脑缺血再灌注损伤后氧化应激对自噬调控机制的研究学位论文.docx
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脑缺血再灌注损伤后氧化应激对自噬调控机制的研究学位论文
上海交通大学医学院2008级硕士研究生学位论文脑缺血再灌注损伤后氧化应激对自噬调控机制的研究
导师姓名：
卞留贯教授
研究生姓名：
王文静
学号：
1087209099
专业：
神经外科学
答辩时间：
2010年5月
上海交通大学医学院2008级硕士研究生学位论文脑缺血再灌注损伤后氧化应激对自噬调控机制的研究
导师姓名：
卞留贯教授
研究生姓名：
王文静
学号：
1087209099
专业：
神经外科学
0究方向：
脑缺血再灌注损伤
0键词：
脑缺血再灌注；自噬；氧化应激；Beclin1；
LC3；NAC
申请学位级别：
硕士
0辩时间：
2010年5月
0养单位：
上海交通大学医学院附属瑞金医院基金资助：
上海市科委重点课题资助项目
（项目编号：
09JC1409700;10JC1410700）
上海市科委生物医药重点课题资助项目（项目编号：
10411954200）
上海交通大学学位论文原创性声明
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所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行
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除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含
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本人完全意识到
本声明的法律结果由本人承担。
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日期：
年月日
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被查阅和借阅。
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保密□，在年解密后适用本授权书。
本学位论文属于
不保密□。
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学位论文作者签名：
指导教师签名：
日期：
年月日日期：
年月日
上海交通大学硕士学位论文
脑缺血再灌注损伤后氧化应激对自噬调控机制的研究
0要
目的探讨缺血再灌注损伤后早期自噬激活的作用机制及氧化应
激对早期自噬变化的调控，探讨抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸
（N-acetyl-L-cysteine，NAC）和自噬诱导剂雷帕霉素（Rapamycin）在缺
血性脑血管疾病方面的应用价值，为缺血性脑血管疾病新的药物治疗提
供理论依据。
方法采用线栓法制作小鼠短暂性大脑中动脉闭塞（temporary
middlecerebralarteryocclusion，tMCAO）模型。
实验分为假手术组（sham
组）、缺血再灌注组（ischemia/reperfusion，I/R组）。
后者随机分tMCAO+
生理盐水、tMCAO+rapamycin和tMCAO+NAC。
tMCAO+rapamycin组于
术前20分钟侧脑室立体定向注射rapamycin，tMCAO+NAC组于脑缺血术
后立刻腹腔注射NAC，tMCAO组于脑缺血术后立刻腹腔注射同容积生理
盐水。
在脑缺血60分钟后，分别再灌注1小时，3小时，6小时，12小时，
24小时，Westernblot检测缺血侧皮质和纹状体自噬相关蛋白LC3I、LC3
II和Beclin1的表达。
利用双氢溴乙啶（Dihydroethidium，DHE）染色检测细
胞内ROS水平及对自噬活性的影响，借助荧光显微镜观察NAC或雷帕霉
素（Rapamycin）条件下的自噬变化。
NAC和Rapamycin分别干预缺血再灌
I
上海交通大学硕士学位论文
注24小时小鼠，脑片2,3,5-氯化三苯四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium
chloride，TTC）染色观察脑梗塞面积。
结果与假手术组比较，缺血再灌注损伤后1小时Beclin1开始升高，
6小时LC3II/LC3I开始升高。
与对照组相比，NAC干预后LC3II/LC3I
和Beclin1表达趋势明显升高。
DHE染色结果显示缺血再灌注损伤1小时
后即开始出现ROS活性增高，经NAC处理后可被部分抑制。
TTC染色提
示NAC或rapamycin处理后可减小梗塞面积。
结论本结果提示小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后自噬表达上调
可能是一种保护机制，氧化应激的激活与自噬表达相互影响，抗氧化剂
或自噬诱导剂可以通过激活细胞的自噬途径保护神经细胞，减小脑梗塞
面积，减轻缺血神经元的损伤。
关键词：
缺血再灌注损伤，氧化应激，自噬，LC3，Beclin1，NAC
II
上海交通大学硕士学位论文
THEREGULATIONOFOXIDATIVESTREEONAUTOPHAGYAFTERCEREBRALISCHEMIAREPERFUSIONINJURY
ABSTRACT
ObjectiveTodiscusstheactivationofautophagyandchangesofearly-phaseautophagyinwhichthemechanismsofreactiveoxygenspecies（ROS）involved.DiscovertheAntioxidantN-acetylL-cysteine（NAC）ortheautophagyinducerrapamycininischemiccerebrovasculardiseaseoftheapplication.
