精简版植物组织培养.docx
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精简版植物组织培养
植物组织培养
绪论P1
第一章植物组织培养的基本原理P3
第二章植物组织培养的基本原理P6
第三章植物器官和组织培养P11
第四章胚胎培养及离体授粉P16
第五章花药和花粉培养P20
第六章植物细胞培养P24
第八章原生质体培养P27
第九章植物离体繁殖P30
第十章无病毒苗木培育P33
植物组织培养基本操作P35
第一章植物组织培养的基本原理
第一节:
植物组织培养实验室
一、实验室要求
环境要求:
理想的植物组织培养实验室应该建立在安静、清洁、远离污染源的地方,最好在常年主风向的上风方向,尽量减少污染。
规模化生产的实验室最好建在交通方便的地方,便于产品的运送。
需考虑两个方面:
一、所从事实验的性质二、实验室规模
实验室设置的基本原则:
科学、高效、经济和实用。
二、实验室组成
(一)基本实验室
基本实验室包括准备室、无菌操作室、培养室、缓冲间,是植物组织培养实验所必须具备的基本条件。
如进行工厂化生产,年产4万-20万,需3-4间实验用房,总面积60平方米。
实验室必须满足3个基本需要:
实验准备(培养基制备、器皿洗涤、培养基和培养器皿灭菌)、无菌操作和控制培养。
1、准备室
功能:
进行一切与实验有关的准备工作:
器皿洗涤、培养基配制与分装、培养基和培养器皿的灭菌、培养材料的预处理等。
要求:
20平方米左右。
要求宽敞明亮、以便于放置多个实验台和相关设备,方便多人同时工作;同时要求通风条件好,便于气体交换;实验室地面应便于清洁,并应进行防滑处理。
设备:
准备室应具备工作台、柜橱、水池、仪器、药品等。
分类:
分体式-研究性质实验室,可将准备室分解为药品贮藏室、培养基配制与洗涤室和灭菌室等,功能明确,便于管理,不适于大规模生产。
通间式-规模化实验室,设计成大的通间,试验操作的各个环节在同一房间内按程序完成。
便于程序化操作与管理,减少各环节间的衔接时间,提高工作效率。
还便于培养基配制、分装和灭菌的自动化操作程序设计,减少规模化生产的人工劳动,更便于无菌条件的控制和标准化操作体系的建立。
2、无菌操作室
功能:
也叫接种室,进行材料的离体无菌操作,是植物离体培养研究或生产中最关键的一步。
要求:
房间一般不宜过大,10-20平方米即可。
要求封闭性好,干燥清洁,能较长时间保持无菌,因此不宜设在容易受潮的地方;为便于消毒处理,地面及内墙壁都应采用防水和耐腐蚀材料;地面要求平坦无缝,便于清洁;为了保持清洁,无菌室应防止空气对流。
一般新建实验室的无菌室在使用之前应进行灭菌处理,处理方法是甲醛和高锰酸钾熏蒸,并需定期灭菌处理,还可用紫外线照射1-2h/周,或每次使用前照射10-30min。
设备:
无菌操作室安装有紫外灯和空调,工作台和搁架,还有超净工作台和整套灭菌接种仪器、药品等。
3、培养室
功能:
对接种到培养瓶等器皿中的植物离体材料进行控制条件下的培养,实验材料进行培养的场所。
要求:
10-20平方米左右。
要求能够控制光照和温度,并保持相对的无菌环境。
因此,培养室应保持清洁和适度干燥;为满足植物培养材料生长对气体的需要,还应安装排风窗和换气扇等换气装置;为节省能源和空间,应配置适宜的培养架,并应安装日光灯照明。
研究用实验室,通常可根据光照时间设置成长日照、中日照、短日照培养室,也可以根据温度设置成高温和低温培养室,每一个培养室的空间不宜过大,便于对条件的均匀控制。
进行精细培养类型如细胞培养和原生质体培养,可采用光照培养箱或人工气候箱代替培养室。
设备:
培养架、光照培养箱或人工气候箱、边台用于拍摄培养物生长状况,除湿机、显微镜、温湿度计、空调等。
4、缓冲间
功能:
进入无菌室前的缓冲场地,减少人体从外界带入的尘埃等污染物。
人员在此换上工作服、拖鞋、口罩,才能进入无菌室和培养室。
