液相色谱仪基本配置和注意事项.docx
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液相色谱仪基本配置和注意事项
液相色谱仪基本配置和注意事项
一、液相色谱仪的基本配置和构成有：
液相泵、色谱柱、检测器数据处理、进样器、柱温箱。
二、液相基本组成
1、输液泵
2、进样单元
3、分离单元（色谱柱）
4、检测器
三、常用液相单元的故障及解决
1、输液泵
2、手动进样阀
3、色谱柱
4、检测器
（一）输液泵的操作
液相色谱输液泵一般由入口单向阀、出口单向阀、注塞杆、泵密封圈等组成，是液相色谱的重要组成部分，要保持泵的良好操作规程。
必须维护系统的清洗，保证溶剂的纯度：
（1）用高纯度的试剂和HPLC级溶剂
（2）过滤流动相和溶剂
（3）脱气
（4）再次使用前放空脱气，工作结束从泵中洗去缓冲液（最好另外清洗柱塞）
（5）不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中
（6）定期更换泵垫圈
（7）查阅有关泵的操作手册
（二）手动进样阀
1、正确的进样方式
（1）手动进样阀在INJECT位置：
把取存试液的进样针导入进样孔，直到插入为止（必须穿过转子密封圈聚四氯乙烯套管）；
（2）转动手柄到load位置：
把试液放入阀体中的定量环里；
（3）同时转动手柄到INJECT位置：
试液进入液路。
2、进样前样品处理及注意事项
（1）须用专用平头液相专用注射器进样（禁用气相尖头进样针）；
（2）进样试液应无颗粒、浑浊和乳化，使用前先用超声波溶解后，须用0.45um的过滤膜过滤；
（3）部分装取样时，取样体积一般小于定管的50%，完全装液相取样体积取必须是定量环的5倍以上（特别是高要求分析中外标定量）；
（4）如流动相使用缓冲盐（或酸性、碱性）在使用结束时必须用蒸溜水在load和INJECT位置反复冲洗干净，因盐析出会损害转子、定子密封圈；
3、进样阀故障及维护
（1）在进样针与进样阀不相配（针外径偏小）情况，可以用铅笔的橡皮头将针导管压入少许，使密封环变小达到严格密封；
（2）转子密封圈漏液的维护：
①转子密封圈少量漏液，拧松手柄六角螺钉，手柄沿轴方向送进，使手柄里的突出部嵌入压力调整螺钉缺口，旋转手柄1/20圈，直到不漏液为止；
②转子密封圈损坏，通过方法①还漏液则需要更换转子密封圈。
拧下三个定子螺钉，从主体上卸下转子密封圈，用手柄拧松压力调整螺钉半圈（☆）安装上三个定子螺母均等地牢牢拧紧，再来调整压力螺丝拧到原来红色标记位置。
（三）液相色谱柱
1、正确的使用方法
（1）进样的试样最好称量，超声波溶解，样品过滤器过滤后进入色谱；
（2）在有条件情况下，最好一个样品使用一支色谱柱，可延长柱使用寿命；
（3）色谱柱在使用后必须冲洗干净后方可保存过夜；
（4）对于使用酸、碱、缓冲盐的流动相，柱子必须用蒸溜水（含5%有机溶剂）冲洗干净，再用甲醇、乙腈冲洗保护（对反相柱）。
2、色谱柱的维护
（1）流动相所用试剂尽可能是色谱纯试剂，水最好是超纯水或全玻璃双重蒸溜水；
（2）流动相使用前用溶剂过滤器除去可能存在的微粒，流动相应现用现配。
对含盐的流液尤其应注意长时间会产生细菌或出现沉淀；
（3）柱子在使用过程中会产生：
①塔板数下降②峰形变差③压力增加④保留时间变化。
为使柱子使用寿命延长
A每天使用完后必须当天冲洗干净；
B压力增大时，可能是过滤筛板污染，可以将柱头螺母卸下取出滤片并将其在20%的硝酸溶液里超声波清洗约15分钟，再用纯水超声波清洗10分钟，重新装入色谱柱；
（4）色谱柱的再生
A.反相柱分别用甲醇：
水=90：
10，纯甲醇，二氯甲烷做流动相依次冲洗，每次冲洗体积为柱体积的30倍，然后以相反顺序冲洗；
B.正相柱分别用正己烷，异丙醇，二氯甲烷，甲醇做流动相依次冲洗，每次为柱体积的30倍，甲醇冲洗完以后再以相反的次序冲洗，至正己烷。
注意使用流动相必须严格脱水。
（四）紫外检测器
紫外检测器是应用最广泛的检测器，可测190-350mm光吸收变化，其结构基本部件：
氚灯流通值和传感器等等。
应注意事项：
1、氘灯的注意事项
（1）在开动液相色谱仪时最好先开泵，等流入大致平衡后再开检测器，可以缩短氘灯使用时间，冲洗关机也一样。
先关检测器，后冲洗；
（2）在分析中没有较长时间间隔，可以不关检测器。
2、流通池检测事项
（1）流通池是各分离组分经色谱柱分离到检测器的通道。
