精简版植物组织培养.docx

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精简版植物组织培养

植物组织培养

绪论P1

第一章植物组织培养的基本原理P3

第二章植物组织培养的基本原理P6

第三章植物器官和组织培养P11

第四章胚胎培养及离体授粉P16

第五章花药和花粉培养P20

第六章植物细胞培养P24

第八章原生质体培养P27

第九章植物离体繁殖P30

第十章无病毒苗木培育P33

植物组织培养基本操作P35

第一章植物组织培养的基本原理

第一节：

植物组织培养实验室

一、实验室要求

环境要求：

理想的植物组织培养实验室应该建立在安静、清洁、远离污染源的地方，最好在常年主风向的上风方向，尽量减少污染。

规模化生产的实验室最好建在交通方便的地方，便于产品的运送。

需考虑两个方面：

一、所从事实验的性质二、实验室规模

实验室设置的基本原则：

科学、高效、经济和实用。

二、实验室组成

（一）基本实验室

基本实验室包括准备室、无菌操作室、培养室、缓冲间，是植物组织培养实验所必须具备的基本条件。

如进行工厂化生产，年产4万-20万，需3-4间实验用房，总面积60平方米。

实验室必须满足3个基本需要：

实验准备（培养基制备、器皿洗涤、培养基和培养器皿灭菌）、无菌操作和控制培养。

1、准备室

功能：

进行一切与实验有关的准备工作：

器皿洗涤、培养基配制与分装、培养基和培养器皿的灭菌、培养材料的预处理等。

要求：

20平方米左右。

要求宽敞明亮、以便于放置多个实验台和相关设备，方便多人同时工作；同时要求通风条件好，便于气体交换；实验室地面应便于清洁，并应进行防滑处理。

设备：

准备室应具备工作台、柜橱、水池、仪器、药品等。

分类：

分体式-研究性质实验室，可将准备室分解为药品贮藏室、培养基配制与洗涤室和灭菌室等，功能明确，便于管理，不适于大规模生产。

通间式-规模化实验室，设计成大的通间，试验操作的各个环节在同一房间内按程序完成。

便于程序化操作与管理，减少各环节间的衔接时间，提高工作效率。

还便于培养基配制、分装和灭菌的自动化操作程序设计，减少规模化生产的人工劳动，更便于无菌条件的控制和标准化操作体系的建立。

2、无菌操作室

功能：

也叫接种室，进行材料的离体无菌操作，是植物离体培养研究或生产中最关键的一步。

要求：

房间一般不宜过大，10-20平方米即可。

要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌，因此不宜设在容易受潮的地方；为便于消毒处理，地面及内墙壁都应采用防水和耐腐蚀材料；地面要求平坦无缝，便于清洁；为了保持清洁，无菌室应防止空气对流。

一般新建实验室的无菌室在使用之前应进行灭菌处理，处理方法是甲醛和高锰酸钾熏蒸，并需定期灭菌处理，还可用紫外线照射1-2h/周，或每次使用前照射10-30min。

设备：

无菌操作室安装有紫外灯和空调，工作台和搁架，还有超净工作台和整套灭菌接种仪器、药品等。

3、培养室

功能：

对接种到培养瓶等器皿中的植物离体材料进行控制条件下的培养，实验材料进行培养的场所。

要求：

10-20平方米左右。

要求能够控制光照和温度，并保持相对的无菌环境。

因此，培养室应保持清洁和适度干燥；为满足植物培养材料生长对气体的需要，还应安装排风窗和换气扇等换气装置；为节省能源和空间，应配置适宜的培养架，并应安装日光灯照明。

