第一部分 基础性实验.docx
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第一部分基础性实验
第一部分基础性实验
实验一总糖和还原糖的测定——斐林氏法
总糖和还原糖测定方法较多，如3，5—二硝基水杨酸法、碱性铜试剂法、蒽酮比色法、斐林氏法等。
这里只介绍斐林氏法。
一、目的
学习掌握生产实践中常用的快速定糖方法。
二、原理
6
还原糖在碱性溶液中能将Ag+，Hg+，Cu2+，Fe（CN）3-等金属离子还原，而糖本身则氧化成各种羟酸，利用这一特性可以对还原糖进行定量测定。
本实验采用斐林试剂热滴定法，氧化剂是斐林试剂，它是由甲乙两种溶液组成，甲液中含有硫酸铜、次甲基蓝；乙液中含有氢氧化钠、酒石酸钾钠和亚铁氰化钾（黄血盐）。
当甲乙两液混合时，硫酸铜和氢氧化钠作用形成氢氧化铜沉淀，由于溶液中存在酒石酸钾钠，它和氢氧化铜形成了可溶性络合物。
COONaCOONa
酒石酸络铜（Ⅱ）钾钠盐在与还原糖共热时，二价铜离子即被还原成一价的氧化亚铜红色沉淀。
COONa
葡萄糖酸氧化亚铜
此氧化亚铜与试剂中亚铁氰化钾反应生成可溶性的亚铁氰酸络铜（Ⅰ）钾盐。
Cu2O+K4Fe（CN）6+3H2OK2Cu2Fe（CN）6+2KOH+2H2O
亚铁氰化钾亚铁氰酸络铜（Ⅰ）钾盐
斐林试剂中二价铜的还原力比次甲基蓝强，因此所滴入的标准葡萄糖溶液首先使二价铜还原，只有当二价铜被还原完毕后，才能使次甲基蓝（甲烯蓝）还原为无色，测定中以此作为滴定终点。
在测定时先做一对照管（不加样品），用标准葡萄糖滴定求知一定体积斐林试剂中二价铜和次甲基蓝的量，即测定对照管消耗的标准葡萄糖量（A）。
再做样品管，样品中还原糖消耗斐林试剂中一部分二价铜，剩余的量再用标准葡萄糖来滴定，即样品消耗的标准葡萄糖量（B）。
将（A）减去（B）就可求得样品中还原糖量。
三、器材及试剂：
1．器材：
①山芋粉②广范试纸pH1～12。
③吸管5毫升（×4），10毫升（×2）④容量瓶100毫升（×3）
⑤烧杯150毫升（×1），100毫升（×1）⑥三角烧瓶250毫升（×6）
⑦滴定管25毫升（×1）⑧双孔橡皮塞
⑨电炉300W（×1）⑩天平。
2．试剂
①斐林氏甲液：
15克硫酸铜、克次甲基蓝溶于1升蒸馏水中。
②斐林氏乙液：
50克酒石酸钾钠、54克氢氧化钠、4克亚铁氰化钾溶于1升蒸馏水中。
③%标准葡萄糖溶液：
准确称取干燥恒重的葡萄糖1.00克，加入少量蒸馏水溶解后，再加8毫升浓盐酸（防止微生物生长），蒸馏水定容至1升。
④6mol·L-1盐酸；
⑤6mol·L-1氢氧化钠。
四、操作步骤
1．还原糖提取：
称取2.00克山芋粉，在小烧杯中先用少量水调成糊状，再加入70毫升水，50℃保温15分钟，取出后定容至100毫升，
经过滤，取滤液进行还原糖测定。
2．总糖水解：
称取1.00克山芋粉在小烧杯中，加
6mol·L-1盐酸10毫升，蒸馏水15毫升，在沸水浴上加
热半小时，取出后用6mol·L-1氢氧化钠中和至中性，然
后定容至100毫升，经过滤，取滤液10毫升稀释至100
毫升，即为稀释1000倍的总糖水解液。
3．糖的定量测定：
按图1-1装置热滴定仪器。
在三
角瓶中按下表加入各试剂。
在加入斐林试剂甲液和乙液后，
为了保证处于沸腾状态下快速滴定（整个滴定时间在三分
钟内完成），在滴定前先从滴定管中加入适量的葡萄糖液，
然后在沸腾状态下以4～5秒一滴的速度，继续自滴定管
加入葡萄糖液，直至蓝色消失停止滴定。
由于还原型的次
甲基蓝遇到空气后又能转为氧化型，而恢复蓝色，因此当
滴定到蓝色刚消失，出现黄色时应立即停止滴定，如果再现蓝色切勿继续滴定。
瓶号
斐林氏试剂
还原糖
提取液
（毫升）
总糖
水解液
（毫升）
0.1%葡萄
糖初滴入量
（毫升）
加
热
至
沸
腾
状
态
%葡萄
糖滴定总量
（毫升）
甲液
（毫升）
乙液
（毫升）
1
2
3
4
5
6