流通池应定期清洗检查，定期更换池垫圈；
（2）流通池常见故障是产生气泡，噪音较大，流动相必须严格脱气，其次在检测器出口加一较长背压管；
（3）不相互溶的溶剂没有中间过渡会产生气泡，以及噪音变大，故必须用异丙醇过渡后再换上新的溶剂；
（4）流通池本身污染程度可以在UV-254nn处检查，样品池和参比池的两处的光能量结果来判断。
3、氘灯的更换
（1）必须关闭检测器电源，等灯基本冷却后再操作；
（2）氘灯使用可以通过检查实际使用时间和结合光能量来办；
（3）氘灯更换必须戴手套，以防污染灯的表面产生噪声。
（4）灯座位置必须安装到位
4、流通池的清洗必须按照操作规程来处理
（1）下池入口、出口、液路路管
（2）用带金属接头的注射器连接池进口端、出口端注入异丙醇。
（3）回抽10毫升异丙醇通过池去掉残留流动相。
（4）回抽10毫升蒸溜水
（5）回抽10毫升60mol/L，磷酸通过池去掉沉积物。
（6）回抽20毫升蒸溜水
（7）用至少100毫升蒸溜水正向通过池入口
液相色谱仪常见故障的检查
液相色谱仪常见故障的检查
液相色谱仪根据目前市场情况，主要分进口和国产两大类液相色谱仪。
进口主要有美国产Waters、安捷伦、赛尔泰、戴安、日本岛津等系列液相色谱仪；国产有大连依利特、大连江申、上海上分、上海伍丰、浙江温岭、北京温分等系列液相色谱仪。
各生产厂家生产的液相色谱仪性能也各有差别。
但液相色谱仪主要包括三个系统：
即输液泵、进样器和检测器系统。
输液泵系统主要有泵体、吸滤头、入（出）单向阀、柱塞杆、压力传感器、在线过滤器、排空阀等组成；进样系统主要阀体、定量环、进样针等组成；检测器主要由电路系统、光路系统、光源、
检测池等组成。
要分析和判断色谱仪的故障所在，就必须要熟悉液相色谱工作输液和进样、检测这三大系统，特别是构成这三个系统部件的结构、功能。
色谱仪的故障是多种多样的。
而且某一故障产生的原因也是多方面的。
以下是液相色谱仪在使用过程中经常出现的故障现象以及解决方法，供大家参考和借鉴。
1、液相泵不输液可能的原因可采用的排除方法
（1）吸滤头堵塞。
清洗或更换吸滤头
（2）吸入管连接口漏液、重新安装或更换管路密封螺丝
（3）入口、出口单身阀失灵、用超声波清洗或更换单身阀
（4）泵腔内有气体、用10ML注射器抽出其中气体
（5）柱塞杆磨损、更换柱塞杆
（6）泵头漏液、检查泵密封圈或清洗、更换密封圈
2、系统压力偏高或压力波动大
（1）管路在线过滤片污染1、清洗在线过滤片或更换
（2）管路堵塞，重新剪切，重新安装
（3）手动进样器堵塞，检查进样器转子、定子及定量环，清洗或更新
（4）保护柱污染，清洗或更换保护柱芯
（5）色谱柱污染，清洗或更换
（6）混合器污染（双泵），清洗混合器（内过滤片）或更换
3、仪器使用基线漂移较大可能的原因可采用的排除方法
（1）系统流动相未平衡好，稳定时间长一点
（2）色谱柱使用后期污染，清洗再生色谱柱或更换
（3）样品没走完，清洗管路或液路
（4）检测器污染，清洗检测器和检测池。
（5）流动相污染、不纯、未脱气、未过滤，使用HPLC级试剂，充分过滤。
（6）系统污染，清洗整个流路系统
（7）氘灯能量不足，更换氘灯
（8）电源（电压）不稳定，安装稳压电源
（9）室内环境较差，改善室内环境，保持一定温度和湿度
（10）系统漏液，检查液路，确保流路不漏液、不堵塞。
4、保留时间重现性不好可能的原因可采用的排除方法
（1）样品进样量相差较大，样品进样量保持一致
（2）系统未平衡，系统平衡时间长一点
（3）分析方法不合理，重新筛选色谱柱或流动相
（4）色谱柱选择不合理或使用后期，清洗或更换色谱柱
（5）流动相混合不均匀或试剂质量不好，混合时间长一点，选择HPLC试剂
（6）系统漏液，检查流路，确保流路不漏液、不堵塞
5、测试样品出现分叉峰可能的原因可采用的排除方法
（1）保护柱污染清洗或更换
（2）色谱柱污染清洗或更换
（3）进样阀污染清洗或更换
（4）检测器污染清洗检测池、更换垫片或透镜
（5）溶解样品的试剂选择不合理重新选择合适的试剂
问：
HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法
答：
1、样品量不足：
解决办法为增加样品量
2、样品末从柱子中流出：
可根据样品的化学性质改变流动相或柱子
3、样品与检测器不匹配：
根据样品性质调整波长或改换检测器
4、检测器衰减太多：