研究用实验室，通常可根据光照时间设置成长日照、中日照、短日照培养室，也可以根据温度设置成高温和低温培养室，每一个培养室的空间不宜过大，便于对条件的均匀控制。

进行精细培养类型如细胞培养和原生质体培养，可采用光照培养箱或人工气候箱代替培养室。

设备：

培养架、光照培养箱或人工气候箱、边台用于拍摄培养物生长状况，除湿机、显微镜、温湿度计、空调等。

4、缓冲间

功能：

进入无菌室前的缓冲场地，减少人体从外界带入的尘埃等污染物。

人员在此换上工作服、拖鞋、口罩，才能进入无菌室和培养室。

要求：

3-5平方米，在准备室外或无菌操作室外，应保持清洁无菌；备有鞋架和衣帽挂钩。

设备：

1-2盏紫外灯对衣物进行灭菌、灭菌工作服、拖鞋、口罩。

（二）辅助实验室

根据研究或生产的需要而配套设置的专门实验室，主要用于细胞学观察和生理生化分析等。

1、细胞学实验室

功能：

对培养材料进行细胞学鉴定和研究，分为制片室和显微观察室。

制片是获取显微观察数据的基础，制片室配备有切片机、磨刀机、温箱及样品处理和切片染色设备，通风橱和废液处理设施。

显微观察室主要有显微镜和图像拍摄、处理设备。

要求：

明亮、清洁、干燥、防止潮湿和灰尘污染。

2、生化分析实验室

培养细胞产物为主要目的实验室，应建立相应的分析化验实验室，随时对培养物成分进行取样检查。

大型次生代谢物生产，还需有效分离实验室。

第二节仪器设备和器皿用具

一、基本设备配置

（一）常规设备

1、天平

植物组织培养实验室需要不同精度的天平。

感量0.001g的天平（分析天平）和感量0.0001g的天平（电子天平）用于称量微量元素和一些较高精确度的实验用品。

感量0.01g和0.1g的天平，用于大量元素母液配制和一些用量较大的药品的称量。

2、冰箱

各种维生素和激素类药品以及培养基母液均需低温报存，某些试验还需植物材料进行低温处理，普通冰箱即可。

3、酸度计

用于测定培养基及其它溶液的pH，一般要求可测定pH范围1-14之间，精度0.01即可。

4、离心机

用于细胞、原生质体等活细胞分离，亦用于培养细胞的细胞器、核酸以及蛋白质的分离提取。

根据分离物质不同配置不同类型的离心机。

细胞、原生质体等活细胞的分离用低速离心机；核酸、蛋白质分离用高速冷冻离心机；规模化生产次生产物，还需选择大型离心分离系统。

5、加热器

用于培养基的配制。

研究性实验室一般选用带磁力搅拌功能的加热器，规模化大型实验室用大功率加热和电动搅拌系统。

6、其它纯水器、分装设备

（二）灭菌设备

维持相对的无菌环境是植物组织培养实验室的基本要求。

1、高压灭菌锅

用于培养基、玻璃器皿以及其它可高温灭菌用品的灭菌，根据规模大小有手提式、立式、卧式等不同规格。

2、干热消毒柜

用于金属工具如镊子、剪刀、解剖刀，以及玻璃器皿的灭菌。

一般选用200℃左右的普通或远红外消毒柜。

3、过滤灭菌器

用于一些酶制剂、激素以及某些维生素等不能高压灭菌试剂的灭菌，主要有真空抽滤式和注射器式。

4、紫外灯

方便经济的控制无菌环境的装置，缓冲间、接种室和培养室必备。

（三）无菌操作设备

1、接种箱

使用较早的最简单的无菌装置，主体为玻璃箱罩、入口有袖罩，内装紫外灯和日光灯，使用时对无菌室要求较高。

2、净化工作台

其操作台面是半开放区，具方便、操作舒适优点，通过过滤的空气连续不断吹出，大于0.03um直径的微生物很难在工作台的操作空间停留，保持了较好的无菌环境。

由于过滤器吸附微生物，使用一段时间后过滤网易堵塞，因此应定期更换。

（四）培养设备

指根据需要所选用的不同规格和控制精度的用于植物细胞、组织和器官培养的设施和设备。

1、培养架

目前植物组织培养实验室植株繁殖培养的通用设施。

成本低、设计灵活、充分利用培养空间。

一般有4-5层，层间间隔40-50cm，光照强度可根据培养植物特性来确定，一般每架上配备2-4盏日光灯。

2、培养箱

细胞培养、原生质体培养等要求精确培养的实验，可用光照培养箱、CO2培养箱、湿度控制培养箱等培养。

3、摇床：

进行液体培养时，为改善通气状况，可用振荡培养箱或摇床。

4、生物反应器：

进行植物细胞生产次生产物的实验室，还需生物反应器。

（五）其他设备

时间程序控制器、温度控制系统或空调、实体显微镜、倒置式生物显微镜及配套的摄影、录像和图像处理设备、电泳仪、萃取和层析设备、紫外分光光度计、高效液相色谱仪、气相色谱仪、酶联免疫测定系统。