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
—
—
5
5
—
—
—
—
—
—
5
5
7
7
—
—
—
—
五、计算：
按下式分别计算山芋粉中还原糖和总糖的百分量。
还原糖%=
总糖%=
上式中A为空白所耗葡萄糖毫升数，B为样品溶液所耗葡萄糖毫升数。
思考题
1、本实验所使用的费林试剂含有什么化学成分？
它们的作用是什么？
2、为什么要做空白测定？
试说明该法实验误差的来源及消除方法。
3、如何应用该法测定植物材料的淀粉含量？
实验二粗脂肪的定量
（Soxhlet提取法）
一、目的：
学习索氏提取法测定粗脂肪含量的原理及方法。
二、原理：
所谓粗脂肪，是脂肪、游离脂肪酸、蜡、磷脂、固醇及色素等脂溶性物质的总称。
索氏（soxhlet）脂肪提取器为一回馏装置（图2-1），由浸提管、小烧瓶及冷凝管三者连接而成。
浸提管两侧分别有虹吸管及通气管，盛有样品的滤纸斗（包）放在浸提管内。
溶剂（乙醚）盛于小烧瓶中，加热后，溶剂蒸汽经通气管至冷凝管，冷凝之溶剂滴入浸提管，浸提样品。
浸提管内溶剂愈积愈多，当液面达到一定高度，溶剂及溶于溶剂中的粗脂肪即经虹吸管流入小烧瓶。
流入小烧瓶的溶剂由于受热而气化，气体至冷凝管又冷凝而滴入浸提管内，如此反复提取回馏，即将样品中的粗脂肪提尽并带到小烧瓶中。
最后，将小烧瓶中的溶剂蒸去，烘干，小烧瓶增加之重量，即样品中粗脂肪含量。
三、器材及试剂：
1．器材：
①麦麸以及其他动、植物材料。
②滤纸。
③索氏提取器（一套）。
④分析天平。
⑤恒温水浴锅
⑥干燥器。
⑦铁架台。
⑧橡皮管。
⑨万能夹。
⑩干燥箱。
电吹风。
2．试剂：
无水乙醚：
市售无水乙醚往往仍有水分，需处理后使用，处理方法如下：
①含水较多的乙醚，可先于乙醚中投入无水氯化钙（约为总体积1/3），1—2天后，过滤，水浴蒸馏，收集36℃馏出液。
于此馏出液中加适量金属钠①（需用压钠机压成钠条或用刀切成薄片），1—2天后蒸馏，收集36℃馏出液，即得无水乙醚。
②水分较少的乙醚，可于每500g乙醚中加入30g—50g无水硫酸钠或金属钠，1—2天后蒸馏，收集36℃馏出液。
四、操作步骤：
1．将洗净的索氏提取器小烧瓶用铅笔在磨口处编号，103—105℃烘2小时②，取出，置干燥器内冷却。
分析天平称重，并记录之。
2．用分析天平称取干样约2g（准确至小数点后4位。
样品需研碎，通过40目筛孔），用滤纸包好③，放入浸提管内。
3．于已称重的小烧瓶内倒入1/2—2/3④体积的无水乙醚。
连接索氏提取器各部分，恒温水浴锅加热回馏2—4小时（样品含脂量高的，应适当延长时间）⑤。
控制水浴温度，每小时回馏3—5次较宜⑥。
4．提取完毕，待乙醚完全流入小烧瓶时，取出滤纸包，再回馏一次以洗涤浸提管。
继续加热，待浸提管内乙醚液面接近虹吸管上端而未流入小烧瓶前，倒出浸提管中之乙醚。
如果小烧瓶中尚留有乙醚，则继续加热蒸发，直到小烧瓶中溶剂基本蒸尽，停止加热，取下小烧瓶，用吹风机将瓶中残留乙醚吹尽⑦，再置103—105℃烘箱中烘半小时，取出置干燥器中冷至室温，称重，由小烧瓶增加之重量可计算出样品的脂肪含量。
按同法，用不包样品的滤纸包做空白测定。
测定脂肪后，小烧瓶需先用2%氢氧化钠酒精浸泡，再用肥皂洗净烘干保存。
注意：
进行本实验时应切实注意防火，乙醚为易燃品，切忌明火加热，同时要注意提取器各连接处是否漏气，以及冷凝管冷凝效果是否良好，以免大量乙醚蒸气外逸。
附：
水分测定
取扁形称量瓶⑧2只，洗净，用铅笔在磨口处作好记号，置103—105℃烘箱中烘2小时，移入干燥器内，冷至室温（约10—15分钟），称重（准确于小数点后第4位，下同）。
用称过重量的称量瓶，各称取粉碎样品（麦麸）2g，同时于103—105℃烘2小时，取出置干燥器中冷却，称重。
如此重复烘烤，直至恒重⑨，按下式计算样品的含水量。
①金属钠遇水爆炸，应注意。
不能用手直接拿取！
