青霉素的发酵资料.docx

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青霉素的发酵资料

青霉素发酵工艺

第一章背景知识

青霉素的发觉

1928年，英国细菌学家Fleming发觉污染在培育葡萄球菌的双蝶上的一株霉菌能杀死周围的葡萄球菌。

他将此霉菌分离纯化后取得的菌株经鉴定为点青霉，并将这菌所产生的抗生物质命名为青霉素。

1940年，英国Florey和Chain进一步研究此菌，并从培育液中制出了干燥的青霉素制品。

经实验和临床实验证明，它毒性很小，并对一些革兰氏阳性菌所引发的许多疾病有卓越的疗效。

青霉素分类及分子结构

青霉素是6－氨基青霉烷酸（6-aminopenicillanicacid,6-APA）苯乙酰衍生物。

侧链基团不同，形成不同的青霉素，主若是青霉素G。

工业上应用的有钠、钾、普鲁卡因、二苄基乙二胺盐。

青霉素发酵液中含有5种以上天然青霉素（如青霉素F、G、X、K、F和V等），它们的不同仅在于侧链R基团的结构不同，其中青霉素G在医疗顶用得最多，它的钠或钾盐为医治革兰氏阳性菌的首选药物，对革兰氏阴性菌也有壮大的抑制作用。

青霉素的结构通式可表示为

青霉素的单位

目前国际上青霉素活性单位表示方式有两种：

一是指定单位（unit）；二是活性质量（μg），最先为青霉素规定的指定单位是：

50mL肉汤培育基中恰能抑制标准金葡萄菌生长的青霉素量为一个青霉素单位。

在以后，证明了一个青霉素单位相当于μg青霉素钠。

因此青霉素的质量单位为:

μg青霉素钠等于1个青霉素单位。

由此，1mg青霉素钠等于1670个青霉素单位（unit）。

作用机理

已有的研究以为，青霉素的抗菌作用与抑制细胞壁的合成有关。

细菌的细胞壁是一层坚韧的厚膜，用以抗击外界的压力，维持细胞的形状。

细胞壁的里面是细胞膜，膜内裹着细胞质。

细菌的细胞壁要紧由多糖组成，也含有蛋白质和脂质。

革兰氏阳性菌细胞壁的组成是肽聚糖占细胞壁干重的50％～80％（革兰氏阴性菌为1％～10％）、磷壁酸质、脂蛋白、多糖和蛋白质。

其中肽聚糖是一种含有乙酰基葡萄糖胺和短肽单元的网状生物大分子，在它的生物合成中需要一种关键的酶即转肽酶。

青霉素作用的部位确实是那个转肽酶。

现已证明青霉素内酞胺环上的高反映性肽键受到转肽酶活性部位上丝氨酸残基的羟基的亲核进攻形成了共价键，生成青霉噻唑酰基-酶复合物，从而不可逆的抑制了该酶的催化活性。

通过抑制转肽酶，青霉素使细胞壁的合成受到抑制，细菌的抗渗透压能力降低，引发菌体变形，破裂而死亡。

青霉素的应用

临床应用：

40连年，要紧操纵灵敏金黄色葡糖球菌、链球菌、肺炎双球菌、淋球菌、脑膜炎双球菌、螺旋体等引发感染，对大多数革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌）和某些革兰氏阴性细菌及螺旋体有抗菌作用。