调整衰减即可。
5、检测器时间常数太大：
解决办法为降低时间参数
6、检测器池窗污染：
解决办法为清洗池窗。
7、检测池中有气泡：
解决办法为排气。
8、记录仪测压范围不当：
调整电压范围即可。
9、流动相流量不合适：
调整流速即可。
10、检测器与记录仪超出校正曲线：
解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。
问：
做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？
如何解决？
答：
原因可能有：
泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理：
1、比例阀失效，更换比例阀即可。
2、泵密封垫损坏，更换密封垫即可。
3、溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；
4、系统检漏，找出漏点，密封即可。
5、梯度洗脱，这时压力波动是正常的。
现代高效液相色谱中，分离效果好坏的一个重要指标是色谱填料的选择。
但是色谱填料的选择范围很宽，因此，要做合适的选择，必须对此有一定的认识和了解。
一、硅胶基质填料
1、正相色谱正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica）以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2，APS）和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。
由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。
正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷（Hexane），氯仿（Chloroform），二氯甲烷（MethyleneChloride）等。
2、反向色谱反向色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。
反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。
样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。
常用的反向填料有：
C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。
二、聚合物填料聚合物填料多为聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其重要优点是在PH值为1—14均可使用。
相对于硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物对蛋白质等样品的分离非常有效。
现有的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。
三、其它无机填料其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途。
如，石墨化碳黑正逐渐成为反向色谱柱填料。
这种填料的分离不同于硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性。
该柱填料一般比烷基键合相硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强。
石墨化碳可用于分离某些几何异构体，由于在HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。
氧化铝也可以用于HPLC。
氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可以在PH高达12的流动相中使用。
但由于氧化铝与碱性化合物的作用也很强，应用范围受到一定限制，所以未能广泛应用。
新型色谱氧化锆基质填料也可用于HPLC。
商品化的只有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用PH1-14，温度可达100℃。