二、培养容器与用具

（一）培养容器：

包括各种规格的培养皿、三角瓶、试管、培养瓶。

一般分为：

玻璃容器—一般用无色并不产生颜色折射的硼硅酸盐玻璃材质。

塑料容器—材质轻、不易破碎、制作方便，广泛使用。

一般为聚丙烯、聚碳酸酯材料的培养容器

（二）金属用具

1、镊子：

植物组织解剖用小的尖头镊子，分株转移繁殖转接用枪型镊子，16-22cm长。

2、剪刀：

不锈钢医用弯头剪，做取材和切段转移繁殖，14-22cm长。

3、解剖刀：

进行组织切段，多用短柄可换刀片的医用不锈钢解剖刀。

4、其他用具：

接种铲、接种针在花药培养、花粉培养中有用。

三）塑料用具：

各种封口膜、盖、塑料盘及其它实验用具。

第三节：

基本操作

一、洗涤

（一）重铬酸钾洗涤法

饱和重铬酸钾洗液的配制方法是：

将43g重铬酸钾溶与1000ml蒸馏水（20℃可以达到饱和状态），制成重铬酸钾饱和水溶液。

然后缓慢加入浓硫酸，最后使重铬酸钾饱和水溶液以浓硫酸比例达到1：

1。

在配制过程中，只能把浓硫酸缓慢加入进去，决不可把重铬酸钾水溶液加入浓硫酸中，因会产生大量热量而来不及扩散，从而引起浓硫酸溅出。

洗涤方法：

一般用具：

用水洗净玻璃器皿，晾干后放入重铬酸钾洗涤液中，浸泡1夜，第二天取出，用自来水冲洗，然后用蒸馏水洗两次。

干燥后备用。

小的玻璃制品法：

吸管：

先用自来水冲洗，放在特制的防腐不锈钢网筒内，用重铬酸钾浸泡一夜，再将网筒放入虹吸式自动冲洗装置中，用自来水冲洗数十次，最后用蒸馏水冲洗，干燥后备用。

（二）洗涤剂洗净法

重铬酸钾洗液的最大缺点是铬离子会造成环境污染，因此，应尽量避免使用。

普通无磷中性洗涤剂，是理想的选择。

（三）超声波洗净法

这是一种物理的洗净法，对环境无任何污染，而且对比较顽固的污垢也十分有效，但超声波发生器容量有限，因此，常用来清洗较小的玻璃仪器和器械。

方法：

将玻璃制品放入超声波洗净器中，注入自来水，设定时间，然后进行处理，拿出用自来水冲净，蒸馏水冲洗。

（四）玻璃器皿的清洗

新购置的玻璃器皿：

带有游离的碱性物质，先用1%的稀盐酸浸泡1夜，再用肥皂水洗净，清水冲洗，蒸馏水冲淋，烘干。

已用过的培养器皿：

去掉培养基，洗涤剂溶液浸泡，刷子刷洗，自来水冲洗，蒸馏水冲洗。

较脏的玻璃器皿：

洗衣粉或洗洁精刷洗，冲净，浸入洗涤液中，按上面方法洗涤，浸泡时间根据脏的程度定。

被污染的玻璃器皿：

121高压蒸汽灭菌后，用洗涤剂刷掉污染物，冲洗，重铬酸钾洗涤液浸泡，2h后取出，自来水冲洗，蒸馏水冲淋。

用过的吸管或滴管：

在洗涤液中浸泡2h以上，取出冲洗干净。

洗净后的玻璃器皿应透明发亮，内外壁水膜均匀，不挂水珠。

第三节培养基成分、种类及特点

植物生长必需16种基本元素：

N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、Mn、B、Cu、Zn、Mo、Cl、C、H、O。

离体培养条件下，各元素主要从培养基中获得：

H和O来源于水，C来源于添加的糖类，其它矿质元素来源于组成培养基的无机盐。

培养基是根据植物生长所需营养成分，配制成的供植物生长的人工制作的营养物质。

一、培养基的成分

培养基一般包括无机盐、有机化合物和生长调节剂三大基本组成成分。

1、无机盐类

功能:

离体组织生长发育的基本成分

根据植物对必需元素需要的量，可以分为以下两类：

大量元素—植物所需元素的使用量一般在每升几十-几千毫克，有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。