优势：

毒性小，但由于难以分离除去青霉噻唑酸蛋白（微量可能引发过敏反映），需要皮试。

各类半合成抗生素的原料：

青霉素的缺点是对酸不稳固，不能口服，排泄快，对阴性菌无效。

氨苄青霉素耐酸广谱；对抗绿脓杆菌的磺苄青霉素，耐酸、耐酶、口服的乙氧萘青霉素等。

提供头孢菌素母核。

第二章发酵工艺进程

菌种介绍

青霉是产生青霉素的重要菌种。

普遍散布于空气、土壤和各类物上，常生长在腐臭的柑桔皮上呈青绿色。

目前已发觉几百种，其中产黄青霉（Penicillumchrysogenum）、点青霉（Penicillumnototum）等都能大量产生青霉素。

青霉素的发觉和大规模地生产、应用，不仅对抗生素工业的进展起了庞大的推动作用，而且加上其他抗生素的普遍利用，比如像磺胺药物，令人类的平均寿命，再次延长了四岁。

另外，有的青霉菌还用于生产灰黄霉素及磷酸二酯酶、纤维素酶等酶制剂和有机酸。

1981年报导，疠孢青霉是纤维素酶的新来源，它能分解棉花纤维。

菌种的保藏

菌种的保藏方式有：

斜面菌种低温保藏法、砂土管保藏法、甘油封藏法、真空冷冻干燥法。

斜面菌种低温保藏法利用低温对微生物生命活动有抑制作用的原理进行保藏。

把斜面菌种、固体穿刺培育物或菌悬液等，直接放入4～5℃冰箱中。

保藏时刻一样不超过3个月，到时必需进行移接传代，再放回冰箱。

砂土管保藏法将干燥砂粒与细土混合后灭菌制成砂土管，然后接种保藏。

假设把砂土管放在低温或抽气后密封，成效更佳。

此法适用于产孢子及芽孢菌种的保藏。

保藏期1～10年。

甘油封藏法向培育好的菌种斜面上，加入灭菌甘油，高出斜面1cm，然后蜡封管口，放入冰箱。

该法既可避免培育基水分蒸发，又能使菌种与空气隔间。

保藏期1～2年。

真空冷冻干燥法是目前比较理想的一种方式。

在低于-15℃下，快速将细胞冻结，并维持细胞完整，然后在真空中使水分升华致干。

在此环境中，微生物的生长和代谢都临时停止，不易发生变异，故可长时刻保留，一样为5～10年，最多可达15年之久。

此法兼备了低温、干燥及缺氧几方面条件，使微生物能够保留较长时刻，但进程较麻烦，需要必然的设备。

孢子的制备

这是发酵工序的开端，是一个重要环节。

抗生素产量和成品质量同菌种性能和同孢子和种子的情形有紧密关系。

生产用的孢子需通过纯种和生产能力的查验，符合规定的才能用来制备种子。

保藏在砂土管或冷冻干燥管仲的菌种经无菌手续接入适合于孢子发芽或菌丝生长的斜面培育基中，经培育成熟后挑选菌落正常的孢子可再一次接入试管斜面。

关于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁衍快的菌种能够采纳固体培育基孢子，孢子可直接作为中子罐的种子。

种子制备

种子制备是指孢子接入种子罐后，在罐中繁衍成大量菌丝的进程，其目的是使孢子发芽、繁衍和取得足足数量的菌丝，以便接种到发酵罐当中去。

种子制备所利用的培育基及其它工艺条件，都要有利于孢子发芽和菌丝繁衍。

种子罐级数是在指制备种子需逐级扩大培育的次数，一样依照种子的生长特性、孢子发芽及菌体繁衍速度，和发酵罐的容积而定。

青霉素种子制备一样为二级种子罐扩大培育。

发酵培育基介绍

培育基是供微生物生长繁衍和合成各类代谢产物所需要的按必然比例配制的多种营养物质的混合物。

培育基的组成和比例是不是适当，直接阻碍微生物的生长、生产和工艺选择、产品质量和产量等。

青霉素的发酵培育基由碳源、氮源、无机盐及金属离子、添加前体、消沫剂五部份组成。

碳源的要紧作用是：

为微生物菌种的生长繁衍提供能源和合成菌体所必需的碳成份；为合成目的产物提供所需的碳成份。

青霉素发酵中经常使用乳酸或葡萄糖，也可采纳葡萄糖母液、糖蜜等。

其中乳糖最为廉价，但因货源较少，很多国家采纳葡萄糖代替。

但当葡萄糖浓度超过必然限度时，会过度加速菌体的呼吸，以至培育基中的溶解氧不能知足需要，使一些中间代谢物不能完全氧化而积存在菌体或培育基中，致使pH下降，阻碍某些酶的活性，从而抑制微生物的生长河产物的合成。

