胶体金标记关键技术.docx

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胶体金标记关键技术

胶体金标记技术

胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，应用于抗原抗体反映一种新型免疫标记技术。

由于它不存在内源酶干扰及放射性同位素污染等问题，且运用不同颗粒大小胶体金还可以作双重甚至多重标记，使定位更加精准。

因而已成为继荧光素、酶、同位素及乳胶标记技术之后一种新型标记技术。

现已广泛应用于电镜、流式细胞仪、免疫印迹、蛋白染色、体外诊断试剂制造等领域。

    用胶体金作为特殊标记物研究始于60年代初，1962年Feldberr等报道了用胶体金标记细胞进行电子显微镜研究。

1971年，Taylor又将胶体金引入电镜免疫标记技术中。

近年来研究表白，胶体金也可作为体外免疫加层实验批示物。

由于胶体金作为标记物具备诸多长处，因而自其问世以来，在国内外许多研究领域中得到了迅速发展。

    近年来，它更多被应用于免疫学和细胞学有关分子水平检测中。

特别随着人们物质生活改进，关于人类健康问题在现实生活中已显得非常突出。

从90年代至今多篇报道都是关于动物体或人体有关抗体和病原体检测。

制备办法

    在溶液中金颗粒呈圆形，边沿平整，界线十分清晰。

金颗粒表面带有大量负电荷，由于静电排斥力，使其在水中保持稳定状态，形成稳定胶体，因此称其为胶体金。

胶体金制作办法有白磷还原法，抗坏血酸还原法，柠檬酸三钠还原法和鞣酸—柠檬酸三钠还原法。

通过变化反映体系中氯金酸与还原剂比例（即增长或减少还原剂量）可得到所需不同直径金颗粒。

    但前两种办法制备得到金颗粒直径大小不均一，因此当前惯用后两种办法，以柠檬酸三钠还原法为例，有两种办法。

1．Frens原则办法：

1）取0.01%HAuCl4溶液50mL,加热煮沸，随后迅速加入1%柠檬酸三钠溶液0.5mL。

2）约过25s沸腾溶液变为淡蓝色，大概再过70s，蓝色突然转变为亮红色，

3）继续煮沸约5分钟后结束反映。

4）冷却后用0.1MK2CO3溶液调至所需PH值。

5）此后再延长反映时间或另加入额外柠檬酸三钠都不影响实验成果。

该法制备得到金颗粒直径约为41nm，如前所述要想得到更大或更小金颗粒，该办法依然可行，唯一不同是需要变化加入还原剂量。

此外，采用此原则办法所需反映时间最短。

2．Slot原则办法：

1）取1mL1%HAuCl4溶液溶于100mL水中，2）再加入2mL1%二水柠檬酸钠溶液。

3）将该混合溶液加热煮沸约15~30min，直至溶液颜色变为亮红色，

4）冷却后，用0.1MK2CO3溶液调节PH值，该法制备金颗粒直径约为15nm。

胶体金标记蛋白原理是：

在碱性条件下，胶体金颗粒表面带负电荷，可与蛋白质所带正电荷基团之间产生静电吸引而牢固结合，这种结合对所标记蛋白生物学活性无明显影响。

    胶体金免疫技术可大体分为液相胶体金标记技术和固相胶体金标记技术，其分类根据同酶免疫技术。

最早液相胶体金标记技术叫免疫金染色法（IGS），它仅以胶体金作为标记物和显色剂。

最初免疫金染色都采用单标记。

即采用大小均一金颗粒进行标记。

日后发展到可运用不同颗粒大小胶体金作双重标记甚至多重标记。

但该办法均仅以胶体金显色，需要较高浓度标记物，耗费抗体或抗原量较多，并且需要较大直径金颗粒（40-50nm），才干获得较高敏捷度，并且当金颗粒过大时，标记物不稳定，长期贮存容易发生自动汇集。