要求:
3-5平方米,在准备室外或无菌操作室外,应保持清洁无菌;备有鞋架和衣帽挂钩。
设备:
1-2盏紫外灯对衣物进行灭菌、灭菌工作服、拖鞋、口罩。
(二)辅助实验室
根据研究或生产的需要而配套设置的专门实验室,主要用于细胞学观察和生理生化分析等。
1、细胞学实验室
功能:
对培养材料进行细胞学鉴定和研究,分为制片室和显微观察室。
制片是获取显微观察数据的基础,制片室配备有切片机、磨刀机、温箱及样品处理和切片染色设备,通风橱和废液处理设施。
显微观察室主要有显微镜和图像拍摄、处理设备。
要求:
明亮、清洁、干燥、防止潮湿和灰尘污染。
2、生化分析实验室
培养细胞产物为主要目的实验室,应建立相应的分析化验实验室,随时对培养物成分进行取样检查。
大型次生代谢物生产,还需有效分离实验室。
第二节仪器设备和器皿用具
一、基本设备配置
(一)常规设备
1、天平
植物组织培养实验室需要不同精度的天平。
感量0.001g的天平(分析天平)和感量0.0001g的天平(电子天平)用于称量微量元素和一些较高精确度的实验用品。
感量0.01g和0.1g的天平,用于大量元素母液配制和一些用量较大的药品的称量。
2、冰箱
各种维生素和激素类药品以及培养基母液均需低温报存,某些试验还需植物材料进行低温处理,普通冰箱即可。
3、酸度计
用于测定培养基及其它溶液的pH,一般要求可测定pH范围1-14之间,精度0.01即可。
4、离心机
用于细胞、原生质体等活细胞分离,亦用于培养细胞的细胞器、核酸以及蛋白质的分离提取。
根据分离物质不同配置不同类型的离心机。
细胞、原生质体等活细胞的分离用低速离心机;核酸、蛋白质分离用高速冷冻离心机;规模化生产次生产物,还需选择大型离心分离系统。
5、加热器
用于培养基的配制。
研究性实验室一般选用带磁力搅拌功能的加热器,规模化大型实验室用大功率加热和电动搅拌系统。
6、其它纯水器、分装设备
(二)灭菌设备
维持相对的无菌环境是植物组织培养实验室的基本要求。
1、高压灭菌锅
用于培养基、玻璃器皿以及其它可高温灭菌用品的灭菌,根据规模大小有手提式、立式、卧式等不同规格。
2、干热消毒柜
用于金属工具如镊子、剪刀、解剖刀,以及玻璃器皿的灭菌。
一般选用200℃左右的普通或远红外消毒柜。
3、过滤灭菌器
用于一些酶制剂、激素以及某些维生素等不能高压灭菌试剂的灭菌,主要有真空抽滤式和注射器式。
4、紫外灯
方便经济的控制无菌环境的装置,缓冲间、接种室和培养室必备。
(三)无菌操作设备
1、接种箱
使用较早的最简单的无菌装置,主体为玻璃箱罩、入口有袖罩,内装紫外灯和日光灯,使用时对无菌室要求较高。
2、净化工作台
其操作台面是半开放区,具方便、操作舒适优点,通过过滤的空气连续不断吹出,大于0.03um直径的微生物很难在工作台的操作空间停留,保持了较好的无菌环境。
由于过滤器吸附微生物,使用一段时间后过滤网易堵塞,因此应定期更换。
(四)培养设备
指根据需要所选用的不同规格和控制精度的用于植物细胞、组织和器官培养的设施和设备。
1、培养架
目前植物组织培养实验室植株繁殖培养的通用设施。
成本低、设计灵活、充分利用培养空间。
一般有4-5层,层间间隔40-50cm,光照强度可根据培养植物特性来确定,一般每架上配备2-4盏日光灯。
2、培养箱
细胞培养、原生质体培养等要求精确培养的实验,可用光照培养箱、CO2培养箱、湿度控制培养箱等培养。
3、摇床:
进行液体培养时,为改善通气状况,可用振荡培养箱或摇床。
4、生物反应器:
进行植物细胞生产次生产物的实验室,还需生物反应器。
(五)其他设备
时间程序控制器、温度控制系统或空调、实体显微镜、倒置式生物显微镜及配套的摄影、录像和图像处理设备、电泳仪、萃取和层析设备、紫外分光光度计、高效液相色谱仪、气相色谱仪、酶联免疫测定系统。
二、培养容器与用具
(一)培养容器:
包括各种规格的培养皿、三角瓶、试管、培养瓶。