用后之金属钠条（片），可用二甲苯洗去外层黄色物质，再浸入煤油中并贮于密封容器。
②空索氏提取器小烧瓶（以及空称量瓶）经103—105℃烘烤2小时即恒重。
③滤纸包必须用丝线扎好，保证样品不漏散，最好用特制的滤纸斗，斗口塞以脱脂棉。
样品包（斗）放入浸提管后，其高度不能超过乙醚面的最高高度。
④装入乙醚之量，应以在回馏过程中小烧瓶内有适量乙醚存在为准，如发现小烧瓶中脂肪颜色变深（似烧焦状），系溶剂太少或温度太高。
⑤用水浴锅加热，但所用之水需清洁（用蒸馏水），提取完毕后，如小烧瓶外部沾有污渍，应洗刷干净，再烘烤称重。
⑥回馏速度不宜太快，否则样品中脂肪不易浸提完全。
太慢则时间不经济。
至于提取时间的多寡，与样品用量、脂肪含量及颗粒大小有关，本实验所用样品量及提取时间仅适于测定麦麸。
⑦必须将小烧瓶中残留之少量乙醚在通风处赶尽，然后再放入烘箱，否则易发生事故。
⑧如用高型称量瓶，样品水分不易烤干应经常翻拌样品，为此可置一小玻棒于瓶内，一并烘烤与称重。
用扁型称量瓶时，样品也应薄薄地平铺于瓶底，不宜过多。
⑨衡量是否恒重的标准，应根据各个实验的有效数字而定，本实验以前后两次重量之差不超过10mg，即可。
水分%=
注意：
1．烘烤样品时，必须将称量瓶盖子打开，斜搁在称量瓶口上，以免水分不能蒸发，但也不必将盖子取下，否则容易弄脏弄错。
2．冷却和称重时，应将称量瓶盖子盖好，称重要迅速，干燥器中的吸水剂需新鲜，否则将因样品吸收水分，甚至重量反而增加。
3、在整个操作过程中，应保持称量瓶清洁，不能用手直接拿取。
思考题
1．本法提取的为何是粗脂肪？
2．做好本实验应注意哪些事项？
3．如果所取样品未烘干至恒重，那么实验中称得粗脂肪重与滤纸包内容物重之和是否与所取样品重量相等？
为什么？
实验三蛋白质的性质实验
Ⅰ．蛋白质及氨基酸的呈色反应
一、目的：
1．了解构成蛋白质的基本结构单位及主要连接方式。
2．了解蛋白质和某些氨基酸的呈色反应原理。
3．学习几种常用的鉴定蛋白质和氨基酸的方法。
二、呈色反应：
（一）双缩脲反应
1．原理：
素加热至180℃左右，生成双缩脲并放出一分子氨。
双缩脲在碱性环境中能与Cu2+结合生成紫红色化合物，此反应称为双缩脲反应。
蛋白质分子中有肽键，其结构与双缩脲相似，也能发生此反应。
可用于蛋白质的定性或定量测定。
双缩脲反应不仅为含有两个以上肽键的物质所有。
含有一个肽键和一个—CS—NH2，—CH2—NH2，—CRH—NH2，—CH2—NH2—CHNH2—CH2OH或—CHOHCH2NH2等基团
NH2NH2
的物质以及乙二酰二胺（O＝C——C＝O）等物质也有此反应。
NH3也干扰此反应，因为NH3与Cu2+可生成暗蓝色的络离子Cu（NH3）42+。
因此，一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。
2．试剂：
①尿素②10%氢氧化钠溶液
③1%硫酸铜溶液④2%卵清蛋白溶液
3．操作：
取少量尿素结晶，放在干燥试管中。
用微火加热使尿素熔化。
熔化的尿素开始硬化时，停止加热，尿素放出氨，形成双缩脲。
冷后，加10%氢氧化钠溶液约1ml，振荡混匀，再加1%硫酸铜溶液1滴，再振荡。
观察出现的粉红颜色。
要避免添加过量硫酸铜，否则，生成的蓝色氢氧化铜能掩盖粉红色。
向另一试管加卵清蛋白溶液约1ml和10%氢氧化钠溶液约2ml，摇匀，再加1%硫酸铜溶液2滴，随加随摇。
观察紫玫瑰色的出现。
（二）茚三酮反应
1．原理
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。
β—丙氨酸、氨和许多一级胺都呈阳性反应。
尿素、马尿酸、二酮吡唪和肽键上的亚氨基不呈现此反应。
因此，虽然蛋白质和氨基酸均有茚三酮反应，但能与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。