    为克服以上缺陷，免疫金银染色法（IGSS）应运而生。

该办法原理是，先用胶体金标记物作免疫金染色，再加入含银物理显影液，则银离子靠电荷吸引，大量吸附于金颗粒周边，使显色成果呈钞票属银蓝灰色，同步将显色信号进一步放大。

应用时，由于本法最后显色是靠金属银吸附沉积，因而不需要高浓度胶体金标记物，将胶体金标记物稀释几十倍，仍可获得同免疫金染色同样最佳效果。

这样不但可以节约大量抗体或抗原标记物，并且可以节约大量胶体金。

本办法敏捷度核心在于胶体金吸附银颗粒数量。

小直径胶体金比大颗粒胶体金能吸附更多银离子，并且小颗粒胶体金比大颗粒胶体金更为稳定。

因此，在同样能见度下，免疫金银染色法所需胶体金颗粒更为稳定。

因此在同样能见度下，免疫金银染色法所需胶体金颗粒也较小。

据Holgate称，免疫金银染色法敏捷度甚至比SternbergerPAP法还要高出诸多。

该办法一度存在重要问题在于背景染色过高，但1984年，Springgall等通过修改物理显影操作程序，已基本解决这个问题。

固相免疫胶体金标记技术浮现较晚，其原理与液相标记同样。

所不同只是通过不同办法最后将胶体金标记物吸附于固相支持物表面，近而进行检测。

    惯用固相免疫胶体金标记技术有胶体金免疫层析法和胶体金免疫渗滤法。

胶体金免疫层析法是依照层析原理，将胶体金标记抗原或抗体固定在层析用固相支持物上，通过层析作用，使抗原与抗体专一性结合。

胶体金免疫渗滤法是让抗原与胶体金标记过抗体分别滤过有一定孔径膜（惯用NC膜），在此过程中抗原与抗体专一性结合，未专一性结合抗体滤过膜。

两种办法都最后通过胶体金汇集产生颜色变化作为成果判断根据。

为了减少胶体金用量，经常通过银染加强显色。

应用

    免疫胶体金技术可以迅速，敏捷检测特定蛋白，这种技术避免了复杂操作，无需特殊检测仪器，可以适应各种检测环境，以及各种检测需要。

并且，检测成果可以长期保存，便于对照分析。

使检测更具备普遍性。

    免疫胶体金标记技术作为一种日臻完善检测技术，已被广泛应用于众多科研领域中。

本实验采用斑点免疫金—银染色法（Dot-Immuno-Gold-SilverStrainingMethod，Dot-IGSS），运用NC膜可以与带负电荷蛋白质产生较强疏水作用，从而使目的蛋白与NC膜产生较强亲和力特性，以及NC膜易于被封闭特点，使用NC膜作为固相载体。

先使被FMDV免疫过牛血清（含FMDV抗体蛋白）与NC膜结合，然后使用适当封闭液将NC膜未结合蛋白位点封闭，再用胶体金标记过抗FMDV抗体蛋白二抗与FMDV免疫过牛血清作用（运用抗原抗体特异性结合反映），将未特异性结合蛋白用PBN溶液和DDW洗脱。

最后，运用胶体金可以与银离子产生电荷吸引，通过银染加强显色效果（胶体金自身呈淡红色，银染后呈蓝黑色），使得可以通过肉眼直接观测成果。

本办法具备简便迅速，敏捷度高，可直接用肉眼判断成果，不必特殊设备长处。

胶体金制备 

  胶体金是氯金酸在还原剂作用下，聚合成一定大小金颗粒，形成带负电荷疏水胶溶液。

依照实验需要，可以运用不同还原剂制备成直径大小不同胶体金颗粒。

（一）白磷还原法

【试剂及材料】

（1）HAuCl4水溶液

（2）0.2mol/LK2CO3

（3）白磷乙醚饱和液：

在水中将白磷切成小片，用镊子迅速取出，在滤纸上吸干后，放入小瓶，迅速加入10ml纯乙醚，塞紧瓶口，轻轻摇动至少2h，使乙醚充分饱和，倒入玻璃离心管中离心，弃去沉淀物及未溶解白磷。

