毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选.docx

毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选.docx

《毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选.docx（17页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

毕赤酵母电转化方法及转化子的筛选

Pichia酵母表达直接PCR

1.平板上的菌落长到肉眼可见时〔约12小时〕；

2.取1ml酵母悬液4000rmp离心，pbs重悬，煮沸5mins，放到冰上5mins，直接就可以用做pcr的模板了

3.将除了模板之外的其它PCR反响液的组分准备好，并分装。

3.用灭菌的牙签挑取菌落，在PCR管中涮一下，PCR扩增，

利用5’AOX1和3’AOX1引物对转化子进行PCR复筛,同时检测基因插入（如果重组质粒以单交换的方式整合到Pichiapastoris基因组，那么会扩增到两条带，一条为2.2kb〔KM71为3.6kb〕宿主茵AOXI基因，另一条为包括目的基因和成熟肽序列和a-factor）

Each50µlaliquotofcompetentPichiacellswith3µglinearizedplasmidDNAwillyield50coloniesonselectivemedium.

Muts表型重组酵母的诱导表达实验

Asageneralrulewheninducingexpression,neverallowculturestobemorethan10-30%ofyourtotalflaskvolume.

1.挑选一单菌落，置于装有50mlMGY、BMG或BMGY培养基的500ml摇瓶中，于28-30°C/250-300rpm培养至OD600=2-6（~16-18h）；

2.室温下1500~3000g离心5min，收集菌体，用1/5到1/10原培养体积的MM,BMM或BMMY重悬菌体〔约2.5~5ml〕；

3.将步骤2所得的菌液置于100ml的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30°

C/250-300rpm的摇床上继续生长；

4.每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5～1.0%；

5.按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5mlEP管中，最大转速离心2~3min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最正确收获时间。

时间点一般取：

0、24、48、72、96和120h；

6.对分泌表达，别离样品的上清液；对胞内表达，别离样品的菌体沉淀，带检测样品用液

氮或干冰速冻后，于-80°C保存备用；

7.可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。

Mut+表型重组酵母的诱导表达实验

1.挑选一单菌落，置于装有25mlMGY、BMG或BMGY培养基的250ml摇瓶中，于28-30°C/250-300rpm培养至OD600=2-6（~16-18h）；

2.室温下1500~3000g离心5min，收集菌体，用MM、BMM或BMMY重悬菌体，使OD600=1.0左右〔约100~200ml〕；

3.将步骤2所得的菌液置于1L的摇瓶中，用双层纱布或粗棉布封口，放置于28-30°C/250-300rpm的摇床上继续生长；

4.每24h向培养基中添加100％甲醇至终浓度为0.5～1.0%；

5.按时间点分别取菌液样品，取样量为1ml，置于1.5mlEP管中，最大转速离心2~3min，分别收集上清和菌体，分析目的蛋白的表达量和菌液最正确收获时间。

时间点一般取：

0、6、12、24、36、48、60、72、84和96h；

6.对分泌表达，别离样品的上清液；对胞内表达，别离样品的菌体沉淀，带检测样品用液氮或干冰速冻后，于-80°C保存备用；

7.可以用SDS-PAGE、Western-Blot及活性实验检测与鉴定重组蛋白的表达。

BMGY和BMMY的换液方式有2种：

1）一种是离心换液，即在生长培养结束后，转移到灭菌大离心管中，4000rpm室温离心5分钟后，用BMMY洗下菌体，再转移到摇瓶，整个过程均用灭菌移液管操作。

2）另一种是静止换液，即在生长培养结束后，将摇瓶

是离心换液或者静止换液，到底那个好，只有根据自己的实验结果来考量。

如果只是从防治污染的角度来说，静止换液也好一些，因为操作毕竟少一些，速度也快。

用新开启的分析纯甲醇，一直放在无菌室里面，每次直接用灭菌TIP吸取参加摇瓶就可以了。

也有人试过用膜过滤，结果膜都溶解了。

菌体是在BMMY中培养的，可以不用BMMY做对照，在600nm处测OD值，培养基和PBS光吸收都很低，PBS更方便。

如果用1体积的BMGY，在生长阶段结束后，换液时，参加1/10-瓶很难

摇瓶不能像发酵罐那样保证通气量，但可以通过装量来暂时替代这个指标。

Mut+/Muts的筛选

用SacI，SalIorStuI线性化插入HIS4位点的载体转化GS155后，多数转化子应为Mut+，但也有His+Muts的转化子存在〔见Invitrogenprotocolp36〕，NotIorBglII线性化插入AOXI位点的载体转化GS155后，用MD/MM平板可区分Mut+/Muts。

UsetheplatescontainingtheHis+transformantsandscreenfortheMut+andMutSphenotypeasdescribedbelow.