一般分为:
玻璃容器—一般用无色并不产生颜色折射的硼硅酸盐玻璃材质。
塑料容器—材质轻、不易破碎、制作方便,广泛使用。
一般为聚丙烯、聚碳酸酯材料的培养容器
(二)金属用具
1、镊子:
植物组织解剖用小的尖头镊子,分株转移繁殖转接用枪型镊子,16-22cm长。
2、剪刀:
不锈钢医用弯头剪,做取材和切段转移繁殖,14-22cm长。
3、解剖刀:
进行组织切段,多用短柄可换刀片的医用不锈钢解剖刀。
4、其他用具:
接种铲、接种针在花药培养、花粉培养中有用。
三)塑料用具:
各种封口膜、盖、塑料盘及其它实验用具。
第三节:
基本操作
一、洗涤
(一)重铬酸钾洗涤法
饱和重铬酸钾洗液的配制方法是:
将43g重铬酸钾溶与1000ml蒸馏水(20℃可以达到饱和状态),制成重铬酸钾饱和水溶液。
然后缓慢加入浓硫酸,最后使重铬酸钾饱和水溶液以浓硫酸比例达到1:
1。
在配制过程中,只能把浓硫酸缓慢加入进去,决不可把重铬酸钾水溶液加入浓硫酸中,因会产生大量热量而来不及扩散,从而引起浓硫酸溅出。
洗涤方法:
一般用具:
用水洗净玻璃器皿,晾干后放入重铬酸钾洗涤液中,浸泡1夜,第二天取出,用自来水冲洗,然后用蒸馏水洗两次。
干燥后备用。
小的玻璃制品法:
吸管:
先用自来水冲洗,放在特制的防腐不锈钢网筒内,用重铬酸钾浸泡一夜,再将网筒放入虹吸式自动冲洗装置中,用自来水冲洗数十次,最后用蒸馏水冲洗,干燥后备用。
(二)洗涤剂洗净法
重铬酸钾洗液的最大缺点是铬离子会造成环境污染,因此,应尽量避免使用。
普通无磷中性洗涤剂,是理想的选择。
(三)超声波洗净法
这是一种物理的洗净法,对环境无任何污染,而且对比较顽固的污垢也十分有效,但超声波发生器容量有限,因此,常用来清洗较小的玻璃仪器和器械。
方法:
将玻璃制品放入超声波洗净器中,注入自来水,设定时间,然后进行处理,拿出用自来水冲净,蒸馏水冲洗。
(四)玻璃器皿的清洗
新购置的玻璃器皿:
带有游离的碱性物质,先用1%的稀盐酸浸泡1夜,再用肥皂水洗净,清水冲洗,蒸馏水冲淋,烘干。
已用过的培养器皿:
去掉培养基,洗涤剂溶液浸泡,刷子刷洗,自来水冲洗,蒸馏水冲洗。
较脏的玻璃器皿:
洗衣粉或洗洁精刷洗,冲净,浸入洗涤液中,按上面方法洗涤,浸泡时间根据脏的程度定。
被污染的玻璃器皿:
121高压蒸汽灭菌后,用洗涤剂刷掉污染物,冲洗,重铬酸钾洗涤液浸泡,2h后取出,自来水冲洗,蒸馏水冲淋。
用过的吸管或滴管:
在洗涤液中浸泡2h以上,取出冲洗干净。
洗净后的玻璃器皿应透明发亮,内外壁水膜均匀,不挂水珠。
第三节培养基成分、种类及特点
植物生长必需16种基本元素:
N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、Mn、B、Cu、Zn、Mo、Cl、C、H、O。
离体培养条件下,各元素主要从培养基中获得:
H和O来源于水,C来源于添加的糖类,其它矿质元素来源于组成培养基的无机盐。
培养基是根据植物生长所需营养成分,配制成的供植物生长的人工制作的营养物质。
一、培养基的成分
培养基一般包括无机盐、有机化合物和生长调节剂三大基本组成成分。
1、无机盐类
功能:
离体组织生长发育的基本成分
根据植物对必需元素需要的量,可以分为以下两类:
大量元素—植物所需元素的使用量一般在每升几十-几千毫克,有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。
微量元素—植物所需元素的浓度小于10-5~10-7mol/L,Fe、Cu、Zn、Mn、Mo、B、Cl。
除C、H、O外,其它矿质元素通常以离子态吸收
N-硝态氮和铵态氮
2、有机化合物
培养基中只有无机盐叫做基本培养基,为使培养物更好的生长,还需添加有机成分,常用有糖类、维生素、醇类、嘌呤、氨基酸等。
⑴糖类
功能离体培养物生长与发育不可缺少的有机成分,即作为碳源,又维持培养基的渗透压在1.5-4.1MPa。