微量元素—植物所需元素的浓度小于10-5～10-7mol/L，Fe、Cu、Zn、Mn、Mo、B、Cl。

除C、H、O外，其它矿质元素通常以离子态吸收

N-硝态氮和铵态氮

2、有机化合物

培养基中只有无机盐叫做基本培养基，为使培养物更好的生长，还需添加有机成分，常用有糖类、维生素、醇类、嘌呤、氨基酸等。

⑴糖类

功能离体培养物生长与发育不可缺少的有机成分，即作为碳源，又维持培养基的渗透压在1.5-4.1MPa。

多使用蔗糖，试管苗生长与繁殖浓度2-3%，幼胚培养4-6%，某些特殊培养中用8-10%。

细胞和原生质体培养还用麦芽糖、葡萄糖、果糖。

⑵维生素类

功能参与酶的形成、蛋白质、脂肪代谢，明显的促进离体培养物的生长。

盐酸硫胺素-VB1、盐酸吡哆醇-VB6、烟酸-Vpp、生物素-VH、维生素C-Vc。

⑶肌醇

功能促进糖的转化、维生素和激素的利用，对胚状体和芽的形成有良好影响。

用量一般50-100mg/L。

⑷腺嘌呤

合成各种细胞分裂素的前体物质之一，利于细胞分裂，促进芽的形成和生长。

⑸氨基酸

蛋白质的成分，是有机氮化合物，常用甘氨酸和多种氨基酸混合物如水解酪蛋白、水解乳蛋白。

⑹其它复合成分

成分尚不清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、酵母提取液、番茄汁、麦芽糖等。

3、生长调节物质

⑴生长素类

功能促进细胞脱分化和细胞伸长，诱导愈伤组织产生

生长素与细胞分裂素协调作用，在离体培养中，生长素促进根的形成，抑制芽的形成。

液体培养中利于体细胞胚胎发生。

常用IAA、IBA、NAA、2,4-D。

⑵细胞分裂素类

功能促进细胞分裂和扩大，调节器官分化，延缓组织衰老，增强蛋白质合成。

离体培养中，促进不定芽的发生，与生长素协调作用可有效控制培养物的生长与分化。

常用6-BA、ZT、KT、2iP。

植株的形态建成是CTK和IAA的比值调控的

CTK/IAA高，诱导愈伤组织形成芽CTK/IAA低，诱导愈伤组织形成根

⑶赤霉素类

功能促进细胞伸长生长、诱导花芽形成、打破种子休眠以及诱导单性结实等。

与生长素协调作用对形成层分化有影响，刺激体细胞胚进一步发育成植株。

有20多种，目前主要是赤霉酸GA3。

4、水

离体培养中，既是培养基营养成分的溶剂，又是培养基的重要组成部分，占培养基成分的95%。

原生质体培养、细胞培养及分生组织培养一般应用双蒸水或超纯水

大批量快速繁殖培养，可用一般蒸馏水或纯净水。

5、其它附加成分

⑴琼脂

功能来自海藻的多糖类物质，组织培养中最常用作凝固剂，是最方便、最好的凝固剂和支持物。

常用量0.6%-1.0%，不是培养基必需成分。

卡拉胶海藻提取物，含杂质少纯度更高，凝固后培养基透明，利于材料观察。

⑵活性炭

功能常用的吸附剂，某些培养类型中，可以吸附培养过程中产生的一些有毒物质（酚类物质），有利于培养物的生长。

常用浓度1～5mg/L左右

其吸附作用选择性较差，使用应慎重。

常受温度影响，低温吸附效果好，高温吸附能力降低甚至解吸附。

⑶抗生素

培养基中添加抗生素可防止菌类污染，常用的抗生素有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量一般为5～20mg/L。

大部分抗生素需要过滤除菌。

⑷抗氧化物

抗酚类氧化常用的药剂有半胱氨酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）及抗坏血酸（Vc），可用50～200mg／L的浓度洗涤刚切割的外植体伤口表面，或过滤除菌后加入固体培养基的表层。