氮源的作用是供给菌体合成氨基酸和三肽的原料，以进一步合成青霉素。

要紧有机氮源为玉米浆、棉籽饼粉、花生饼粉、酵母粉、蛋白胨等。

玉米浆为较理想的氮源，含固体量少，有利于通气及氧的传递，因此利用率较高。

固体有机氮源原料一样需粉碎至200目以下的细度。

有机氮源还能够提供一部份有机磷，供菌体生长。

无机氮如硝酸盐、尿素、硫酸铵等可适量利用。

碳酸钙用来中和发酵进程中产生的杂酸，并操纵发酵液的pH值，为菌体提供营养的无机磷源一样采纳磷酸二氢钾。

另外加入硫代硫酸钠或硫酸钠以提供青霉素分子中所需的硫。

由于此刻还有一些工厂采纳铁罐发酵，在发酵进程中铁离子便慢慢进入发酵液。

发酵时刻愈长，那么铁离子愈多。

铁离子在50µg/ml以上便会阻碍青霉素的合成。

采纳铁络合剂以抑制铁离子的阻碍，但实际对青霉素产量并无改良。

因此青霉素的发酵罐采纳不锈钢制造为宜，其他重金属离子如铜、汞、锌等能催化青霉素的分解反映。

添加苯乙酸或苯乙酰胺，能够借酰基转移的作用，将苯乙酸转入青霉素分子，提高青霉素G的生产强度，添加苯氧乙酸那么产生青霉素V。

因此前体的加入成为青霉素发酵的关键问题之一。

但苯乙酸对发酵有阻碍，一样以苯乙酰胺较好。

也有人采纳苯乙酸月桂醇酯，其优势是在发酵中月桂醇酯水解，苯乙酸结合进青霉素成品。

而月桂酸作为细菌营养剂及发酵液消沫剂，且其毒性比苯乙酸小，但价钱较贵。

前体要在发酵开始20h后加入，并在整个发酵进程中操纵在50µg/ml左右

由于在发酵进程中二氧化碳的不断产生，加上培育基中有很多有机氮源含有蛋白质，因此在发酵罐内会产生大量泡沫，如不严加操纵，就会产生发酵液逃液，致使染菌的后果。

采纳植物油消沫仍旧是个好方式，一方面作为消沫剂，另一方面还能够起到碳源作用，但此刻已普遍采纳合成消沫剂（如聚酯、聚醇类消沫剂）代替豆油。

灭菌

“灭菌”指的是用化学或物理的方式杀灭或除去物料及设备中所有的有生命物质的技术或工艺流程。

灭菌实质上可分杀菌和溶菌两种，前者指菌体虽死，但形体尚存，后者那么指菌体杀身后，其细胞发生溶化、消失的现象。

工业上经常使用的方式有：

干热灭菌、湿热灭菌、化学药剂灭菌、射线灭菌和介质过滤除菌等几种。

在青霉素的生产中，对培育基和发酵罐要紧采纳的是湿热蒸汽灭菌和空气过滤除菌的方式。

发酵

这一进程的目的主若是为了使微生物分泌大量的抗生素。

发酵开始前，有关设备和培育基必需先通过灭菌，后接入种子。

接种量一样为5～20%。

发酵周期一样为4～5天，但也有少于24小时，或长达二周以上的。

在整个进程中，需要不断通气和搅拌，维持必然的罐温和罐压，并隔一段时刻取样进行生化分析和无菌实验，观看代谢转变、抗生素产生情形和有无杂菌污染。

2.7.1发酵的进程操纵

一、碳源操纵：

青霉菌能利用多种碳源，如乳糖、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、淀粉和天然油脂等。

乳糖是青霉素生物合成的最好碳源，葡萄糖也是比较好的碳源，但必需操纵其加入的浓度，因为葡萄糖易被菌体氧化并产生抑制抗生素合成酶形成的物质，从而阻碍青霉素的合成，因此能够采纳持续添加葡萄糖的方式代替乳糖。