多使用蔗糖,试管苗生长与繁殖浓度2-3%,幼胚培养4-6%,某些特殊培养中用8-10%。
细胞和原生质体培养还用麦芽糖、葡萄糖、果糖。
⑵维生素类
功能参与酶的形成、蛋白质、脂肪代谢,明显的促进离体培养物的生长。
盐酸硫胺素-VB1、盐酸吡哆醇-VB6、烟酸-Vpp、生物素-VH、维生素C-Vc。
⑶肌醇
功能促进糖的转化、维生素和激素的利用,对胚状体和芽的形成有良好影响。
用量一般50-100mg/L。
⑷腺嘌呤
合成各种细胞分裂素的前体物质之一,利于细胞分裂,促进芽的形成和生长。
⑸氨基酸
蛋白质的成分,是有机氮化合物,常用甘氨酸和多种氨基酸混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白。
⑹其它复合成分
成分尚不清楚的天然提取物,如椰乳、香蕉汁、酵母提取液、番茄汁、麦芽糖等。
3、生长调节物质
⑴生长素类
功能促进细胞脱分化和细胞伸长,诱导愈伤组织产生
生长素与细胞分裂素协调作用,在离体培养中,生长素促进根的形成,抑制芽的形成。
液体培养中利于体细胞胚胎发生。
常用IAA、IBA、NAA、2,4-D。
⑵细胞分裂素类
功能促进细胞分裂和扩大,调节器官分化,延缓组织衰老,增强蛋白质合成。
离体培养中,促进不定芽的发生,与生长素协调作用可有效控制培养物的生长与分化。
常用6-BA、ZT、KT、2iP。
植株的形态建成是CTK和IAA的比值调控的
CTK/IAA高,诱导愈伤组织形成芽CTK/IAA低,诱导愈伤组织形成根
⑶赤霉素类
功能促进细胞伸长生长、诱导花芽形成、打破种子休眠以及诱导单性结实等。
与生长素协调作用对形成层分化有影响,刺激体细胞胚进一步发育成植株。
有20多种,目前主要是赤霉酸GA3。
4、水
离体培养中,既是培养基营养成分的溶剂,又是培养基的重要组成部分,占培养基成分的95%。
原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般应用双蒸水或超纯水
大批量快速繁殖培养,可用一般蒸馏水或纯净水。
5、其它附加成分
⑴琼脂
功能来自海藻的多糖类物质,组织培养中最常用作凝固剂,是最方便、最好的凝固剂和支持物。
常用量0.6%-1.0%,不是培养基必需成分。
卡拉胶海藻提取物,含杂质少纯度更高,凝固后培养基透明,利于材料观察。
⑵活性炭
功能常用的吸附剂,某些培养类型中,可以吸附培养过程中产生的一些有毒物质(酚类物质),有利于培养物的生长。
常用浓度1~5mg/L左右
其吸附作用选择性较差,使用应慎重。
常受温度影响,低温吸附效果好,高温吸附能力降低甚至解吸附。
⑶抗生素
培养基中添加抗生素可防止菌类污染,常用的抗生素有青霉素、链霉素、庆大霉素等,用量一般为5~20mg/L。
大部分抗生素需要过滤除菌。
⑷抗氧化物
抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)及抗坏血酸(Vc),可用50~200mg/L的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表面,或过滤除菌后加入固体培养基的表层。
二、常用培养基的种类、配方及特点
(一)培养基种类
1、根据态相分:
固体培养基-加凝固剂的培养基
液体培养基-不加凝固剂的培养基。
2、根据培养过程分:
初代培养基-初次接种外植体的培养基。
继代培养基-接种初代培养之后培养物的培养基。
3、根据作用分:
诱导培养基-诱导外植体启动生长
增殖培养基-诱导离体培养苗扩大繁殖。
生根培养基-诱导离体培养苗生根
4、根据营养水平分:
基本培养基-包含无机盐等基本营养成分。
完全培养基-包含使植物离体生长全面营养。
(二)几种常用培养基
细胞工程常用的基本培养基有:
MS、MT、White、Nitsch、Blaydes、N6、B5、NT、SH、Miller、Heller等。
