品均须取自2个以上的包装单位，大蜜丸、膜剂除须取自2个以上包装单位外，应取自4丸（片）以上样品。
供试液的制备
按供试品的理化特性与生物学特性可采取适宜的方法制成供试液。
1、液体供试品
取供试品10ml，加入90ml稀释剂中，混匀，作为供试液。
油剂可加适量吐温80；气雾剂以适宜方法使抛射剂导出后，加入适量稀释剂，混匀，吸取相当10g或10ml供试品，再稀释成100ml作供试液；合剂（系指含王浆或蜂蜜者，下同）与滴眼剂可用供试品作为供试液。
2、固体、半固体或粘稠液
供试品称取供试品10g,置0.9％无菌氯化钠溶液100ml中，用匀浆仪或其它适宜方法，混匀后，作为供试液。
在制备过程中，必要时可加适量吐温80，并适当加温，但不应超过45℃。
（1）非水溶性供试品
称取供试品10g（10ml），加入灭菌吐温80
30ml、灭菌液体石蜡10ml与0.9％无菌氯化钠溶60ml（或50ml），同置匀浆仪中，乳化,或其它适发法乳化，作供试液。
在制过程中，必要时可适当加温，但不应超过45℃。
（2）不溶于水的膜剂供试品
取规定量，剪碎，加稀释剂100ml（必要时可增加稀释剂），浸泡，振摇，作为供试液。
（3）肠溶胶囊（片）供试品
称取供试品10g，置含无菌磷酸盐缓冲液（pH6.8）100ml的锥形瓶内。
于45℃水浴中，保温、振摇、使溶解，作为供试液。
3含抑菌成分供试品
供试品如干扰控制菌检验，按以下方法处理后，依法检查。
（1）稀释法
将供试液种入较大量的培养基中，使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度。
（2）离心沉淀集菌法
取规定量的供试液，离心（3000转）30分钟，弃去上清液，留底部集菌液约2ml，再稀释成原规定量的供试液。
如有不溶性药渣，可先离心（500转）5分钟，取全部上层液，再行集菌处理。
（3）薄膜过滤法
取规定量的供试液，置稀释剂100ml中,摇匀，以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径不大于0.45±0.02μm微孔滤膜的薄膜过滤器内，减压抽干后,用稀释剂冲洗滤膜3次，每次50～100ml，取出滤膜备检。
（4）中和法
凡含磺胺、汞、砷类或防腐剂的供试品，可用相应的试剂钝化活性因子，中和毒性后制成供试液。
对照用菌液
控制菌检查均应作相应已知菌的对照试验。
对照菌株为大肠杆菌[CMCC（B）44102]、沙门氏菌〔CMCC（B）50094〕、绿脓杆菌〔CMCC（B）10104〕及金黄色葡萄球菌〔CMCC（B）26003〕。
取相应菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳,接种至营养肉汤培养基内，培养18～20小时后，稀释至1:
10<6>。
对照菌的加入量为50～100个。
检查法
1、细菌、霉菌与酵母菌计数
（1）平皿菌落计数法
取均匀供试液,进一步稀释成1:
10<2>、1:
10<3>等适宜的稀释度。
分别取连续三级10倍稀释的供试液各1ml,置直径约90mm的平皿中，再注入约45℃的培养基约15ml，混匀，待凝固后，倒置培养，每稀释度应作2～3个平皿。
细菌计数用营养琼脂培养基，霉菌计数用虎红琼脂培养基，酵母菌计数用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，合剂用虎红琼脂培养基与酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基。
菌数测定空白对照试验
取供试验用的稀释剂各1ml，置4个无菌平皿中，分别按细菌、霉菌计数用的培养基制备平板、培养、检查，不得长菌。
细菌培养时间为48小时,分别在24及48小时点计菌落数,一般以48小时菌落数为准。
霉菌、酵母培养时间为72小时，分别在48及72小时点计菌落数，一般以72小时菌落数为准。
营养琼脂平板一般点计细菌菌落数，虎红琼脂平板一般点计霉菌菌落数，在特殊情况下，前者同时点计霉菌、酵母菌菌落数，后者同时点计细菌菌落数。
酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂平板仅点计酵母菌菌落数。
液体制剂同时点计霉菌菌落数及酵母菌菌落数。
含蜂蜜及王浆的合剂的霉菌、酵母菌菌落数分别测定，合并计数。
菌落如蔓延生长成
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