取上清贮存于密闭棕色瓶内。

【操作办法一】

（1）取0.01%HAuCl4水溶液100ml，用0.2mol/LK2CO3调节至pH7.2，加热煮沸；

（2）在刚开始煮沸时，迅速加入0.5ml白磷乙醚饱和液，摇匀，至溶液呈橙红色为止。

（3）此法制备胶体金颗粒直径为3nm，大小较均一。

【操作办法二】

（1）取1.5ml0.6%HAuCl4水溶液和1.4ml0.2mol/LK2CO3加至120ml双蒸水中；

（2）再加1ml白磷乙醚混合液，室稳搅拌15min；

（3）煮沸，回流至溶液由棕红色变为红色，约5min；

（4）此法制备胶体金颗粒直径为6nm。

（二）抗坏血酸还原法

【试剂及材料】

（1）HAuCl4水溶液

（2）0.2mol/LK2CO3（3）0.7%抗坏血酸水溶液

【操作办法】

（1）取1%HAuCl4水溶液1ml置烧杯内，用1.4ml0.2mol/LK2CO3及25ml双蒸水；

（2）混匀，置冰浴中，搅拌下加入1ml0.7%抗坏血酸水溶液，溶液呈紫红色；

（3）随后加蒸馏水至100ml，加热至溶液变为红色为止。

（4）此法制备胶体金颗粒直径为8-13nm。

（三）枸橼酸三钠还原法

【试剂及材料】

（1）HAuCl4水溶液

（2）1%枸橼酸三钠水溶液（3）0.2mol/LK2CO3

【操作办法一】

（1）取0.01%HAuCl4水溶液100ml置于烧杯内；

（2）加入3ml1%枸橼酸三钠水溶液，加热煮沸30min，冷却至4℃，溶液呈红色；

（3）此法制备胶体金颗粒直径为10nm，大小均一。

【操作办法二】

（1）取0.01%HAuCl4水溶液100ml置于烧杯内；

（2）加入2ml1%枸橼酸三钠水溶液，加热煮沸15-30min，直至溶液呈红色；

（3）冷却后，加入0.5ml0.2mol/LK2CO3混匀。

（4）此法制备胶体金颗粒直径为15nm，大小均一。

【操作办法二】

（1）取0.01%HAuCl4水溶液100ml置于烧杯内，加热煮沸；

（2）依照需要加入2.5ml、1ml或0.75ml1%枸橼酸三钠水溶液，继续加热煮沸5min，直至溶液呈橙红色；

（3）此法制备胶体金颗粒直径分别为18-20nm、30nm或50nm，大小均一。

【注意事项】

（1）玻璃器皿必要严格清洗，绝对干净后干烤。

最佳通过硅化解决，或用第一次配制胶体金稳定玻璃器皿表面后，再用双蒸水清洗后使用。

否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后胶体金颗粒稳定性，不能获得预期大小胶体金颗粒。

（2）所有试剂均需要使用双蒸水或三蒸水配制，最佳用微孔滤膜（0.45um）过滤，以去除其中聚合物和其她也许混入杂质.

（3）配制胶体金溶液pH值以中性为宜。

将氯金酸配制成1%HAuCl4水溶液，在4℃可保存数月稳定。

胶体金标记蛋白制备 

【基本原理】

   胶体金标记实质上是抗体蛋白等生物大分子被吸附到胶体金颗粒表面包被过程。

吸附机理也许是胶体金表面所带负电荷与蛋白质分子所带正电荷之间靠静电力互相吸引，达到范德华引力内即形成牢固结合。

此外，胶体金颗粒粗糙也是有助于形成吸附重要条件。

由于这种标记过程重要是靠物理吸附作用，因而对蛋白质分子生物学活性没有明显影响。

【试剂及材料】

（1）胶体金溶液

（2）待标记蛋白（3）0.1mol/LK2CO3（4）1%聚乙二醇（PEG，分子量20KD）（5）0.05mol/L，pH9.0硼酸盐缓冲液（6）10%NaCl溶液（7）超速离心机

