整理siRNA 和miRNA.docx

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整理siRNA和miRNA

siRNA 和miRNA

[日期：

2008-06-18来源：

生化百科 作者：

admin]

       仅仅是DNA和蛋白质之间的“过渡”？

但越来越多的证据清楚的表明，RNA在生命的进程中扮演的角色远比我们早前设想的更为重要。

RNA干扰（RNAinterference）的发现使得人们对RNA调控基因表达的功能有了全新的认识，更因为可以简化/替代基因敲除而成为研究基因功能的有力工具，因此格外引人注意，在2002年度Science评选的10大科学成就中RNAi名列榜首。

随着对小分子RNA研究的不断深入，研究人员开始认识到：

小分子RNA的世界一点都不小。

有人推测：

小分子RNA可能代表一个新层次上的基因表达调控方式。

    小的干涉RNA（smallinterferingRNA;siRNA）和微小RNA（microRNA；miRNA）是两种序列特异性地转录后基因表达的调节因子，是小RNA的最主要组成部分，它们的相关性密切，既具有相似性，又具有差异性。

对小RNA的深入研究将使我们更深一步了解生命的奥秘。

本文主要介绍这两种小RNA分子及其作用机理。

siRNA介绍

   RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，通过这种方式，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉默，迅速阻断基因活性。

小的干涉RNA（siRNA）是在RNA干涉过程中人工体外合成的小片段RNA，由约20个碱基对组成，包括5个磷酸盐，2个核苷和3个悬臂。

SiRNA在RNA沉默通道中起中心作用，是对特定信使RNA（mRNA）进行降解的指导要素。

1999年，Hamilton等在植物基因沉默的研究中首次发现21～25nt的dsRNA的出现对转基因导致基因沉默十分重要，而在转基因正确表达的植株中则未出现。

随后，Hammond等进行的细胞提取物核酸酶活性实验证明了小分子RNA在RNAi中的作用，这些小分子RNA就是由dsRNA形成的siRNA。

siRNA的3´-末端2-nt的突出对靶点识别的特异性起一定的作用，可将其限定在第一个碱基对相邻的不成对碱基的位置。

两个研究小组以数以千计的人类和老鼠基因为目标创建RNAi库的进展，科学进展已清晰地表明：

在哺乳动物中利用小的干涉RNA和短发夹RNA（shorthairpinRNAs，shRNA）来进行RNA干涉以使基因沉默已经成为强大而有力的生物工具。

例如，在基因操作较困难的神经元中，也有成功进行RNAi的报道。

Krichevsky等将化学合成的21ntsiRNA通过阳离子脂类转染试剂导入原代培养的大鼠神经元，显著抑制内源靶基因和转染基因的表达。

抑制神经元NO合成酶表达能有效降低疼痛，在Korneev的实验中设计的双链RNA成功地抑制了中枢神经系统NO合成酶表达，获得RNA干扰的成功。

RNAi能在极低浓度（nmol范围）siRNA存在下显示出特殊有效性。

图1dsRNA可以沉默目标基因。

在植物中，通过注入人工合成的RNA病毒或者是插入反向重复序列可以诱导目标基因沉默。

在线虫中，沉默也可以用注射dsRNA的方式来诱导。

这两种生物体中，沉默是系统的并且传遍全身。

a）沉默信号从脉杆传到叶片组织。

绿色是绿色荧光蛋白；红色是叶绿素荧光，可以在绿色荧光蛋白被沉默后看出。

b,c）通过实验，使得线虫的核中表达绿色荧光蛋白。

实验者在左边加上对照dsRNA，右边加上绿色荧光蛋白的dsRNA。

一些神经元核仍然可以检测到荧光，对应于少量的蛋白质表达。

c）Hela细胞加上ORC6siRNA之后，针对微管蛋白（绿色）和DNA（红色）进行染色。

ORC6的去除导致多核细胞的积累。

稳定的沉默也可以通过表达发夹结构或者折回的双链RNA的表达来实现。

d）当和野生型的果蝇相比（右边），成体果蝇中表达控制白色基因的发夹同源物（左边）导致眼睛丧失色素。

miRNA介绍

   miRNA的研究起始于时序调控小RNA（stRNAs）。

1993年，Lee等在秀丽新小杆线虫（Caenorhabditiselegan）中发现了第一个可时序调控胚胎后期发育的基因lin-4，2002年，Reinhart等又在线虫C.elegan中发现第二个异时性开关基因let-7，2001年10月《science》报道了三个实验室从线虫、果蝇和人体克隆的几十个类似C.elegan的lin-4的小RNA基因，称为microRNA。

随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。

对一部分miRNAs的研究分析提示：

miRNAs参与生命过程中一系列的重要进程，包括发育进程，造血过程，器官形成，凋亡，细胞增殖，甚至是肿瘤发生（Kim,2005）。

   miRNAs是一种21－25nt长的单链小分子RNA，其结构特征如下：

广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，它本身不具有开放阅读框（ORF）；成熟的miRNA，5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。

成熟的miRNA5’端的磷酸基团和3´端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。

miRNA独有的特征是其5＇端第一个碱基对U有强烈的倾向性，而对G却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏U，一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C。

MiRNAs具有高度的保守性、时序性和组织特异性。

miRNAs的表达方式各不相同。

线虫和果蝇当中的部分miRNA在各个发育阶段都有表达而且不分组织和细胞特性，而其他的miRNA则表现出更加严谨的时空表达模式（amorerestrictedspatialandtemporalexpressionpattern）——只有在特定的时间、组织才会表达。