MethodsThetemporaryfocalcerebralischemiawasinducedbyocclusionoftheleftmiddlecerebralarterybyapplyingamodifiedintraluminalfilamenttechnique.Animalsweredividedintoshamgroupandischemia/reperfusiongroup（ischemia/reperfusion,I/R）（+saline）,thelatterdividedintotemporarymiddlecerebralarteryocclusion（tMCAO）group,tMCAO+NACgroupandtMCAO+rapamycingrouprandomly.tMCAO+NACgroupwastreatedbyintraperitonealinjectionofNACafterMCAO,thenrapamycinwasinjectedintracerebroventricular20minbeforeMCAO.After60minutesinfocalcerebralischemia,thereperfusionwasperformedat1,3,6,12and24h.TheexpressionofLC3I,LC3IIandBeclin1inthecortexandstriatumafterischemia-reperfusionweredeterminedbyimmunoblottinganalysisateachtimepoint.ThelevelofROSwasdetectedbystainingtechniquewithdihydroethidium（DHE）.EffectsofantioxidantN-acetyl-L-cysteine（NAC）orrapamycinonantophagywereevaluatedusingfluorescencemicroscope.Thetotalinfarctvolumeofsliceswasdeterminedby2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride（TTC）stainingafter24hreperfusion
III
上海交通大学硕士学位论文
undertheconditionsoffocalcerebralischemiaanddurgadminstration
ResultsComparedwiththesham-operatedgroup,theexpressionofBeclin1andLC3II/LC3Iwasincreasedatthepointof1hand6hafterfocalischemiareperfusionrespectively,whileupregulationtreatedbyNAC.TheresultsofDHEstainingwerethatthelevelofROSenhancedat1hafterfocalischemiareperfusion,whiledownregulatedafterreceivedinjectionsofNAC.AccordingtoTTCstaining,thetreatmentwithNACorrapamycinpreventedtheexpansionoftheinfarct.
ConclusionThedegreeofautophagyandROSwereup-regulatedafterfocalischemia-reperfusioninjury,whichmaybeakindofprotection.Mutualinfluencehappendedbetweenactivationofoxidativestressandautophagy.Antioxidantsorrapamycinpossiblyincreasedtheexpressionofautophagytoprotectneuronsandattenuatedischemicneuroninjury.
KEYWORDSreperfusioninjury,oxidativestress,autophagy,LC3,Beclin1,NAC
IV
上海交通大学硕士学位论文
目录
中文摘要Ⅰ
英文摘要Ⅲ
缩略语表Ⅵ
论文正文
第一部分:
脑缺血再灌注损伤后自噬相关蛋白的表达及调控机制
引言1
材料与方法7
实验结果16
讨论23
参考文献28
第二部分：
局部脑缺血再灌注损伤后ROS激活及对自噬调控
引言31
材料与方法36
实验结果40
讨论53
参考文献57
附录60
致谢71
攻读学位期间发表的学术论文目录72
V
上海交通大学硕士学位论文
缩略语表
缩略词
英文全称
中文全称
AMPK
5'-AMP-activatedproteinkinase
5'-AMP激活
性蛋白激酶
ATG
Autophagy-relatedgene
自噬相关基
因
3-MA
3-methyladenine
三甲基腺嘌
呤
BH
Bcl-2homology
Bcl-2同源结
构域
BSA
Bovineserumalbumin
牛血清白蛋
白
CMA
Chaperone-mediatedautophagy
分子伴侣介
导的自噬
CNS
Centralnervesystem
中枢神经系
统
DHE
Dihydroethidium
双氢溴乙啶
DTT
Dithiothreitol
二硫苏糖醇
EDTA
Ethylenediaminetetraaceticacid,disodium
乙二胺四乙
酸二钠
EGTA
Ethyleneglycol-bis（β-aminoethyl）-N,N,
乙二醇双（2-
N’,N’-tetraaceticacid
氨基乙基）四
乙酸
HEPES
N-2-hydroxyethyl-piperazine-N’-2-ethanesulfonic
N-2-羟乙基
acid
哌嗪-N’-2-乙
磺酸
HNE
4-hydroxy-2-nonenal
4-羟基-2-丙
烯醛
JNK
C-JunN-terminalkinase
c-Jun氨基端
激酶
LC3
Microtubule-associatedprotein1lightchain3
微管相关蛋
白轻链3
MAPK
Mitogen-activatedproteinkinase
丝裂原活化
蛋白激酶
NAC
N-acetylcysteine
N-乙酰-L-半
胱氨酸
O.D.