1.Usingasteriletoothpick,pickonecolonyandstreakorpatchoneHis+transformantinaregularpatternonbothanMMplateandanMDplate,makingsuretopatchtheMMplatefirst.

2.Useanewtoothpickforeachtransformantandcontinueuntil100transformantshavebeenpatched（2-3plates）.

3.TodifferentiateMut+fromMutS,makeonepatchforeachofthecontrols（GS115/His+MutSAlbuminandGS115/His+Mut+β-gal）ontotheMDandMMplates.

4.Incubatetheplatesat30°Cfor2days.

5.After2daysorlongerat30°C,scoretheplates.Mut+transformantswillgrowwellonbothMDandMMplates.MutStransformantswillgrowwellonMDplates,butshowlittleornogrowthontheMMplates.

WerecommendpurifyingyourHis+transformantstoensureisolationofapureclonalisolates.YoumaydothisbeforeoraftertestingfortheMutphenotype.

Replica-PlatingProcedure

Thisproceduregivesalowerrateofmisclassifications,butitincreasestheoverallMut+/MutSscreeningprocedureby2days.Youwillneedequipmenttoreplica-plate.

1.Usingsteriletoothpicks,patch100His+transformantonMDplates（2-3plates）.Forcontrols,makeonepatchfromeachofthestrainsGS115/His+MutSAlbuminandGS115/His+Mut+β-galontotheMDplates.

2.Incubatetheplatesat28-30°Cfor2days.

3.After2days,replica-platethepatchesfromtheMDplatesontofreshMMandMDplatestoscreenforMutStransformants.

4.Incubatethereplicaplatesat28-30°Cfor2days.

5.After2daysat28-30°C,scorethereplicaplates.LookforpatchesthatgrownormallyontheMDreplicaplatesbutshowlittleornogrowthontheMMreplicaplates.IncludingHis+Mut+andHis+MutScontrolpatchesoneachplatewillprovideexamplesofMut+andMutSphenotypes.

ScreeningbyFunctionalAssay

SomeresearchershaveusedafunctionalassaytodirectlyscreenforhighexpressingPichiarecombinantcloneswithoutfirstscreeningforMutSorMut+phenotypes.Ifyouelecttoscreendirectlyforhigh-expressingrecombinants,besuretoalsochecktheMutphenotype.Thiswillhelpyouoptimizeexpressionofyourrecombinantclone.

毕赤

⑴接种重组和空质粒转化子于5mlYPD+k抗生素培养基，GS115菌于YPD培养基作对照，30℃，培养16～18小时。

⑵室温下，1500g离心5-10min收集菌体

⑶100ulTE〔pH7.0〕重悬，参加300ulEDTA〔pH8.0〕，0.07MTris－HCl，3ulβ-巯基乙醇，1ulLyticase，37℃水浴30min。

⑷10000g离心5~10min，取沉淀，加90ulTE重悬。

⑸200ul饱和酚，200ul氯仿，混匀，离心30s，取上层水相。

⑹参加两倍体积无水乙醇以及1/10体积的NaAC，-20℃放置30min；

⑺10000g离心20min，弃上清；75%乙醇漂洗沉淀一次；

⑻枯燥后，参加15μl的TE或H2O溶解，-20℃备用。

重组菌株传代次数太多，确实可能存在菌株退化的现象。

所以一定要保存好最原始的重组菌株，每次从中划板，挑单克隆高表达菌株。

Pichia菌落PCR〔史飞〕：

30ul培养液，0.2%SDS

Votex15sec

离心1min

取上清，稀释5-10倍

用于PCR模板

GS115

接种GS115于5mlYPD液体培养基，30℃，200rpm振荡过夜，涂布YPD平板，30℃培养48小时，用YNB根本培养基和含His的补充培养基作点种别离纯化，挑选在补充培养基生上生长而在根本培养基上不生长的单菌落划YPD平板，4℃保存。