在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。
该反应十分灵敏，1∶1500000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。
茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。
反应机理如下：
此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。
2．试剂：
①蛋白质溶液
2%卵清蛋白或新鲜鸡蛋清溶液（蛋清∶水=1∶9）
②0.5%甘氨酸溶液
③0.1%茚三酮水溶液
④0.1%茚三酮-乙醇溶液
3．操作：
①取2支试管分别加入蛋白质溶液和甘氨酸溶液1ml，再各加0.5ml0.1%茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1~2分钟，观察颜色由粉色变紫红色再变蓝。
②在一小块滤纸上滴一滴0.5%甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴一滴0.1%茚三酮乙醇溶液，在微火旁烘干显色，观察紫红色斑点的出现。
（三）黄色反应
1．原理：
含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。
反应式如下：
多数蛋白质分子含有带苯环的氨基酸，所以有黄色反应，苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。
2．试剂：
①鸡蛋清溶液
将新鲜鸡蛋的蛋清与水按1∶20混匀，然后用6层纱布过滤。
②大豆提取液
将大豆浸泡充分吸胀后研磨成浆状再用纱布过滤。
③头发④指甲
⑤0.5%苯酚溶液⑥浓硝酸
⑦%色氨酸溶液⑧0.3%酪氨酸溶液
⑨10%氢氧化钠溶液
3．操作：
向7个试管中分别按下表加入试剂，观察各管出现的现象，有的试管反应慢可略放置或用微火加热。
待各管出现黄色后，于室温下逐滴加入10%氢氧化钠溶液至碱性，观察颜色变化。
管号
1
2
3
4
5
6
7
材料
（滴）
鸡蛋清
溶液
4
大豆
提取液
4
指甲
少许
头发
少许
%
苯酚
4
0.3%
色氨酸
4
0.3%
酪氨酸
4
浓硝酸/（滴）
2
4
40
40
4
4
4
现象
（四）考马斯亮蓝反应
1．原理：
考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。
在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质通过疏水作用结合后变为蓝色。
它染色灵敏度高，比氨基黑高3倍。
反应速度快，约在2分钟左右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。
在0.01~1.0mg蛋白质范围内，蛋白质浓度A595nm值成正比。
所以常用来测定蛋白质含量。
2．试剂：
①蛋白质溶液（鸡蛋清∶水=1∶20）
②考马斯亮蓝染液
考马斯亮蓝G250100g溶于50ml95%乙醇中，加100ml85%磷酸混匀，配成原液。
临用前取原液15ml，加蒸馏水至100ml，用粗滤纸过滤后，最终浓度为%。
3．操作：
取2支试管，按下表操作
试剂
管号
蛋白质溶液
（ml）
蒸馏水
（ml）
考马斯亮蓝染液
（ml）
1
0
1
5
2
5
思考题
1．写出蛋白质中可以与双缩脲试剂反应的化学基团的名称及化学结构。
2．一个分子中必须有几个上述化学基团才能给出双缩脲反应的阳性结果？
双缩脲试剂与二肽和三肽都能进行反应吗？
3．如果蛋白质水解作用一直进行到双缩脲反应呈阴性结果，此时可对水解作用进行的程度作出什么结论？
4．如果蛋白质中的氨基酸的平均分子量为125，在分子量为150000的蛋白质分子中存在着多少个上述化学基团？