Opticaldensity
光密度
VI
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PAGE
Polyacrylamidegelelectrophoresis
聚丙烯酰胺
凝胶电泳
PBS
Phosphatebufferedsaline
磷酸盐缓冲
液
PCD
ProgrammedCellDeath
程序性细胞
死亡
PI3K
ClassIIIphosphatidylinositol3-kinase
Ⅲ型磷脂酰
肌醇三磷酸
激酶
PMSF
Phenylmethylsulfony1fluoride
苯甲基磺酰
氟
PNPP
P-nitrophenylphosphate
对硝基苯磷
酸
PVDF
Polyvinylidenedifluoride
聚偏二氟乙
烯膜
ROS
Reactiveoxygenspecies
活性氧
SDS
Sodiumdodecylsulfate
十二烷基硫
酸钠
TEMED
N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine
四乙基乙二
胺
tMCAO
Temporarymiddlecerebralarteryocclusion
短暂性大脑
中动脉闭塞
TORkinase
Targetofrapamycinkinase
雷帕霉素靶
点激酶
TBI
TraumaticBrainInjury
创伤性脑损
伤
Tris
Tris（hydroxymethyl）aminomethane
三（羟甲基）氨
基甲烷
TTC
2,3,5-Triphenyltetrazoliumchloride
2，3，5-氯化
三苯四氮唑
Tween-20
Tween-20
吐温-20
VII
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第一部分：
脑缺血再灌注损伤后自噬相关蛋白的表达及
调控机制
引言
脑血管疾病是神经系统的常见疾病和多发病，是人类严重病残和死亡的重要原
因之一，其中又以缺血性脑血管疾病的发病率居首位。
流行病学调查显示缺血性脑
卒中的发病率大约为2.5‰～4‰，死亡率为3‰。
严重的后遗症及很高的死亡率一
直困扰着医疗界，多年来缺乏新型的有效治疗药物。
自噬作为存在于真核细胞内的
一种溶酶体依赖性的胞内降解途径，与神经元存活/死亡密切相关，其在脑缺血再
灌注损伤过程中参与的复杂调控机制已经成为目前神经系统疾病研究的重点之一。
1.自噬
1.1自噬的概念
脑缺血可以引起大脑神经元不可逆性损伤和死亡。
在细胞死亡的过程中，可能
发生凋亡性程序性细胞死亡（Apoptosis），自噬性程序性细胞死亡（Autophagy）和细
胞坏死（Nercrosis）三种类型[1]。
凋亡的主要形态学特征表现为细胞皱缩，染色质
边集，核DNA降解，残余的细胞被吞噬细胞消化，被称为Ⅰ型程序性细胞死亡。
近年来，另一种新的细胞死亡方式—自噬性程序性细胞死亡吸引了科学家们的关注
被称为II型程序性细胞死亡。
通过电镜可以看到膜状结构的自噬体和其他亚细胞
结构以及荧光显微镜观察到点状聚集物的形成（如图1所示）。
自噬这一概念最早
由ChristiandeDuve于1963年提出，一份全新的国际性杂志《Autophagy》已在
2005年4月份出版，2007年召开第一次自噬国际会议。
针对目前自噬检测缺乏统
一标准的问题，《Autophagy》杂志在2008年第二期，刊登了主编Daniel联合世
界上200多名自噬研究领域专家撰写的综述文章―Guidelinesfortheuseand
interpretationofassaysformonitoringautophagyinhighereukaryotes‖。
目前，自噬继
凋亡之后已逐渐成为学科各领域研究的重要发展方向。
1
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图1自噬电镜及荧光显微镜的图片
Figure1Imagesofelectronmicroscopyandfluorescencemicroscopyinautophagy
1.2自噬的形成及分类
1.2.1自噬的形成过程
自噬首先通过粗面内质网的非核糖体区域、高尔基体等来源的自噬体膜脱落形
成杯状分隔膜，包绕在被降解胞质内容物周围，分隔膜逐延伸，将要被降解的胞浆