二、常用培养基的种类、配方及特点

（一）培养基种类

1、根据态相分：

固体培养基-加凝固剂的培养基

液体培养基-不加凝固剂的培养基。

2、根据培养过程分：

初代培养基-初次接种外植体的培养基。

继代培养基-接种初代培养之后培养物的培养基。

3、根据作用分：

诱导培养基-诱导外植体启动生长

增殖培养基-诱导离体培养苗扩大繁殖。

生根培养基-诱导离体培养苗生根

4、根据营养水平分：

基本培养基-包含无机盐等基本营养成分。

完全培养基-包含使植物离体生长全面营养。

（二）几种常用培养基

细胞工程常用的基本培养基有：

MS、MT、White、Nitsch、Blaydes、N6、B5、NT、SH、Miller、Heller等。

（三）几种常见培养基的特点

1、富盐平衡培养基

无机盐浓度高，元素比例适当，离子平衡好，具有较强的缓冲性，培养中维持较好的稳定性，含高量氮、钾，营养丰富，元素种类齐全，MS培养基使用最广泛。

2、低盐培养基

无机盐浓度低，有机成分含量低，多数作为生根培养基、胚胎培养使用，常用White培养基。

3、高硝态盐培养基

较低铵盐，高硝酸盐和盐酸硫胺素B5培养基适合双子叶植物特别是木本植物的生长。

N6培养基为水稻等禾谷类花药培养设计，KNO3和（NH4）2SO4含量高,不含钼。

SH培养基（NH4）H2PO4代替（NH4）2SO4,矿质浓度较高，多数单子叶和双子叶植物上使用较好。

4、中盐培养基

大量元素无机盐为MS的1/2，微量元素种类减少含量增高，无肌醇维生素种类多，增加生物素、叶酸，有H、Hitsch、Miller、Blaydes等培养基，适用于特殊细胞培养。

第二节培养基的制备

一、培养基母液的配制

（一）营养成分的配制

根据药品性质将母液配制成以下四类：

1、大量元素

可以混在一起配制成10—20倍液，硫酸镁和氯化钙Ca２+和Mg2+会与磷酸盐混合，产生不溶性沉淀，要分别单独配制,Ca２+与PO4-一起混合易沉淀，定容后消失。

2、微量元素：

可配成100—200倍混合母液，KI可单独配。

3、铁盐：

硫酸亚铁和EDTA钠盐易沉淀，需单独配制，配成100—200倍鳌合剂不易沉淀。

4、有机化合物：

维生素、肌醇、氨基酸等一起配成100或200倍液，也可分别配制。

（二）植物生长调节物质的配制

植物生长调节物质分别配成母液储于冰箱，浓度一般为0.5－1mg/ml。

1、IAA、NAA：

先用少量95%酒精使之充分溶解。

2、2,4－D：

可用少量0.1mol/L的NaOH溶液充分溶解，再缓缓加蒸馏水定容至需要的体积。

3、KT和BA等细胞分裂素类：

先用少量0.1mol/L的HCl溶解，再用蒸馏水定容至需要的体积。

（三）药品用量的计算：

配制母液时药品用量（mg）=配方用量（mg）×浓缩倍数×制备容量（L）

二、培养基的制作

（一）母液取用量的计算

制备培养基时母液取用量（ml）=1000÷浓缩倍数×制备培养基数量（L）

（二）培养基制作程序

1、按大量元素、微量元素、铁盐、有机成分顺序将母液取出，混合。

2、适量蒸馏水放入加热容器，蒸馏水应少于所制培养基数量，约终体积的2/3-3/4，接通电源加热。

3、向加热容器中加入称量好的琼脂（0.6-0.8%），搅拌加热，至完全溶化。

4、琼脂熬化后，称取相应量的蔗糖（2-3%），加入加热容器中至溶解。

5、将母液混合液加入到加热容器中，搅拌混匀。

6、蒸馏水定容至所需体积。

7、测试培养基溶液的PH值（5.8-6.0），过高滴加0.1mol/L的HCL调整，过低滴加0.1mol/L的NaOH调整。

8、迅速分装到培养瓶中，备用。

三、培养基及培养器械的灭菌

制备好的培养基如果带菌，会导致植物离体培养失败，因而还要对培养基进行灭菌处理。

（一）高压蒸汽灭菌

培养基的灭菌一般采用湿热灭菌法：

1、培养瓶及培养器械放入高压灭菌锅。

2、灭菌锅加水至淹没电热丝。

3、封闭高压灭菌锅各出气口。

4、接通电源加压至49kPa（0.05MPa）5、打开排气阀，排冷气至压力0kPa。

6、继续加压至108kPa（0.11mPa-0.12Mpa，即121℃）7、压力至108kPa（0.11mPa-0.12Mpa，即121℃）时，稳压在此压力15-20min。