5．茚三酮反应的阳性结果是否经常是同一色调？
并说明原因。
6．你能区分蛋白质茚三酮反应及其他氨基化合物茚三酮反应的结果吗？
试解释之。
7．能否利用茚三酮反应可靠地鉴定蛋白质的存在？
8．哪些芳香基因（蛋白质中的、非蛋白质中的）可以与浓硝酸作用呈现黄色反应的阳性结果？
9．是否所有氨基酸都呈现黄色反应的阳性结果？
为什么？
是否大部分蛋白质呈现阳性结果？
为什么？
Ⅱ．蛋白质的沉淀反应
一、目的：
1．加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识。
2．了解沉淀蛋白质的几种方法及其实用意义。
3．了解蛋白质变性与沉淀的关系。
二、原理：
在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。
蛋白质的沉淀反应可分为两类。
（1）可逆的沉淀的反应此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。
如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。
提纯蛋白质时，常利用此类反应。
（2）不可逆沉淀反应此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。
加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。
因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
三、器材及试剂：
①蛋白质溶液
5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液（新鲜鸡蛋清∶水=1∶9）
②pH4.7醋酸-醋酸钠的缓冲溶液③3%硝酸银溶液
④5%三氯乙酸溶液⑤95%乙醇
⑥饱和硫酸铵溶液⑦硫酸铵结晶粉末
⑧0.1mol·L-1盐酸溶液⑨0.1mol·L-1氢氧化钠溶液
⑩0.05mol·L-1碳酸钠溶液
0.1mol·L-1醋酸溶液
甲基红溶液
2%氯化钡溶液
四、操作步骤：
1．蛋白质的盐析无机盐（硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等）的浓溶液能析出蛋白质。
盐的浓度不同，析出的蛋白质也不同。
如球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则在饱和硫酸铵溶液中才能析出。
由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时，又能再溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。
加5%卵清蛋白溶液5ml于试管中，再加等量的饱和硫酸铵溶液，混匀后静置数分钟则析出球蛋白的沉淀。
倒出少量混浊沉淀，加少量水，观察是否溶解，为什么？
将管中内容物过滤，向滤液中添加硫酸铵粉末到不再溶解为止，此时析出的沉淀为清蛋白。
取出部分清蛋白，加少量蒸馏水，观察沉淀的再溶解。
2．重金属离子沉淀蛋白质重金属离子与蛋白质结合成不溶于水的复合物。
取1支试管，加入蛋白质溶液2ml，再加3%硝酸银溶液1~2滴，振荡试管，有沉淀产生。
放置片刻，倾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？
为什么？
3．某些有机酸沉淀蛋白质取1支试管，加入蛋白质溶液2ml，再加1ml5%三氯乙酸溶液，振荡试管，观察沉淀的生成。
放置片刻，倾出上清液，向沉淀中加入少量水，观察沉淀是否溶解。
4．有机溶剂沉淀蛋白质取1支试管，加入2ml蛋白质溶液，再加入2ml95%乙醇。
混匀，观察沉淀的生成。
5．乙醇引起的变性与沉淀取3支试管，编号。