【操作办法】

（1）待标记蛋白质前解决    将待标记蛋白溶液预先对0.05mol/L，pH7.0NaCl4℃透析过夜，去除多余盐离子，再经10000g4℃离心1h，去除聚合物。

（2）胶体金溶液前解决   胶体金对蛋白质吸附重要取决于pH值，在接近蛋白质等电点或略偏碱pH条件下，两者容易形成牢固结合物。

如果胶体金pH值低于蛋白质等电点时，则会汇集而失去结合能力。

因而预先调节胶体金pH值尤为重要（用0.1mol/LK2CO3或0.1mol/LHCl）

①标记IgG时，胶体金溶液pH值调节至9.0；②标记McAb时，胶体金溶液pH值调节至8.2；③标记亲和层析抗体时，胶体金溶液pH值调节至7.6；④标记SPA时，胶体金溶液pH值调节至5.9-6.2；⑤标记亲和素时，胶体金溶液pH值调节至9.0-10.0；⑥标记链霉亲和素时，胶体金溶液pH值调节至7.4或6.6；

（3）待标记蛋白质与胶体金用量比例拟定   ①依照标记蛋白质规定，调节胶体金溶液pH值后，分装10管，每管1ml；②将待标记蛋白质（以IgG为例）用0.05mol/L，pH9.0硼酸盐缓冲液作系列稀释为5-50mg/ml，分别取1ml加入1管胶体金溶液中.对照组加1ml稀释液（不含蛋白质），混匀；③放置5min后，在上述各管内加入0.1ml10%NaCl溶液，混匀静置2h，观测成果；④未加蛋白质（对照管）和加入蛋白质量局限性以稳定胶体金各管，呈现由红色变为兰色汇集现象；而如果蛋白质量达到或超过最低稳定量各管仍保持红色不变。

其中含蛋白质最低试管即为稳定1ml胶体金所需蛋白质量，在此基本上再加10%-20%，即为待标记蛋白（IgG）实际用量。

（4）胶体金与蛋白质结合

下面分别简介抗体、葡萄球菌A蛋白与胶体金结合操作过程。

①抗体蛋白（IgG）标记   A）按上述办法拟定两种试剂最合用量后，分别取所需量胶体金和相应抗体蛋白（IgG），用用0.1mol/LK2CO3调节pH值至9.0；B）在搅拌下将胶体金溶液和抗体蛋白液混合；C）10min后，加入一定量稳定剂，以防止抗体蛋白和胶体金聚合和发生沉淀。

惯用5%BSA，使其终浓度为1%，或加入1%聚乙二醇至标记总量10%；

②葡萄球菌A蛋白（SPA）标记   A）取高纯度SPA溶于0.1-0.2ml蒸馏水中，B）将胶体金溶液pH值调至6.0；C）按如下组合将SPA与胶体金混合：

  30mgSPA，加入10ml15nm胶体金溶液；  60mgSPA，加入10ml3nm胶体金溶液；  80mgSPA，加入10ml8-13nm胶体金溶液；D）混合3min后，没25mlSPA-胶体金结合物内加入1ml1%PEG溶液。

（5）胶体金标记蛋白纯化（超速离心法）

    依照胶体金颗粒大小、标记蛋白种类及稳定剂不同，选用不同离心速度：

①以BSA作稳定剂胶体金-羊抗鼠IgG结合物   A）先低速离心，弃去汇集胶体金颗粒，普通为5nm用9000r/min离心20min；20nm用r/min离心20min；B）再高速离心：