苯乙酸或其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等都可作为青霉素G的侧链前体。

菌体对前体的利用有两个途径：

直接结合到产物分子中或作为养料和能源利用，即氧化为二氧化碳和水。

前体究竟通过哪个途径被菌体利用，要紧取决于培育条件和所用菌种的特性。

通过比较苯乙酰胺、苯乙酸及苯氧基乙酸的毒性，除苯氧基乙酸外，苯乙酰胺和苯乙酸的毒性取决于培育基的pH和前体的浓度。

碱性时，苯乙酰胺有毒；酸性时，苯乙酸毒性较大；中性时，苯乙酰胺的毒性大于苯乙酸。

前体用量大于%时，青霉素的生物合成均下降。

因此一样发酵液中前体浓度以始终维持在%为宜。

在碱性条件下，苯乙酸被菌体氧化的速度随培育基pH上升而增加。

年幼的菌丝不氧化前体，而仅利用它来组成青霉素分子。

随着菌龄的增大，氧化能力慢慢增加。

培育基成份对前体的氧化程度有较大阻碍，合成培育基比复合培育基对前体的氧化量少。

为了尽可能减少苯乙酸的氧化，生产上多用间歇或持续添加低浓度苯乙酸的方式，以维持前体的供给速度略大于生物合成的需要。

二、pH操纵：

在青霉素发酵进程中，pH是通过以下手腕操纵的：

如pH太高，那么添加糖、硫酸或无机氮源；假设pH太低，那么加入碳酸钙、氢氧化钠、氨或尿素，也可提高通气量。

另外，也可利用自动加入酸或碱的方式，使发酵液pH维持在～，以提高青霉素产量。

3、温度操纵：

青霉菌生长的适宜温度为30℃，而分泌青霉素的适宜温度是20℃左右，因此生产上采纳变温操纵的方式，使之适合不同时期的需要。

一样一级种子的培育温度操纵在27±1℃左右；二级种子的培育温度操纵在25±1℃左右；发酵前期和中期的温度操纵在26℃左右；发酵后期的温度操纵在24℃左右。

4、补料操纵：

发酵进程中除以中间补糖操纵糖浓度及pH外，补加氮源也可提多发酵单位。

经实验证明：

假设在发酵60～70h开始分次补加硫酸铵，那么在90h后菌丝含氮量几乎不下降，维持在6%～7%，，且60%～70%的菌丝处于年幼时期，菌丝呼吸强度维持在二氧化碳量近30μl/（mg菌丝·h），抗生素产率为最高水平的30%～40%；而不加硫酸铵的对照罐，在发酵中期菌丝含氮量为7%，以后逐级下降。