由于氧化锆填料是最近几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行之中。
怎样选择填料粒度目前，商品化的色谱填料粒度从1um到超过30um均有销售，而目前分析分离主要用3和5um填料进行。
填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。
粒度越小，柱压越大，柱压的增加限制了粒度小于3um的填料应用。
在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度，但不是唯一的因素。
如果固定相选择是正确，但是分离度不够，那么选用更小的粒度的填料是很有用的。
3um填料填充柱的柱效比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，3um的色谱柱的背压却是5um的2倍。
与此同时，柱效提高意味着在相同条件下可以选用更短的色谱柱，即相同的塔板数或分离能力，但是柱长更短，以缩短分析时间。
另外，可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色谱柱的压力
色谱柱的维护
1．使用预柱保护分析柱（硅胶在极性流动相/离子性流动相中有一定的溶解度）
2．大多数反相色谱柱的pH稳定范围是2－7.5，尽量不超过该色谱柱的pH范围
3．避免流动相组成及极性的剧烈变化
4．流动相使用前必须经脱气和过滤处理
5．如果使用极性或离子性的缓冲溶液作流动相，应在实验完毕柱子冲洗干净，并保存大乙腈中
6．压力升高是需要更换预柱的信号
色谱柱的再生 进行色谱柱再生时，应使用一个谦价的泵，我们建议最好不使用您的高效液相色谱仪上的泵。
表1 建议用来冲洗的溶剂体积
色谱柱尺寸柱体积所用溶剂的体积
125-41.6ml30ml
250-43.2ml60ml
250-10-20ml400ml
请根据下表选择您的再生方法：
极性固定相（如Si，NH2*，DIOL基色谱填料）的再生：
正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**
非极性固定相（如反相色谱填料RP－18，RP－8，CN等）的再生：
水→乙腈→氯仿（或异丙醇）→乙腈→水
0.05M稀硫酸可以用来清洗已污染的色谱柱
注意：
在对NH2改性的色谱柱进行再生时，由于NH2可能成铵根离子的形式存在，因此应该在水洗后用0.1M的氨水冲洗，然后再用水冲洗至碱溶液完全流出。
**如果简单的有机溶剂/水的处理不能够完全洗去硅胶表面吸附的杂质，用0.05M稀硫酸冲洗非常有效。
高效液相色谱使用常见问题
1、色谱柱中的流动相会排干吗？
不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形：
不慎未及时补充流动相，泵将溶剂瓶中的流动相吸干了，HPLC系统由此而停止工作了。
如此情况是否会损坏色谱柱？
泵是否已将色谱柱中所有流动相都排干了？
色谱柱还能使用吗？
事实上，如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干，并不会造成色谱柱的损坏。
即使泵中充满了空气，泵也不会将空气排入色谱柱。
因为泵只能输送液体，而不能输送空气。
相比之下，另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱两端的密封盖或盖子太松而使色谱柱变干。
同样，整个色谱柱干涸的情况不太容易发生，多半可能只是色谱柱两端的几个毫米变干了，因挥发掉所有溶剂是色谱柱变干需要相当长的时间。
即使色谱柱真的变干了，也不一定就不可救药了。
可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的溶剂（如经氦气脱气的甲醇）冲洗色谱柱以除去气体。
较低的表面张力有助于浸润填料表面；已脱气的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的气体。
色谱柱大约需要（以1mL/min的流速）冲一个小时或更多的时间被彻底浸润，恢复到正常状态。
2、使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接头需要注意什么问题？