5nm胶体金结合物，60000g，4℃离心1h；20-40nm胶体金结合物，14000g，4℃离心1h；C）仔细吸去上清，沉淀物用含1%BSA0.01mol/L，pH7.6PB混悬至原量；D）平衡过夜后，同上重复离心2次，最后用1%BSA0.01mol/L，pH7.6PB（0.02%NaN3）混悬至原量1/10，分装，4℃保存。

结合物内加50%甘油可贮存于-18℃一年以上。

②以PEG为稳定剂胶体金-SPA结合物   A）高速离心：

3-5nm胶体金结合物，100，000g，4℃离心1.5-2h；8-13nm胶体金结合物，80，000g，4℃离心1h；15nm胶体金结合物，60，000g，4℃离心45min-1h；B）仔细吸去上清，沉淀物用0.01mol/L，pH7.6PBS混悬至原量；C）同上重复离心2次，以保证除净未结合SPA，最后用0.01mol/L，pH7.6PBS（0.02%NaN3）混悬至原量1/20，分装，4℃保存。

结合物可保存数年。

（6）胶体金-蛋白结合物质量鉴定

①胶体金颗粒平均直径测定②胶体金-蛋白质溶液OD520nm值测定：

普通应用液OD520nm值应为0.2-0.4。

③金标蛋白特异性与敏感性测定：

见胶体金标记技术应用。

斑点免疫金银染色法（dot-IGS/IGSS）

1984年，Moeremans等将斑点酶联免疫吸附法（dot-ELISA）与免疫金银染色法相结合，建立了固相载体上斑点免疫金银染色法（dot-IGS/IGSS）。

 【基本原理】

蛋白质抗原通过直接点样或转移电泳吸附在硝酸纤维素膜（NC膜）上，与特异性抗体反映后，在滴加（或浸入）胶体金标记第二抗体，成果在抗原抗体发生金颗粒汇集，形成肉眼可见粉红色斑点，称为斑点免疫金染色（dot-IGS）。

此反映可再提高银显色液增强，即斑点免疫金银染色法（dot-IGS/IGSS）。

 【试剂及材料】

（1）NC膜

（2）20mol/L，pH7.6 PBS（3）BSA（4）定影液：

20%硫代硫酸钠。

（5）电泳仪和电转仪（6）其他试剂同上

 【操作办法】

（1）用微量加样器在NC膜上直接点样1-2ml（若抗原含量少，可重复点样），或经转移电泳将抗原吸附在NC膜上，自然干燥；

（2）将点样后NC膜浸入含5%BSA和0.05%NaN320mol/L，pH7.6PBS内，37℃，30min，以封闭未饱和蛋白质结合位点；

（3）用含0.1%BSATBS洗三次，每次5min；滴加恰当稀释一抗（1-2mg/ml，用含0.1%BSA和正常羊或兔血清TBS稀释），阴性对照用稀释液代替抗体，在室温下，反映2h；

（4）用含0.1%BSATBS洗三次，每次5min后，将NC膜浸入金标二抗溶液中（金标抗体用含0.4%明胶和0.1%BSATBS恰当稀释）。

反映时间视金标抗体稀释度而定：

普通1：

25稀释（OD520nm值约为0.2），反映时间为2h；1：

100-1：

200稀释（OD520nm值约为0.005），反映时间为16h；

（5）TBS冲洗，即可观测成果。

此过程为dot-IGS。

（6）需要是可继续进行银显色反映，行dot-IGSS：

将金标抗体染色后NC膜，用TBS洗三次，每次5min，再用蒸馏水洗涤两次以去除Cl—，浸入0.2mol/L，pH3.5枸橼酸缓冲液内2min；

（7）移入银显色液中，避光显色5-10min后，再移入定影液中，定影5min；

（8）自来水冲洗，自然干燥； 

【成果观测】   dot-IGS：

在NC膜上呈粉红色；dot-IGSS：

在NC膜上呈棕黑色。

彩色免疫金银染色法

【基本原理】彩色免疫金银染色法是抗原位点处生成银颗粒经铁氰化钾与溴化钾作用被氧化成溴化银，后者与彩色显影剂反映被还原成金属银，而彩色显影剂自身则被氧化，其氧化产物使彩色还原剂由无色变为有色染料并沉积在银颗粒部位，金属银变成银离子。