至发酵终止时为4%。

发酵终止时呼吸强度降至二氧化碳量为16μl/（mg菌丝·h），且抗生素产量下降至零，总产量仅为实验罐的1/2。

因此，为了延长发酵周期，提高青霉素产量，发酵进程分次补加氮源也是有效的方法。

五、铁离子的阻碍：

三价铁离子对青霉素生物合成有显著阻碍，一样假设发酵液中铁离子含量超过30～40μg/ml，那么发酵单位增加缓慢。

铁离子对产黄青霉绿色孢子合成青霉素的阻碍见下表。

因此铁罐在利用前必需进行处置，可在罐壁涂上环氧树脂等爱惜层，使铁离子含量操纵在30μg/ml以下。

2.7.2避免染菌的要点

染菌是抗生素发酵的大敌，不制服染菌就不能实现优质高产。

阻碍染菌的因素很多，而且带随机性质，但只要认真对待，过细地工作，染菌是能够避免的。

请到左侧的导航栏里选择查看避免染菌的要点的内容。

2.7.3空气系统的要求

避免空气带菌主若是提高空压机入口空气的干净度，避免空气夹带油和水及空气过滤器失效。

提高空压机入口空气的干净度，能够从提高吸气口的位置及增强空气的紧缩前过滤着手。

避免空气夹带油、水，除增强去除油、水的方法外，还必需避免空气冷却器漏水，注意勿使冷却水压力大于空气压力，避免冷却水进入空气系统。

2.7.4蒸汽系统的要求

重视饱和蒸汽的质量，要严防蒸汽中夹带大量冷凝水，避免蒸汽压力大幅度波动，保证生产时所用的蒸汽压力在30～35千帕以上。

一、持续灭菌设备：

连消塔结构要求简单，易于拆装和清理，操作时蒸汽能与物料混合均匀，并易于操纵温度。

二、发酵罐：

发酵罐及其附属设备应注意周密和避免泄漏，幸免形成“死角”。

凡与物料、空气、下水道连接的阀门都必需保证周密度。

3、无菌室：

用超净工作台及净化室代替无菌室，以提高无菌程度。

第三章提炼工艺进程

发酵液预处置

发酵液中的杂质如高价无机离子（Fe2+、Ca2+、Mg2+）和蛋白质在离子互换的进程中对提炼阻碍甚大，无益于树脂对抗生素的吸收。

如用溶媒萃取法提炼时，蛋白质的存在会产生乳化，使溶媒合水相分离困难。

对高价离子的去除，可采纳草酸或磷酸。

如加草酸那么它与钙离子生成的草酸钙还能促使蛋白质凝固以提多发酵滤液的质量。

如加磷酸（或磷酸盐），既能降低钙离子浓度，也利于去除镁离子。

Na5P3O10+Mg2+====MgNa3P3O10+2Na+

加黄血盐及硫酸锌，那么前者有利于去除铁离子，后者有利于凝固蛋白质。

另外，二者还有协同作用。

他们所产生的复盐对蛋白质有吸附作用。

2K4Fe（CN）6+3ZnSO4K2Zn[Fe（CN）6]2+2Na+

为了有效的去除发酵液中的蛋白质，需加入絮凝剂。

絮凝剂是一种能溶于水的高分子化合物。

含有很多离子化基团（如—NH2，—COOH，—OH）。

提取

化学提取和精制的目的：

从发酵液中制取高纯度的、合乎药典的抗生素成品。

由于发酵液中青霉素浓度很低，仅～%左右，而杂质浓度比青霉素的高几十倍乃至几千倍，而且某些杂质的性质与抗生素的超级相近，因此提取精制是一件十分重要的工作。

发酵液中常见的杂质有：

菌丝、未用完的培育基、易污染杂菌、产生菌的代谢产物、预处置需要加入的杂质等。

在提炼进程中要遵循下面四个原那么：

一、时刻短

二、温度低

3、pH适中

4、勤清洗消毒

经常使用的提取方式有溶媒萃取法、离子互换法和沉淀法等。

一、溶媒萃取法这是利用抗生素在不同的pH值条件下以不同的化学状态（游离态、碱或盐）存在时，在水及水互不相溶的溶媒中溶解度不同的特性，使抗生素从一种液相（如发酵滤液）转移到另一种液相（如有机溶媒）中去，以达到浓缩和提纯的目的。

利用此原理就可借助于调剂pH值得方式时抗生素从一个液相中被提取到另一液相中去。

所选用的溶媒与水应是互不相溶或仅很小部份互溶，同时所选溶媒在必然的pH下关于抗生素应有较大的溶解度和选择性，方能用较少量的溶媒使提取完全，并在必然程度上分离掉杂质。