如果经常需要改变流路或更换不同品牌的色谱柱，使用PEEK材料制成的管路和接头会非常方便。
PEEK管路容易连接；PEEK接头不仅无需工具，手拧即可固定，而且容易调节锥箍之外的管路长度，方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。
使用此类材料的管路需要注意的是：
PEEK对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。
虽然未观察到上述溶剂溶解PEEK材料的明显迹象，但PEEK遇到上述溶剂会变脆。
另一个西药考虑的因素是压力限。
不锈钢管可耐受6000psi的压力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多数HPLC应用系统压力不会超过3000psi）。
使用PEEK接头时则无需担心接头耐溶剂性能，因为接头几乎或很少与溶剂直接接触。
但手拧固定的PEEK接头压力限低于不锈钢管，因而压力太高时，可能会使接头在管路上滑动而产生死体积或漏液。
3、如何预防液相泵的故障:
要保持泵的良好操作性能,必须维护系统的清洁,保证溶剂和试剂的质量,对流动相进行过滤和脱气.下面列出预防泵故障的几项措施:
1）、用高质量试剂和HPLC级溶剂；
2）、过滤流动相和溶剂；
3）、脱气；
4）、每天开始使用时放空排气，工作结束后从泵中洗去缓冲液；
5）、不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中；
6）、定期更换垫圈；
7）、需要时加润滑油；
8）、查阅有关泵操作手册中的其它建议。
处于良好操作状态的泵，应该能使色谱图上的基线平稳；保留时间的重复性好。
在等度洗脱时压力波动小于2%。
梯度洗脱时压力变化应是缓慢和平稳的。
为了使故障发生后尽快排除，平时应常备密封、单向阀（入口与出口）、泵头装置、各式接头、保险丝等部件，以及更换工具。
高效液相色谱仪使用中常见故障及解决方法
1高效液相色谱仪系统
液相色谱仪主要由贮液瓶、泵、进样器、柱子、柱温箱、检测器、数据处理系统组成。
对于整个系统而言，柱子、泵和检测器是核心部件同时也是易出问题的主要部位。
2常见问题及解决方法
高效液相作为一种高精密仪器，如果在使用过程中不按照正确操作的话，就容易导致一些问题。
其中最常见的就是柱压问题、漂移问题、峰型异常问题。
2.1柱压问题柱压问题是使用高效液相色谱过程中需要密切注意的地方，柱压的稳定与色谱图峰形的好坏、柱效、分离效果及保留时间等密切相关。
所谓柱压稳定并不是指压力值稳定于一个恒定值而是指压力波动范围在50PSI（3.3Bar）之间（在使用梯度洗脱时，柱压平稳缓慢的变化是允许的）。
压力过高、过低都属于柱压问题。
2.1.1压力过高这是高效液相在使用中最常见的问题，指的是压力突然升高，一般都是由于流路中有堵塞的原因。
此时，我们应该分段进行检查。
（1）.首先断开真空泵的入口处，此时PEEK管里充满液体，使PEEK管低于溶剂瓶，看液体是否自由滴下，如果液体不滴或缓慢滴下，则是溶剂过滤头堵塞。
处理方法：
用30%的硝酸浸泡半个小时，在用超纯水冲洗干净。
如果液体自由滴下，溶剂过滤头正常，在检查；
（2）.打开Purge阀，使流动相不经过柱子，如果压力没有明显下降，则是过滤白头堵塞。
处理方法：
将过滤白头取出，用10%的异丙醇超声半个小时。
如果压力降至100PSI（6.7Bar）以下，过滤白头正常，在检查；
（3）.把色谱柱出口端取下，如果压力不下降，则是柱子堵塞。
处理方法：
如果是缓冲盐堵塞，则用95%的水冲至压力正常。
如果是一些强保留的物质导致堵塞，则要用比现在流动相更强的流动相冲至压力正常。
假如按上面的方法长时间冲洗压力都不下降，则可考虑将柱子的进出口反过来接在仪器上，用流动相冲洗柱子。
这时，如果柱压仍不下降，只有换柱子入口筛板，但一旦操作不甚，很容易造成柱效下降，所以尽量少用。
2.1.2压力过低压力过低的现象一般是由于系统泄漏，处理方法：
寻找各个接口处，特别是色谱柱两端的接口，把泄漏的地方旋紧即可。
当然还有一个原因就是泵里进了空气，但此时表现的往往是压力不稳，忽高忽低，更严重一点会导致泵无法吸上液体。
处理方法：
打开Purge阀，用3~5ml/min的流速冲洗，如果不行，则要用专用针筒在排空阀处借住外力将气泡吸出。
2.2漂移问题主要包括基线漂移和保留时间漂移。