GS115的his4基因突变了，不能在组胺酸缺陷型培养基上生长，一般的YPD培养基营养丰富，什么都有了，而YNB却只含根本氮源，GS115应该在上面不长，就是从YPD上挑菌落，在YNB和补充了HIS的平板上对应的点一下，在HIS上长而YNB上不长的是GS115，这样能挑到纯的，以防突变

毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制

10*YNB〔含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母根底氮源培养基〕4℃保存。

34g酵母根底氮源培养基〔无硫酸铵〕+100g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌，或134gYNB固体溶于1L蒸馏水，过虑除菌or115℃15-20min灭菌。

注意毕赤酵母在高浓度YNB下生长更好，所用YNB的量是酿酒酵母中的两倍。

500*B〔0.02%生物素Biotin〕20mg的生物素溶于100ml水中，水浴加热溶解，温度不能高于50度。

过滤除菌。

4℃保存保存期为1年。

D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。

在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。

天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNBMD、MM属于根底培养基，没有哪种成分会含有微量生长因子〔如生物素〕，所以肯定要加的。

100*H〔0.4%Histidine组氨酸〕4℃保存保存期为1年。

400mg的L-组氨酸溶于100ml水中，〔加热至50℃以促进溶解〕，过滤除菌。

10*D〔20%Dextrose葡萄糖〕保存期为1年。

200g葡萄糖溶于1000ml水中，115℃灭菌15-20min或过滤除菌。

10*M〔5%Methanol甲醇〕保存期为2个月。

将5ml的甲醇与95ml水混匀，过滤除菌。

10*GY〔10%Glycerol甘油〕保存期为1年以上。

将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。

100*AA〔0.5%ofeachAminoAcid，各种氨基酸〕4℃保存保存期为1年。

分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中，过滤除菌。

1M磷酸钾溶液〔potassiumphosphatebuffer，pH6.0〕，将1mol/L的K2HPO4溶液132ml与1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀，其pH为6.0，如需调节pH，那么使用磷酸和氢氧化钾调节pH。

1M山梨醇

毕赤酵母表达的培养基配制

2.1LB〔Luria－Bertani〕培养基：

Tryptonl％

YeastExtract0.5％

NaCll％

PH7.0制作平板时参加2％琼脂粉。

121℃高压灭菌20min。

可于室温保存。

2.2LLB〔LowSaltLB〕培养基：

Tryptonl％

YeastExtract0.5％

NaCl0.5％

PH7.0制作平板时参加2％琼脂粉。

121℃高压灭菌20min。

可于室温保存数月。

2.3YPD完全培养基〔又称YEPD〕〔YeastExtractPeptoneDextroseMedium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基〕

Yeastextract1%10g/L

Trypton2%20g/L

dextrose（Dglucose）2%20g/L

+agar2%20g/L

液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。

YPD或YEPD：

YeastExtractPeptoneDextroseMedium（1L），又叫酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，参加琼脂的又叫酵母膏胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基.　

YPD

1.溶解10gYeastExtract（酵母膏）,20gPeptone（蛋白胨）于900ml水中，如制平板加20g琼脂粉　　

2.高压121度20min

3.参加100ml20%〔10X，共20g〕的Dextrose（glucose）（葡萄糖），（葡糖糖溶液灭菌后参加）　　

注：

葡萄糖，yeastextract,peptone溶液混合后在高温下可能会发生化学反响，导致培养基成分变化，所以要分别灭菌后再混合。

葡萄糖可以过滤除菌，也可以115℃15-20min灭菌。

YPD培养基用途：

用于酵母菌的培养，及供药品和生物制品含王浆和蜂蜜的合剂酵母菌数测定。

YPEG：

除了用3%乙醇和3%甘油代替葡萄糖作为碳源外，其他成分同YPD;YPDZ是在YPD的根底上加上ZEOCIN抗生素;YPDA是在YPD的根底上加0.003%的腺嘌呤硫酸盐。