二、离子互换法利用离子互换树脂和抗生素之间的化学亲和力，有选择性的将抗生素吸附上去，然后以较少量的洗脱剂将它洗下来。

3、沉淀法是一种分离抗生素简单而经济的方式，浓缩倍数高，因此也是很有效的方式。

青霉素的提取采纳溶媒萃取法。

青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素盐易溶于水。

利用这一性质，在酸性条件下青霉素转入有机溶媒中，调剂pH，再转入中性水相，反复几回萃取，即可提纯浓缩。

选择对青霉素分派系数高的有机溶剂。

工业上通经常使用醋酸丁酯和戊酯。

萃取2－3次。

从发酵液萃取到乙酸丁酯时，pH选择，从乙酸丁酯反萃到水相时，pH选择。

为了幸免pH波动，采纳硫酸盐、碳酸盐缓冲液进行反萃。

所得滤液多采纳二次萃取，用10%硫酸调~，加入醋酸丁酯。

在一次丁酯萃取时，由于滤液含有大量蛋白，通常加入破乳剂避免乳化。

第一次萃取，存在蛋白质，加乳化剂PPB。

精制

这是青霉素生产的最后工序。

对产品进行精制、烘干和包装的时期要符合“药品生产治理标准”的规定。

3.3.1脱色和去热原质

脱色和去热原质是精制注射用青霉素中不可缺少的一步。

色素是在发酵进程中所产生的代谢产物，它与菌种和发酵条件有关。

热原质是在生产进程中由于被污染后杂菌所产生的一种内毒素。

生产中一样用活性炭脱色去热原质，但需注意脱色时pH、温度、活性炭用量及脱色时刻等因素，还应考虑它对抗生素的吸附问题，不然阻碍收率。

3.3.2结晶

抗生素精制经常使用结晶法来制得高纯度成品。

经常使用的几种结晶方式有：

一、改变温度结晶利用抗生素在溶剂中的溶解度随温度转变而显著转变的这一特性来进行结晶。

二、利用等电点结晶当将某一抗生素溶液的pH调到等电点时，它在水溶液中溶解度最小，那么沉淀析出。

3、加成盐剂结晶在抗生素溶液中加成盐剂使抗生素以盐的形式从溶液中能够沉淀结晶。

青霉素钠盐在醋酸丁酯中溶解度很小，利用此性质，再二次醋酸丁酯萃取液中加入醋酸钠乙醇溶液，并操纵温度青霉素钠盐就结晶析出。

反映如下：

醋酸丁酯中含水量太高会阻碍收率，但可提高晶体纯度。

水分在%以下对收率阻碍较小。

取得的晶体要求颗粒均匀，有必然的细度。

颗粒太细会使过滤、洗涤困难。

晶体经丁醇洗涤，真空干燥即可等到成品。

成品鉴定

成品鉴定是依照药典的要求逐项进行分析，包括效价鉴定、毒性实验、无菌检查、热源质实验、水分测定、水溶液酸碱度及混浊度测定、结晶颗粒的色泽及大小的测定等。

关于药典上未有规定的新抗生素，那么可参照相近抗生素，按体会规定一些指标。

酸碱度检测取本品，加水制成每1ml中含30mg的溶液，测定。

pH值应为～。

溶液的澄清度与颜色取样品0.3g，加水5ml使溶解，溶液应澄清无色；如显浑浊，与浊度标准液比较，均不得更浓；如显色，与黄色或黄绿色标准比色液比较，均不得更深。

吸光度取样品，加水制成每1ml中含的溶液，在280nm的波优势测定吸光度，不得大于；在264nm的波优势有最大吸收，吸光度应为～。

细菌内毒素取样品测定，每100青霉素单位中含内毒素的量应小于。

无菌取样品，用青霉素酶法灭活后或用适宜溶剂溶解后，转移至很多于500ml的%无菌氯化钠溶液中，用薄膜过滤法处置后测定。

效价测定取本品适量，周密称定，加水溶液并定量稀释制成每1ml中约含的溶液，摇匀，周密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；另取青霉素对照品适量，同法测定。