【试剂及材料】

（1）Lugol’s碘液

（2）含5%硫代硫酸钠和1%亚硫酸钠溶液（3）2%铁氰化钾和1%溴化钾溶液（4）别的试剂同上

 【操作办法】

（1）石蜡切片常规脱蜡水合（细胞甩片、爬片或冰冻切片固定后用TBS洗）；

（2）依次与0.1%胰蛋白酶，37℃，消化30min；Lugol’s碘液5min；5%硫代硫酸钠1min；TBS洗5min；

（1）  加1%卵蛋白，室温15min，TBS洗5min；加恰当稀释一抗，置湿盒内，4℃过夜；

（2）  TBS洗三次，每次5min，加1%卵蛋白，室温15min；

（3）  TBS洗5min，加恰当稀释胶体金标记二抗，置湿盒内，4℃过夜；

（4）  TBS洗三次，每次5min，再用蒸馏水洗后，将切片放入硝酸银显色液，避光显色5-10min；

（5）  用蒸馏水冲洗，2%铁氰化钾和1%溴化钾作用1min；

（6）  用蒸馏水冲洗，彩色显色液显影；

（7）  用蒸馏水冲洗，依次与2%铁氰化钾和1%溴化钾作用1min；5%硫代硫酸钠和1%亚硫酸钠作用5min，自来水冲洗，缓冲甘油封片；

 【成果观测】   镜检，抗原抗体反映处呈兰色（a-萘酚）或绿色（菲尼酮）。

免疫金银染色法（immunogold-silvertaining，IGSS）

 【基本原理】

   免疫金银染色法是运用银显影液，胶体金颗粒起着液化作用，使显影液中银离子在还原剂（对苯二酚）存在状况下被还原成银原子，在金颗粒周边形成一种“银壳”，由于金颗粒液化作用，使更多银离子被还原，“银壳”增大，最后使抗原位置得以放大。

【试剂及材料】

（1）0．5%胰蛋白酶或胃蛋白酶：

用0.05mol/L，pH7.4配制TBS

（2）1%卵蛋白：

用0.05mol/L，pH7.4配制TBS

（3）0.05mol/L，pH7.4TBS

（4）一抗和金标二抗

（5）pH3.5枸橼酸缓冲液；枸橼酸2.25g，枸橼酸三钠2.35g，加蒸馏水100ml溶解即成。

（6）硝酸银显色液：

1%明胶液60ml，pH3.5枸橼酸缓冲液10ml，对苯二酚溶液30ml（1.7g对苯二酚溶于30ml蒸馏水中），磁力搅拌混匀，临用前加入含42.5mg硝酸银水溶液2ml。

 【操作办法】

（1）石蜡切片常规脱蜡水合（细胞甩片、爬片或冰冻切片固定后用TBS洗）；

（2）于细胞、组织上铺满0.5%胰蛋白酶，37℃，消化30min，有些抗原较强切片可不经这一步解决；

（3）TBS洗，加1%卵蛋白，室温15min；

（4）TBS洗5min，加恰当稀释一抗（大概25ml），置湿盒内，4℃过夜；

（5）TBS洗三次，每次5min，加1%卵蛋白，室温15min；

（6）TBS洗5min，，加恰当稀释胶体金标记二抗，置湿盒内，4℃过夜；

（7）TBS洗三次，每次5min，再用蒸馏水洗；

（8）将切片放入硝酸银显色液，避光显色5-10min；

（9）用蒸馏水洗，常规脱水、透明、中性树胶封片；

 【成果观测】   镜检，抗原抗体反映处呈棕黑色。