(三)几种常见培养基的特点
1、富盐平衡培养基
无机盐浓度高,元素比例适当,离子平衡好,具有较强的缓冲性,培养中维持较好的稳定性,含高量氮、钾,营养丰富,元素种类齐全,MS培养基使用最广泛。
2、低盐培养基
无机盐浓度低,有机成分含量低,多数作为生根培养基、胚胎培养使用,常用White培养基。
3、高硝态盐培养基
较低铵盐,高硝酸盐和盐酸硫胺素B5培养基适合双子叶植物特别是木本植物的生长。
N6培养基为水稻等禾谷类花药培养设计,KNO3和(NH4)2SO4含量高,不含钼。
SH培养基(NH4)H2PO4代替(NH4)2SO4,矿质浓度较高,多数单子叶和双子叶植物上使用较好。
4、中盐培养基
大量元素无机盐为MS的1/2,微量元素种类减少含量增高,无肌醇维生素种类多,增加生物素、叶酸,有H、Hitsch、Miller、Blaydes等培养基,适用于特殊细胞培养。
第二节培养基的制备
一、培养基母液的配制
(一)营养成分的配制
根据药品性质将母液配制成以下四类:
1、大量元素
可以混在一起配制成10—20倍液,硫酸镁和氯化钙Ca2+和Mg2+会与磷酸盐混合,产生不溶性沉淀,要分别单独配制,Ca2+与PO4-一起混合易沉淀,定容后消失。
2、微量元素:
可配成100—200倍混合母液,KI可单独配。
3、铁盐:
硫酸亚铁和EDTA钠盐易沉淀,需单独配制,配成100—200倍鳌合剂不易沉淀。
4、有机化合物:
维生素、肌醇、氨基酸等一起配成100或200倍液,也可分别配制。
(二)植物生长调节物质的配制
植物生长调节物质分别配成母液储于冰箱,浓度一般为0.5-1mg/ml。
1、IAA、NAA:
先用少量95%酒精使之充分溶解。
2、2,4-D:
可用少量0.1mol/L的NaOH溶液充分溶解,再缓缓加蒸馏水定容至需要的体积。
3、KT和BA等细胞分裂素类:
先用少量0.1mol/L的HCl溶解,再用蒸馏水定容至需要的体积。
(三)药品用量的计算:
配制母液时药品用量(mg)=配方用量(mg)×浓缩倍数×制备容量(L)
二、培养基的制作
(一)母液取用量的计算
制备培养基时母液取用量(ml)=1000÷浓缩倍数×制备培养基数量(L)
(二)培养基制作程序
1、按大量元素、微量元素、铁盐、有机成分顺序将母液取出,混合。
2、适量蒸馏水放入加热容器,蒸馏水应少于所制培养基数量,约终体积的2/3-3/4,接通电源加热。
3、向加热容器中加入称量好的琼脂(0.6-0.8%),搅拌加热,至完全溶化。
4、琼脂熬化后,称取相应量的蔗糖(2-3%),加入加热容器中至溶解。
5、将母液混合液加入到加热容器中,搅拌混匀。
6、蒸馏水定容至所需体积。
7、测试培养基溶液的PH值(5.8-6.0),过高滴加0.1mol/L的HCL调整,过低滴加0.1mol/L的NaOH调整。
8、迅速分装到培养瓶中,备用。
三、培养基及培养器械的灭菌
制备好的培养基如果带菌,会导致植物离体培养失败,因而还要对培养基进行灭菌处理。
(一)高压蒸汽灭菌
培养基的灭菌一般采用湿热灭菌法:
1、培养瓶及培养器械放入高压灭菌锅。
2、灭菌锅加水至淹没电热丝。
3、封闭高压灭菌锅各出气口。
4、接通电源加压至49kPa(0.05MPa)5、打开排气阀,排冷气至压力0kPa。
6、继续加压至108kPa(0.11mPa-0.12Mpa,即121℃)7、压力至108kPa(0.11mPa-0.12Mpa,即121℃)时,稳压在此压力15-20min。
8、关闭电源自然冷却至压力为0kPa。
9、取出培养基和器械冷却,贮存于30℃以下室内。
(二)干热灭菌
培养瓶、三角瓶、试管等玻璃器皿及接种器械,可以进行干热灭菌。
即将洗涤干净的玻璃器皿放到烘箱中,在150℃温度下,干热灭菌1小时,或120℃下灭菌2小时。
灭菌完毕冷却后取出器械贮存。
贮存室要保持无菌、干燥、以免造成培养基的二次污染。