2.2.1基线漂移一般说来，机器刚起动时，基线容易漂移，大概要半个小时的平衡时间，如果你用了缓冲溶液或缓冲盐，还有就是在低波长下（220nm）平衡时间相对会比较长，但如果你在实验过程中发现基线漂移，则你要考虑下面的原因：
1、柱温波动。
解决方法：
控制好柱子和流动相的温度，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱。
2、流通池被污染或有气体。
解决方法：
用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池（最好断开柱子）。
如有需要，可以用1N的硝酸（不要用盐酸）。
3、紫外灯能量不足。
解决方法：
更换新的紫外灯
4、流动相污染、变质或由低品质溶剂配成。
解决方法：
检查流动相的组成，使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂。
5、样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线。
解决方法：
使用保护柱，如有必要，在进样之间。
在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子。
6、检测器没有设定在最大吸收波长处。
解决方法：
将波长调整至最大吸收波长处
7、流动相的PH值没有调节好。
解决方法：
加适量的酸或碱调至最佳PH值
2.2.2保留时间漂移保留时间重现是液相性能好坏的一个重要标志，同一种东西，两次的保留时间相差不要超过15s，超过了半分钟可看做保留时间漂移，就无法进行定性，你要考虑以下原因：
1、温控不当。
解决方法：
调好柱温，检查是否有打开的窗户或空调对着柱温箱。
2、流动相比例变化。
解决方法：
检查四元泵的比例阀是否有故障
3、色谱柱没有平衡。
解决方法：
在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱
4、流速变化。
解决方法：
重新设定流速
5、泵中有气泡。
解决方法：
、从泵中除去气泡
2.3峰型异常问题峰型问题是液相的主要问题，在做液相过程中，我们就是要变换不同的条件来改善不好的峰型，对于各种各样的异常峰，要区别对待，从主要问题出发，一个一个加以解决。
1、色谱图中未出峰。
解决方法：
系统未进样或样品分解；泵未输液或流动相使用不正确；检测器设置不正确；针对以上情况成因作相应调整即可。
2、一个峰或几个峰是负峰。
解决方法：
流动相吸收本底高；进样过程中进入空气；样品组分的吸收低于流动相。
3、所有峰均为负峰。
解决方法：
信号电缆接反或检测器输出极性设置颠倒；光学装置尚未达到平衡。
4、所有峰均为宽峰。
解决方法：
系统未达到平衡；溶解样品的溶剂极性比流动相差很多；色谱柱尺寸及类型选择不正确；色谱柱或保护柱被污染或柱效降低；温度变化造成的影响。
、
5、所出峰比预想的小。
解决方法：
样品黏度过大；进样品故障或进样体积误差；检测器设置不正确．定量环体积不正确；检测池污染；检测器灯出现问题。
6、出现双峰或肩峰。
解决方法：
进样量过大；样品浓度过高；保护柱或色谱柱柱头堵塞；保护拄或色谱柱污染或失效；柱塌陷或形成短通道。
7、前伸峰。
解决方法：
进样量或样品浓度高；溶解样品的溶剂较流动相极性强；保护柱或色谱柱污染或失效。
8、拖尾峰。
解决方法：
柱超载，降低样品量；增加柱直径采用较高容量的固定相；峰干扰，对样品进行清洁过滤；调整流动相；硅羟基作用，加入三乙胺，用碱致钝化柱增加缓冲液或盐的浓度降低流动相pH值；柱内烧结不锈钢失效，更换烧结不锈钢；加在线过滤器，对样品进行过滤；死体积或柱外体积过大，将连接点降至最低；尽可能使用内径较细的连接管；柱效下降，更换柱子；采用保护柱，对柱子进行再生。
9、出现平头峰。
解决方法：
检测器设置不正确；进样体积太大或样品浓度太高。
10、出现鬼峰。
解决方法：
进样阀残余峰，在每次进完样后用充足的时间来平衡和清洗系统；样品中存在未知物，改进样品的预处理；流动相污染，更换新流动相，尽可能现配现用，隔夜的流动相再次使用时要过滤；尽可能使用HPLC级试剂；流路中有小的气泡，打开Purge阀，加大流速排除
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