依下表顺序加入试剂：
试剂（ml）
管号
5%卵清
蛋白溶液
0.1mol·L-1
氢氧化钠
溶液
mol·L-1
盐酸溶液
95%乙醇
pH4.7
缓冲溶液
1
2
3
1
1
1
—
1
—
—
—
1
1
1
1
1
—
—
振摇混匀后，观察各管有何变化。
放置片刻，向各管内加水8ml，然后在第2、3号管中各加一滴甲基红，再分别用0.1mol·L-1醋酸溶液及0.05mol·L-1碳酸钠溶液中和之。
观察各管颜色的变化和沉淀的生成。
每管再加0.1mol·L-1盐酸溶液数滴，观察沉淀的再溶解。
解释各管发生的全部现象。
思考题
1．你如何从低分子量的胺类化合物（非蛋白质的化合物）分离出蛋白质来？
2、鸡蛋清为何可做铅、汞中毒的解素剂？
3．氯化汞为何能做为杀菌剂？
4．沉淀、变性之间有什么样的关系？
哪些沉淀往往伴随变性？
5．有机酸（如三氯乙酸）沉淀蛋白质有无实际应用意义？
6．有机溶剂是否一定引起蛋白质发生变性？
Ⅲ．蛋白质等电点测定
一、目的：
了解等电点的意义及其与蛋白质分子聚沉能力的关系。
二、原理：
蛋白质的分子量很大，它能形成稳定均一的溶液，主要是由于蛋白质分子都带有相同符号的电荷，同时蛋白质分子周围有一层溶剂化的水膜，避免蛋白质分子之间聚集而沉降。
蛋白质分子所带的电荷与溶液的pH值有很大关系，蛋白质是两性电解质，在酸性溶液中成阳离子，在碱性溶液中成阴离子：
蛋白质分子所带净电荷为零时的pH值称为蛋白质的等电点（PI）。
在等电点时，蛋白质分子在电场中不向任何一极移动，而且分子与分子间因碰撞而引起聚沉的倾向增加，所以这时可以使蛋白质溶液的粘度、渗透压均减到最低，且溶液变混浊。
若再加入一定量的溶剂如乙醇、丙酮，它们与蛋白质分子争夺水分子，竭力减低蛋白质水化层的厚度而使混浊更加明显。
各种蛋白质的等电点都不相同，但偏酸性的较多，如牛乳中的酪蛋白的等电点是~，血红蛋白等电点为，胰岛素是，鱼精蛋白是一个典型的碱性蛋白，其等电点在pH12.0~12.4。
近年来蛋白质的等电点可以采用等电聚焦技术加以准确测定，但需一定的实验条件。
本实验采用蛋白质在不同pH溶液中形成的混浊度来确定，即混浊度最大时的pH值即为该种蛋白质的等电点值，这个方法虽然不很准确，但在一般实验条件下都能进行，操作也简便。
三、器材及试剂：
1．器材：
①试管×厘米（×9）。
②吸管1毫升（×2），2毫升（×2），10毫升（×2）。
③容量瓶50毫升（×2），500毫升（×1）。
④试管架。
2．试剂：
①·L-1醋酸溶液。
②0.1mol·L-1醋酸溶液。
③1mol·L-1醋酸溶液。
④1mol·L-1氢氧化钠溶液（氢氧化钠和醋酸溶液的浓度要标定）。
⑤酪蛋白。
四、操作步骤：
1．制备蛋白质胶液
（1）称取酪蛋白3克，放在烧杯中，加入40℃的蒸馏水。
（2）加入50毫升1mol·L-1氢氧化钠溶液，微热搅拌直到蛋白质完全溶解为止。
将溶解好的蛋白溶液转移到500毫升容量瓶中，并用少量蒸馏水洗净烧杯，一并倒入容量瓶。
（3）在容量瓶中再加入1mol·L-1醋酸溶液50毫升，摇匀。
（4）加入蒸馏水定容至500毫升，得到略现浑浊的，在0.1mol·L-1NaAC溶液中的酪蛋白胶体。
2．等电点测定
按下表顺序在各管中加入蛋白质胶液，并准确地加入蒸馏水和各种浓度的醋酸溶液，加入后立即摇匀。
管号
蛋白质
胶液
（毫升）
H2O
（毫升）
mol·L-1
HAC
（毫升）
mol·L-1
HAC
（毫升）
1mol·L-1
HAC
（毫升）
pH
观察
0
分钟
10分钟
20分钟
1
2
3
4
5
6
7
8
9
1
1
1
1
1
1
1
1
1
—
—
—
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1.60
观察各管产生的混
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