8、关闭电源自然冷却至压力为0kPa。

9、取出培养基和器械冷却，贮存于30℃以下室内。

（二）干热灭菌

培养瓶、三角瓶、试管等玻璃器皿及接种器械，可以进行干热灭菌。

即将洗涤干净的玻璃器皿放到烘箱中，在150℃温度下，干热灭菌1小时，或120℃下灭菌2小时。

灭菌完毕冷却后取出器械贮存。

贮存室要保持无菌、干燥、以免造成培养基的二次污染。

灭菌后的培养基一般应在2周内使用，时间过长易造成潜在的污染。

培养基灭菌后如果出现过多沉淀或琼脂不凝固等现象，该培养基不能继续使用，应查明原因重新配制。

第四节 外植体无菌接种

一、植物材料的培养与取材

外植体—是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料，是植物离体培养的基础材料。

1、外植体的来源

-生长在自然环境下的植物

-有目的地培育在温室控制条件下生长的植物

-无菌环境下已经过离体培养的植物

自然环境中生长的植株，一般带有微生物，甚至与某些微生物具有寄生关系，使植株具有内生菌。

取自这些植物的外植体，在培养过程中会有微生物滋生，从而影响培养效果。

多数情况下，应尽量使用温室或人工气候室控制培养的植物材料作为外植体来源，减少培养过程中的微生物感染概率。

同时，生长在控制条件下的植物可以保持培养料间的一致性，提高实验的可重复性，也便于培养技术的规范。

2、供体植株的管理

取自室外的外植体材料，供体植株的管理十分重要，这与外植体培养时的污染率密切相关。

植株管理中应注意：

⑴避免昆虫危害许多昆虫如蚜虫、螨类和飞虱是许多植物病虫害的传播媒介，会引起植物组织的潜在感染。

⑵注意防病尤其是真菌和细菌病害的侵染，取自感病植株的外植体，在培养中的污染率远远高于来自健康植株的外植体，必要时需使用化学药剂防治病害。

⑶控制湿度给供体植株浇水时应从根部给水，避免从上部浇水，以免上部形成易于病原侵染的湿度环境；尽可能降低温室湿度；取材前尽可能保持植株干爽。

1、材料取材

⑴材料选择

培养材料应选择有代表性的主要植物、选择性状优良的种质或特殊的基因型。

快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，花药培养应在花粉发育到单核期取材。

选取材料的大小一般在0.5-1.0cm之间。

胚胎培养或脱毒在0.5cm以下。

材料太大易污染，材料太小难于成活。

⑵采收

从生长健壮的无病虫害的植株上选取发育正常的器官和组织。

最好采用茎尖，后代性状较稳定，携带细菌较少。

二、预处理与表面灭菌

1、预处理

先对植物材料进行修剪整理，去掉不需要部分，将准备使用的植物材料（外植体）在流水中冲洗20-60分钟，备用。

如特别不洁的外植体，可先用加有洗涤剂的水清洗10-15分钟，再用流水冲洗干净。

2、表面灭菌

（1）操作人员穿戴灭菌过的工作服、口罩。

进入接种室前双手用洗涤剂清洗干净，操作前再用70%酒精或消毒剂擦洗双手。

（2）操作期间双手和台面常用70%酒精或消毒剂擦拭。

超净工作台使用前必须用紫外灯照射杀菌，然后开启风机。

（3）接种用工具（解剖刀、剪刀、镊子）可放入70-75%酒精中，使用时需火焰灼烧灭菌，冷却后使用。

（4）外植体放入超净工作台内，置70-75%酒精中5-60秒，0.1氯化汞6-10分钟，或10%的漂白粉上清液中10-15分钟，然后用无菌水冲洗3-5次。

灭菌时需进行搅动。

常用灭菌剂使用浓度及效果比较表

灭菌剂使用浓度持续时间去除的难易效果

次氯酸钙9-10％5-30分钟易很好

次氯酸钠2％5-30分钟易很好

氯化汞0.1-1％5-10分钟较难最好

抗菌素4-50mg／L30-60分钟中较好

酒精70-75%0.2-2分钟易好

过氧化氢10-12%5-15分钟最易好

三、外植体的接种—无菌接种

外植体的接种是把经过表面灭菌后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞、转放到无菌培养基上的全部操作过程。

整个过程均需无菌操作。

（1）借助接种用工具将材料切割分离。

（2）将培养基放入超净工作台内，火焰灼烧培养基瓶口，然后打开培养瓶口，置培养瓶为斜角，避免灰尘落入平中。

（3）迅速将切割分离下的所需组织、细胞、器官，放入培养基上，及时盖上瓶盖。

（4）工具用后应及时灭菌，避免交叉污染。

（5）工