2.4MD与MDH选择培养基

MinimalDextroseMedium+〔Histidine〕最小葡萄糖培养基+〔0.004%组氨酸〕〔含有：

1.34%YNB；；4X10-5%生物素；2%葡萄糖〕

1.灭菌800ml的ddwater，冷却到60℃左右，参加

2ml的500*B，

100ml的10*YNB

100ml的10*D母液，4℃保存

2.如配制MDH，可在上述的MD中参加10ml的100*H即可，4℃保存；

3.如配制平板，可无菌水的灭菌前，参加15g的琼脂。

4℃可保存数月。

2.5MM和MMH培养基

MinimalMethanolMedium+〔Histidine〕〔含有：

1.34%YNB；4X10-5%生物素；0.5%甲醇〕

1.灭菌800ml的ddwater，冷却到60℃左右，参加

2ml的500*B，

100ml的10*YNB

100ml的10*M，4℃保存

2.如配制MMH，可在上述的MM中参加10ml的100*H即可，4℃保存；

3.如配制平板，可无菌水的灭菌前，参加15g的琼脂。

4℃可保存数月。

MMorMD是筛选mutS和mut+表型的。

2.6BMG和BMM培养基

BufferedMinimalGlycerol，BufferedMinimalMethanol〔含有100mMpotassiumphosphatepH6.0,1.34%YNB；4X10-5%生物素1%glycerolor0.5%methanol〕

1.灭菌700ml的ddwater，冷却到室温，参加

2ml的500*B，

100ml的10*YNB

100ml的1Mpotassiumphosphatebuffer

100ml的10*GY，4℃保存

2.如配制MMH，可在上述的BMG中用100ml的10*M取代100ml的10*GY即可，4℃保存，可保存2个月。

2.7BMGY和BMMY

BufferedGlycerolcomplexMedium,BufferedMethanolcomplexMedium（含有1%yeastextract,2%peptone,100mMpotassiumphosphatepH6.0,1.34%YNB；4X10-5%生物素1%glycerolor0.5%methanol）

1.溶解10g的yeastextract〔1%〕，20gpeptone〔2%〕在700ml的ddwater，灭菌

2.冷却到室温，参加

2ml的500*B，

100ml的10*YNB

100ml的1Mpotassiumphosphatebuffer

100ml的10*GY，4℃保存

3.如配制BMMY，可在上述的BMGY中用100ml的10*M取代100ml的10*GY即可，4℃保存，可保存2个月。

YPD：

最根本的培养用；BMGY：

诱导表达前培养用；BMMY：

诱导表达用；MD：

电转化后筛选his＋用。

YEPD是不能代替BMGYYPG培养基代替，只是把YEPD中的葡萄糖用3%的甘油代替，也可以降低本钱。

摇瓶毕竟不能和发酵罐比，甘油剩余会抑制甲醇利用。

BMGY、BMMY灭菌后才能加甲醇、磷酸钾、生物素。

配制BMMY时也没必要用5%过滤除菌的甲醇，在灭菌后使用前加100%甲醇至你要的浓度。

YouwillneedeitherBMGY/BMMY（bufferedcomplexglycerolormethanolmedium）,BMG/BMM（bufferedminimalglycerolormethanolmedium）orMGY/MM（minimalglycerolorminimalmethanolmedium）forexpression.BMG,BMM,BMGY,andBMMYareusuallyusedfortheexpressionofsecretedproteins,particularlyifpHisimportantfortheactivityofyourprotein.UnlikeMGYandMM,theyareallbufferedmedia.Becausethesemediaarebufferedwithphosphatebuffer,awiderangeofpHvaluesmaybeusedtooptimizeproductionofyourprotein.BMGY/BMMYcontainyeastextractandpeptonewhichmayhelpstabilizesecretedproteinsandpreventordecreaseproteolysisofsecretedproteins.Inclusionofyeastextractandpeptoneactasa"mixedfeed"allowingbettergrowthandbiomassaccumulation.

2.8YPDS培养基〔YeastExtractPeptoneDextrosesorbitolMedium酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基/山梨醇〕：

山梨醇:

稳定的渗透压，在电击过程中保护宿主细胞,改变细胞膜的通透性

yeastextract1%

peptone2%

dextrose（glucose）2%

sorbitol1M

+agar2%

不管是液体YPDS培养基，还是YPDS+G418培养基，必须存放4℃条件下，有效期1～2周。

2.9MGY

MinimalGlycerolMedium〔最小甘油培养基〕〔34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素〕。

将800ml灭菌水、100ml的10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4℃保存，保存期为2个月。

2.10MGYH

MinimalGlycerolMedium+Histidine〔最小甘油培养基+0.004