成分完全包绕形成自噬体（autophagosome），自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体并
借助于蛋白水解酶降解其内成分，之后自噬体膜脱落再循环利用[2]（如图2所示）。
图2自噬体的形成过程NatRevDrugDiscov2007,6:
304-312
Figure2TheformationprocessofautophagosomeNatRevDrugDiscov2007,6:
304-312
2
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1.2.2自噬的分类
根据细胞物质运送到溶酶体内的途径不同，已确定自噬主要有3种形式：
大自噬、
小自噬和分子伴侣介导的自噬[3]。
大自噬（Macroautophagy），又称巨自噬，即我们通常所指的自噬，是非溶酶体来源的双层膜结构包裹胞浆内容物和变性坏死的细胞器形成自噬体，接着是在细胞骨架蛋白驱动下自噬体与溶酶体的融合，形成自噬溶酶体，溶酶体利用自身的蛋白水
解酶降解自噬体内细胞物质。
大自噬通常在外界环境压力或者内环境变化刺激下激
活，一方面利用降解成的核苷、氨基酸和脂肪酸合成新的大分子和ATP，维持细胞
的正常代谢和生存，另一方面它可以选择性地清除某些细胞成分，维持细胞自我稳
态。
自噬相关蛋白的发现可以让我们使用分子生物学手段以这类蛋白为靶点来调控
自噬，从而搞清楚巨自噬在病理条件下所起的作用[4]。
小自噬（Microautophagy）又称微自噬。
与大自噬不同，小自噬通过溶酶体膜自身
变形来包裹和降解胞浆内容物。
小自噬主要参与细胞在正常情况下细胞器的降解[5]，
此外小自噬还可以选择性降解细胞内多余的细胞器，如某些药物可以诱导过氧化物
酶体增生，而小自噬则可以选择性的降解这种细胞器来维持细胞器的正常数目[6]。
由
于目前还没有很好的手段来调控小自噬，还不清楚这种自噬在人类疾病中所起的作
用。
分子伴侣介导的自噬（Chaperone-mediatedautophagy,CMA）与前两者不同，没有
形成膜性结构的过程即不发生囊泡转运，其典型特点是具有选择性。
首先由胞浆中
分子伴侣识别底物蛋白分子的特定氨基酸序列并与之结合后，溶酶体腔中的另外一
种分子伴侣介导底物在溶酶体膜的转位，进入溶酶体腔中的底物在水解酶作用下分
解为其组成成分，被细胞再利用[7]。
2.自噬的调控机制
2.1参与自噬体形成的两个泛素样蛋白系统
在哺乳动物细胞自噬的自噬泡形成过程中与自噬相关基因（ATG）有关，即依
赖于两个泛素样结合系统——Atg12-Atg5和Atg8系统。
Atg蛋白根据功能的不同分
为四类：
（1）Atg1复合体，整合TOR激酶的信号，该复合体参与自噬体形成的起始、
3
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成核、延伸[8]。
（2）Beclin1/PI3K（Vps34）复合体，参与自噬的成核阶段[9]。
（3）两条泛
素样接合系统，Atg12和LC3（LC3与酵母Atg8蛋白同源）。
在自噬体形成的起始阶
段，Atg12结合Atg5，并促进LC3与磷脂酰乙醇胺的结合来促进自噬体的延伸[10]。
（4）Atg1和Atg9调控的再循环通路。
Atg1和Atg9蛋白调控其他Atg蛋白在自噬体
形成过程中在自噬体内外的穿梭作用[11]。
其中Atg3、Atg5、Atg7、Atg10、Atg12和
LC3（microtubule2associatedprotein1lightchain3,MAP12LC3）参与组成了这两
条泛素样蛋白加工修饰过程。
Atg12首先由E1酶Atg7活化，之后转运至E2酶Atg10，最后与Atg5泛素化结合，形成Atg12-Atg5复合物也称为自噬体前体
（autophagosomalprecursor）。
这一复合物结合于形成中的自噬小体的外膜，帮助其
延伸，在自噬小体完全形成后即脱落。
另一泛素样结合系统包含Atg8及其靶向分
子磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine，PE）。
Atg4是一种半胱氨酸天冬氨酸酶，
它首先将
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