按外标以峰面积计算，其结果乘以，即为本品效价。

每1mg相当于1670青霉素单位。

成品分装

抗生素产品一样分装为大包装的原料药，以供制剂厂进行小包装或制剂加工。

也有一些抗生素工厂在无菌条件下用自动分装机进行小瓶分装

第四章操作规程

发酵工艺进程

4.1.1正常发酵（进程）

1、进料（基质），开备料泵

2、开备料阀

3、备料后（罐重100000KG）关备料阀

4、关备料泵

5、开搅拌器

6、设置搅拌转速为200转

7、开通风阀

8、开排气阀

9、投加菌种

10、补糖，开补糖阀

11、补氮，开加硫铵阀

12、开冷却水，维持温度在25℃

13、PH值维持在必然范围内

14、前体超过1KG/M3（扣分步骤，显现那么扣分）

4.1.2出料

1、停止进空气

2、停搅拌

3、关闭所有进料，开阀出料

4.1.3发酵进程中PH值低

调剂PH值

开大氨水流量

PH值指标

4.1.4发酵进程中PH值高

关闭进氨水

开大补糖阀

调剂PH值

4.1.5发酵进程中溶解氧低

开大进空气阀V02

调剂溶解氧大于30%

4.1.6残糖浓度低

开加糖阀补糖

4.1.7发酵进程中温度高

开通冷却水进水冷却

温度指标

4.1.8泡沫高

添加消泡剂

泡沫高度降低到30CM

提炼工艺进程

4.2.1预处置操作

1、打开阀V14，加发酵液。

2、待加料至5000kg时，关闭阀V14。

3、打开预处置罐搅拌器

4、打开阀V13，加黄血盐，去除铁离子。

5、观看铁离子浓度转变，待铁离子浓度为零时，关闭阀V13。

6、打开阀V12，加磷酸盐，去除镁离子。

7、观看镁离子浓度转变，镁离子浓度为零时，关闭阀V12。

8、打开阀V11，加絮凝剂，去除蛋白质。

9、观看蛋白质浓度转变，蛋白质浓度为零时，关闭阀V11。

10、打开阀V1六、V17及泵P5，同时打开转筒过滤器开关及后阀V18。

11、待发酵液通过滤排至混合罐B101后，关闭阀V1六、V17、泵P5和转筒过滤器开关及后阀V18。

12、停止预处置罐搅拌器。

4.2.2一次BA萃取操作

1、打开混合罐B101搅拌器

2、打开阀V19，加BA（醋酸丁酯）质量为发酵液的1/4~1/3倍。

3、关闭阀V19。

4、打开阀V22，加稀硫酸调剂PH值。

5、待PH值调剂至2~3时，关闭阀V22。

6、打开阀V21，加破乳剂。

7、加破乳剂量为100kg时，关闭阀V21。

8、打开阀V23、V24及泵P6，向分离机注液。

9、待分离机中有液位时，迅速打开A101开关。

10、打开萃余相回收阀V26，调剂V26阀门开度，操纵重相液位在总液位的80%左右，使轻相液能充分的溢流至B102。

11、待混合罐B101液体排空后，关闭阀V23、V24及泵P6。

12、停止混合罐B101搅拌器。

13、待分离机A101中液体排尽后，关闭阀V26。

14、关闭分离机A101开关

4.2.3一次反萃取操作

1、打开混合罐B102搅拌器。

2、打开V28，加碳酸氢钠溶液，质量为青霉素溶液的3~4倍，并调剂PH值为7~8

3、待PH值调剂至7~8时，关闭阀V28。

4、打开阀V2九、V30及泵P7，向分离机A102注液。

5、待分离机A102中有液位时，迅速打开A102开关。

6、打开萃余相回收阀V32，调剂V32阀门开度，操纵重相液位在总液位的80%左右，轻相液能充分的溢流出。

7、待混合罐B102液体排空后，关闭阀V2九、V30及泵P7。

8、停止混合罐B102搅拌器。

9、待分离机中剩余少量重液时，关闭阀V32，避免轻液流入混合罐B103中

10、关闭分离机A102开关

4.2.4二次BA萃取操作

1、打开混合罐B103搅拌器。

2、打开阀V33，加BA（醋酸丁酯）质量为发酵液的1/4~1/3倍。

3、关闭阀V33。

4、打开阀V35，加稀硫酸调剂PH值。

5、待PH值调剂至2~3时，关闭阀V35。

6、打开阀V3六、V37及泵P8。

7、待分离机中有液位时，迅速打开A103开关。

8、打开萃余相回收阀V39，调剂V