灭菌后的培养基一般应在2周内使用,时间过长易造成潜在的污染。
培养基灭菌后如果出现过多沉淀或琼脂不凝固等现象,该培养基不能继续使用,应查明原因重新配制。
第四节 外植体无菌接种
一、植物材料的培养与取材
外植体—是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料,是植物离体培养的基础材料。
1、外植体的来源
-生长在自然环境下的植物
-有目的地培育在温室控制条件下生长的植物
-无菌环境下已经过离体培养的植物
自然环境中生长的植株,一般带有微生物,甚至与某些微生物具有寄生关系,使植株具有内生菌。
取自这些植物的外植体,在培养过程中会有微生物滋生,从而影响培养效果。
多数情况下,应尽量使用温室或人工气候室控制培养的植物材料作为外植体来源,减少培养过程中的微生物感染概率。
同时,生长在控制条件下的植物可以保持培养料间的一致性,提高实验的可重复性,也便于培养技术的规范。
2、供体植株的管理
取自室外的外植体材料,供体植株的管理十分重要,这与外植体培养时的污染率密切相关。
植株管理中应注意:
⑴避免昆虫危害许多昆虫如蚜虫、螨类和飞虱是许多植物病虫害的传播媒介,会引起植物组织的潜在感染。
⑵注意防病尤其是真菌和细菌病害的侵染,取自感病植株的外植体,在培养中的污染率远远高于来自健康植株的外植体,必要时需使用化学药剂防治病害。
⑶控制湿度给供体植株浇水时应从根部给水,避免从上部浇水,以免上部形成易于病原侵染的湿度环境;尽可能降低温室湿度;取材前尽可能保持植株干爽。
1、材料取材
⑴材料选择
培养材料应选择有代表性的主要植物、选择性状优良的种质或特殊的基因型。
快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材,花药培养应在花粉发育到单核期取材。
选取材料的大小一般在0.5-1.0cm之间。
胚胎培养或脱毒在0.5cm以下。
材料太大易污染,材料太小难于成活。
⑵采收
从生长健壮的无病虫害的植株上选取发育正常的器官和组织。
最好采用茎尖,后代性状较稳定,携带细菌较少。
二、预处理与表面灭菌
1、预处理
先对植物材料进行修剪整理,去掉不需要部分,将准备使用的植物材料(外植体)在流水中冲洗20-60分钟,备用。
如特别不洁的外植体,可先用加有洗涤剂的水清洗10-15分钟,再用流水冲洗干净。
2、表面灭菌
(1)操作人员穿戴灭菌过的工作服、口罩。
进入接种室前双手用洗涤剂清洗干净,操作前再用70%酒精或消毒剂擦洗双手。
(2)操作期间双手和台面常用70%酒精或消毒剂擦拭。
超净工作台使用前必须用紫外灯照射杀菌,然后开启风机。
(3)接种用工具(解剖刀、剪刀、镊子)可放入70-75%酒精中,使用时需火焰灼烧灭菌,冷却后使用。
(4)外植体放入超净工作台内,置70-75%酒精中5-60秒,0.1氯化汞6-10分钟,或10%的漂白粉上清液中10-15分钟,然后用无菌水冲洗3-5次。
灭菌时需进行搅动。
常用灭菌剂使用浓度及效果比较表
灭菌剂使用浓度持续时间去除的难易效果
次氯酸钙9-10%5-30分钟易很好
次氯酸钠2%5-30分钟易很好
氯化汞0.1-1%5-10分钟较难最好
抗菌素4-50mg/L30-60分钟中较好
酒精70-75%0.2-2分钟易好
过氧化氢10-12%5-15分钟最易好
三、外植体的接种—无菌接种
外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞、转放到无菌培养基上的全部操作过程。
整个过程均需无菌操作。
(1)借助接种用工具将材料切割分离。
(2)将培养基放入超净工作台内,火焰灼烧培养基瓶口,然后打开培养瓶口,置培养瓶为斜角,避免灰尘落入平中。
(3)迅速将切割分离下的所需组织、细胞、器官,放入培养基上,及时盖上瓶盖。
(4)工具用后应及时灭菌,避免交叉污染。
(5)工