细胞特异性或组织特异性是miRNA的表达的主要特点，又如拟南芥中的miR-171仅在其花序中高水平表达，在某些组织低水平表达，在茎、叶等组织中却无任何表达的迹象；20-24h的果蝇胚胎提取物中可发现miR-12，却找不到miR3-miR6，在成年果蝇中表达的miR-1和let-7也无法在果蝇胚胎中表达，这同时体现了miRNA的又一特点——基因表达时序性。

MiRNA表达的时序性和组织特异性提示人们miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。

   在科研上，一个小RNA分子要成为miRNA，需要符合以下条件：

a）表达需要用Northern-blot来证实；b）小RNA分子必须是处在具发夹结构的前体RNA分子中远离环或膨胀部分的一端才行；c）小RNA分子必须在系统发育上具备相当的保守性。

d）前体RNA分子会在Dicer功能下降时积累起来（该项标准由于实践较难，只做参考）。

这些标准单独一条不足以证明一个未知小RNA分子是否就是是miRNA，具体地，如果小RNA分子符合上面的a（表达）和b（结构）两条标准；或者a（表达）和c（保守性）；如果表达量很低难以检测，那么如果可以用cDNA克隆的方法得到目标分子，并符合c（保守性）；小RNA分子如果不是通过cDNA克隆的方法得到的，那么就必须符合a（表达）和前体RNA分子结构和保守性的标准才行；如果小RNA分子被推测为miRNA，那么符合c（系统发育保守性）和d（累积性）标准也行；这样我们就可以认为该小RNA分子就是miRNA分子。

   寻找miRNA的方法：

这里我们简单看一下分子信息学的方法：

应用计算机的方法如MirScan来寻找miRNA分子已经在线虫及脊椎动物体内取得了巨大的成功。

2004年6月，吳政道在前述的计算机方法的基础上提出一种可以进行高通量筛选miRNA靶位点的方法。

用这种方法筛选miRNA的原理：

该方法的出发点为前体的发夹状结构及miRNA在物种间的保守性。

miRNA基因可能定位于编码蛋白基因的内含子区域（有意义链或反意义链）及远离任何已知基因的基因间区域。

一些时候，几个发夹状结构以多顺反子的形式丛集在一起.UweOhler,ChrisBurge等人给出了一些可以提高寻找miRNA基因的准确性的一些附加条件：

1）上游和下游保守序列的数量；2）候选发夹状结构的上游高度保守的模序的存在。

MIT的BartelandChrisBurge报道了一种可以用来探测miRNA与其作用的靶基因之间的关系的新的计算机的方法——TatgetScan。

他们针对已知的每一个miRNA，扫描mRNA的数据库——DNA转译为蛋白的生化信息，搜索与miRNA匹配的片段，然后对miRNA与mRNA的匹配程度评分，推测在三个或以上物种中获得高分的mRNA为该miRNA的靶基因。

 相同点/联系点

siRNA

miRNA

长度及特征

都约在22nt左右，5’端是磷酸基，3＇端是羟基

合成的底物

miRNA和siRNA合成都是由双链的RNA或RNA前体形成的

Dicer酶

『正确答案』B依赖Dicer酶的加工，是Dicer的产物，所以具有Dicer产物的特点

Argonaute家族蛋白

（2）规划编制机关在报送审批专项规划草案时，将环境影响报告书一并附送。

都需要Argonaute家族蛋白参与

《中华人民共和国环境保护法》和其他相关法律还规定：

“建设项目防治污染的设施，必须与主体工程同时设计，同时施工，同时投产使用（简称“三同时”）。

防治污染的设施必须经原审批环境影响报告书的环境保护行政部门验收合格后，该建设项目方可投入生产或者使用。

”“三同时”制度和建设项目竣工环境保护验收是对环境影响评价的延续，从广义上讲，也属于环境影响评价范畴。

RISC组分

安全评价是落实“安全第一，预防为主，综合治理”方针的重要技术保障，是安全生产监督管理的重要手段。

二者都是RISC组分，所以其功能界限变得不清晰，如二者在介导沉默机制上有重叠；产生了ontarget和offtarget的问题

2.辨识与分析危险、有害因素作用方式

都可以阻遏靶标基因的翻译，也可以导致mRNA降解，即在转录水平后和翻译水平起作用

进化关系

2.间接市场评估法可能的两种推论：

siRNA是miRNA的补充，miRNA在进化过程中替代了siRNA

2.早期介入原则； 

（3）对环境影响很小、不需要进行环境影响评价的建设项目，填报环境影响登记表。

不同点/分歧点

siRNA

miRNA

（2）辨识和分析评价对象可能存在的各种危险、有害因素，分析危险、有害因素发生作用的途径及其变化规律。

机制性质

（1）规划实施后实际产生的环境影响与环境影响评价文件预测可能产生的环境影响之间的比较分析和评估；往往是外源引起的，如病毒感染和人工插入dsRNA之后诱导而产生，属于异常情况

是生物体自身的一套正常的调控机制

直接来源

长链dsRNA

发夹状pre-miRNA

分子结构

siRNA是双链RNA，3‘端有2个非配对碱基，通常为UU

miRNA是单链RNA

对靶RNA特异性

较高，一个突变容易引起RNAi沉默效应的改变

相对较低，一个突变不影响miRNA的效应

作用方式

RNAi途径

miRNA途径

生物合成，成熟过程

由dsDNA在Dicer酶切割下产生;发生在细胞质中

pri-miRNA在核内由一种称为Drosha酶处理后成为60nt的带有茎环结构的PrecursormiRNAs（pre-miRNAs）；这些pre-miRNAs在转运到细胞核外之后再由Dicer酶进行处理，酶切后成为成熟的miRNAs；发生在细胞核和细胞质中

Argonaute（AGO）蛋白质

各有不同的AGO蛋白质

各有不同的AGO蛋白质

互补性（complementarity）

一般