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组织培养

第1章实验室及基本操作

熟悉植物组织培养实验室及基本设备；熟练掌握无菌基本操作技术及培养基的配制；了解离体培养体系建立的影响因素。

第1节实验室及基本设备

一、实验室:

准备室、无菌室、培养室和温室。

1.准备室

（1）进行一些常规的实验操作;

（2）器具的清洗干燥和保存;（3）培养基的配制和灭菌;（4）蒸馏水的生产;（5）常规的生理生化分析等;（6）化学试剂和玻璃器皿的存放;

准备室常用的仪器和设备:

普通天平和分析天平;电冰箱;水浴锅;高压灭菌锅;蒸馏水制造装置;干燥箱;酸度计;微波炉和电炉等;

2.无菌操作室:

进行植物材料的消毒、接种以及培养物的继代转移操作的场所。

超净工作台的使用给接种带来了很大的方便。

超净工作台的种类：

根据风幕形成的方式可分为垂直式和水平式两种。

无菌操作室的维护：

定期消毒：

a.用甲醛和高锰酸钾产生的蒸汽熏蒸，每平方米空间大概需要2ml甲醛与过量的高锰酸钾。

b.或室内安装紫外灯，在接种前开灯20min左右进行杀菌。

注：

避免紫外灯照射

3.培养室

接种后的材料通常放在培养室中进行培养，使其生长分化.

Ø培养温度一般设在25℃

Ø光照温度一般在1000-5000勒克斯，常用3000-4000勒克斯

Ø光照长度一般在10-16小时

Ø相对湿度保持在70-80%为宜。

4.温室

在温室栽培材料，供植物组织培养取材之用，为组织培养提供健康的植物材料，从而使初代污染得到有效的控制。

温室也为试管苗的生产化提供良好的炼苗场所和生产基地。

二、基本设备

1.玻璃器皿

培养器皿：

包括试管、三角瓶、培养皿、果酱瓶等。

分注器：

分注器有注射器式分注器、漏斗式分注器和量筒式分注器等类型。

其它的玻璃器皿：

烧杯、量筒、移液管、移液枪、容量瓶、试剂瓶等。

2.器械类

镊子类：

以枪式镊子在接种、转移时使用比较方便。

解剖刀、剪刀类、接种针

细菌过滤器：

漏斗型、注射型两种

3.仪器设备

超净工作台：

水平和垂直工作台两种。

高压灭菌锅：

有大型、中型和小型三种。

高压灭菌锅使用时注意以下几点：

a.添加足够的水量;b.锅内气压不超过1.5个大气压;c.灭菌后，在气压表归零之前不要打开锅盖。

d.橡胶等有机物品会因高温高压而变性。

e.高压灭菌锅内有一个自动排气的小孔，不要使其堵塞。

烘箱：

玻璃器皿洗净后，有必要时，可使用烘箱干热灭菌（150℃,1-3h）。

而只进行洗净后烘干，可设置在80℃左右。

培养用仪器设备：

空调机、加湿器和去湿机，定时器、培养架，摇床和旋转床，恒温恒湿光照培养箱、生化培养箱。

药品贮存和配置仪器设备：

冰箱、天平、酸度计。

培养架：

用木材或三角铁制成，每层可用铁丝网或玻璃板分隔，在培养架上放置培养瓶。

用铁丝网分隔时，光照效果虽然不如玻璃板，但热量扩散效果好。

而用玻璃板作为隔板时，光照效果好，但有时会造成局部温度过高的现象。

培养架的长度根据所采用的日光灯长度来确定，高度以4-5层为宜，每层高40厘米左右，宽度约40厘米。

观察分析仪器设备：

实体显微镜、普通光学显微镜、倒置显微镜、普通荧光显微镜。

照相设备：

包括相机、近摄镜等。

组织切片设备：

包括切片机、染色缸、烘片器等.

其它仪器设备：

离心机、蒸馏水制水装置、水浴锅、药品柜和晾干架等。

第2节基本操作

一、洗涤

重铬酸钾洗净法：

一般的玻璃器皿在用重铬酸钾洗液浸泡之前，应先用水洗净。

晾干后再放入重铬酸钾洗液中，浸泡一夜。

第二天取出用自来水冲洗后，再用蒸馏水冲洗。

洗涤剂洗净法：

重铬酸钾洗液会造成环境污染，而用普通无磷中性洗涤剂是一种理想的选择。

超声波洗净法：

对于比较顽固的污垢也十分有效。

玻璃器皿的清洗：

新购置的玻璃器皿：

先用1%稀HCl浸泡一夜，然后用肥皂水洗净，清水冲洗，最后再用蒸馏水冲淋1遍，烘干备用。

已经用过的培养器皿:

先将用过的培养基除去，然后用洗涤剂溶液浸泡，再用刷子刷洗，自来水冲洗，最后用蒸馏水冲洗后烘干备用。

杂菌污染的玻璃器皿：

不开盖即把它们放入121℃高压蒸汽锅中灭菌后，再清洗。

切忌被杂菌污染的玻璃器皿直接用水清洗，否则会造成培养环境的污染。

洗净的玻璃器皿应透明发亮、内外壁水膜均匀，不挂水珠。

二、灭菌

1.器具的灭菌

干热灭菌法：

在150℃恒温干燥箱内保温2小时，取出冷却后便可以使用。

高压蒸汽灭菌法：

一般在121℃下保持15-20min，就可以达到灭菌效果。

2.培养基的灭菌

高压灭菌法：

放在高压灭菌锅内灭菌，一般在121℃下保持15-20min。

过滤除菌法：

当培养基中含有高温下易分解或变性的物质时，如生长调节物质、酶等，可以采用过滤方法进行除菌。

部分除菌法：

先将高温下易破坏的有机成分配成水溶液，进行过滤除菌后，放在超净工作台内。

培养基中的其它成分按正常方法配制并进行高压灭菌，将二者在超净工作台内配合、定容后分装。

过滤灭菌Ⅰ:

1.过滤器先灭菌，灭菌温度不超过121℃。

2.溶液先进行初滤（滤膜Ø0.65um）

3.接种材料的灭菌

灭菌步骤：

①流水冲洗或洗衣粉漂洗;②用化学灭菌剂浸润灭菌，最好加吐温-80等表面活性剂（灭菌液的0.5%），一般70%酒精30S，0.1-1%升汞5-8min。

③无菌水冲洗3-10次。

注：

灭菌液要浸没材料

常用灭菌剂的使用浓度与效果比较

灭菌剂使用浓度持续时间去除难易效果

次氯酸钙9-10%5-30min易很好

次氯酸钠2%5-30min易很好

氯化汞0.1-1%5-8min较难最好

抗菌素4-50mg/L30-60min中较好

三、无菌操作

1.在实验之前30min将超净工作台的紫外灯打开，进行杀菌。

做实验时将紫外灯关闭。

2.用酒精喷壶或酒精棉，将超净工作台消毒。

实验操作前，手和小臂也要用70%的酒精消毒。

实验器具用酒精喷壶消毒之后，放在超净工作台面上待用。

3.点燃超净工作台上的酒精灯，在植入或移植材料的前后，培养瓶的瓶口需在酒精灯火焰上烧烤杀菌。

4.使用的镊子、解剖刀等，用90%的酒精浸泡，之后放在酒精灯上火烧灭菌，放在灭菌支架上冷却后使用。

5.在进行材料的切割与移植时，所有的操作应该始终保持无菌状态。

第3节培养基

培养基的种类、成分等直接影响培养材料的生长发育，应根据培养材料的种类和部位，选取适宜的培养基。

不同的培养基特点不尽相同，了解和分析它们的特点，既便于人们选择合适的培养基，又可以在组织培养中开发新的培养基。

一、培养基的成分:

1、水2、无机营养物（无机盐）3、有机营养成分4、植物生长调节物质5、琼脂6、PH7、抗褐变物质

1、水分

常用蒸馏水来配制培养基，而最为理想的水应该可能是纯水。

纯水的制造：

首先要经过蒸馏装置除去大部分金属离子成分，然后再经过离子交换树脂除去那些与水分一起蒸馏的杂质。

在生产上，有时为了降低成本，也可以用高质量的自来水来代替蒸馏水。

由于自来水中除了含有大量的Ca、Mg、Cl和其它金属离子外，还会含有有机物质。

因此最好将自来水煮沸，经过冷却沉淀后再使用。

2.无机营养物（无机盐16种必需元素）

大量元素：

包括有C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S。

它们是植物细胞中构成核酸、蛋白质、酶系统、叶绿体以及生物膜所必不可少的元素。

氮元素可以有两种形态：

即硝态氮和铵态氮。

硝态氮通常以硝酸钾（KNO3）、硝酸铵（NH4NO3）的形式添加。

微量元素：

包括有Fe，B，Mn，Cu，Zn，Mo，Cl。

需要量很少，一般大多为10-5—10-7mol/L,稍多则产生毒害，Fe对叶绿素的合成以及延长生长起重要作用，通常以硫酸亚铁和EDTA螯合物的形式出现在培养基中。

3.有机营养成分

（1）碳源和能源

糖类：

蔗糖、葡萄糖、果糖和麦芽糖等。

蔗糖用得最多，效果也最好。

糖的添加浓度：

以添加浓度30g/L较多。

不同糖类对生长的影响不同。

从各种糖对水稻根培养的影响来看，以葡萄糖效果最好，果糖和蔗糖相当，麦芽糖差一些。

不同植物不同组织的糖类需要量也不同，实验时要根据配方规定按量称取，不能任意取量。

（2）维生素类:

盐酸硫胺素（Vit.B1）盐酸吡哆醇（Vit.B6）烟酸（Vit.B3或Vit.pp）

叶酸（Vit.B11）钴胺素（Vit.B12）生物素（Vit.H）抗坏血酸（Vit.C）

注：

一般使用浓度为0.1-1.0mg/L

VB1对愈伤组织的产生和生活力有重要作用，VB6能促进根的生长，Vpp与植物代谢和胚的发育有一定关系。

Vc有防止组织变褐的作用。

（3）肌醇

使用浓度一般为50-lOOmg／L，适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。

对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用。

（4）氨基酸及有机添加物

氨基酸及其酰胺类物质：

培养基中最常用的氨基酸是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。

水解乳蛋白（CH）和水解酪蛋白（LH）：

它们是牛乳用酶法等加工的水解产物，是含有约20种氨基酸的混合物，用量在100-200mg／L之间。

由于它们营养丰富，极易引起污染。

如在培养中无特别需要，以不用为宜。

天然有机物：

椰子乳、番茄汁、酵母提取物（0.5%）

4.植物生长调节物质：

（1）生长素类

（2）细胞分裂素类（3）赤霉素（GA）（4）脱落酸（ABA）（5）乙烯

（1）生长素类

在培养基中添加生长素的作用：

主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化,另外还有促进细胞分裂、伸长生长的作用。

在促进生长方面，根对生长素最敏感。

在极低的浓度下，就可促进生长，其次是茎和芽。

天然的生长素热稳定性差，高温高压或受光条件易被破坏。

萘乙酸（NAA）；2,4—二氯苯氧乙酸（2,4—D）；吲哚乙酸（IAA）；吲哚丁酸（IBA）

强弱顺序为：

2,4—D＞NAA＞IBA＞IAA；浓度范围大都在10-5-10-7mol/L

（2）细胞分裂素类

在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：

诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长；促进细胞分裂与扩大；抑制根的分化。

因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养时使用较少或用量较低。

6—苄基腺嘌呤（6—BA）；激动素（Kt）；玉米素（Zt）；2-异戊烯腺嘌呤（2-ip）；噻重氮苯基脲（TDZ）；

强弱顺序为TDZ＞Zt＞2-ip＞6-BA＞Kt；适用浓度范围在10-5-10-7mol/L

（3）赤霉素和脱落酸

在组织培养中添加赤霉素的作用：

培养基中添加的是GA3，主要用于促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株。

赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响，当生长素／赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化；此外，赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。

因此一般在器官形成后，添加赤霉素可促进器官或胚状体的生长。

如在菠菜的组织培养时，GA3对器官的形成表现了良好的促进作用。

在组织培养中添加脱落酸的作用：

ABA有抑制植物生长，促进休眠的作用。

在资源保存和超低温冻结保存时，可以用ABA来促进植物组织培养休止生长和抗寒性形成，以使冻结保存获得成功。

5.琼脂

最常用的凝固剂是琼脂，一般情况下，纯净度高，含杂质少的琼脂，用量一般在6-10g/L.若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。

若浓度过低，凝固性不好。

琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。

琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40℃即凝固为固体状凝胶。

通常所说的“煮化”培养基，就是使琼脂溶解于90℃以上的热水。

根据培养基培养方式不同分类：

固体培养；液体培养（静止培养，旋转培养，纸桥培养，振荡培养）

影响培养基凝固力的因素：

（1）新买来的琼脂最好先试一下它的凝固力。

原料、厂家的加工方式与琼脂凝固能力有关。

一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。

（2）琼脂的凝固能力与高压灭菌时的温度、时间有关。

加热时间过长，温度过高，会使培养基凝固能力下降。

（3）琼脂的凝固能力与pH值有关。

过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。

培养基PH偏低时，琼脂用量要增加。

（4）时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。

6.PH值

培养基在灭菌前，PH值一般被调节到5.0-6.0之间，最常见的为5.7-5.8。

在调整PH时，通常用1mol/L或0.1mol/L的NaOH和HCl来进行。

当PH过高时，培养基会变硬；当PH过低时，会影响培养基的凝固。

7.其它添加物

有时为了减少外植体的褐变，需要向培养基中加入一些防止褐变的物质，如活性炭、维生素等。

在培养灭菌比较困难的植物材料时，也可以添加一些抗生素物质，以此来抑制杂菌生长。

二、培养基的选择

1.培养基的4个基本类型

（1）含盐量较高培养基

其代表是MS（Murashige和Skoog,1962）培养基.其主要特点是无机盐浓度高，特别是钾离子和铵离子含量丰富。

元素平衡较好，缓冲性能好，微量元素和有机成分含量齐全且较丰富，是目前使用较广的培养基。

广泛地用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。

有些培养基是由它演变而来的。

（2）硝酸钾含量较高的培养基

硝酸钾含量较高的培养基有B5培养基、N6培养基，SH培养基。

B5培养基是1968年由Galmborg等为培养大豆根细胞而设计的。

其主要特点是含有较低的铵，这可能对不少培养物的生长有抑制作用。

从实践得知有些植物在B5培养基上生长更适宜，如双子叶植物特别是木本植物。

N6培养基是1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养而设计的。

其特点是成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。

在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。

（3）低无机盐培养基

其代表是怀特培养基（White，1943）。

其特点是是1943年由White为培养番茄根尖而设计的。

1963年又作了改良，称作White改良培养基，提高了MgSO4的浓度和增加了硼素。

其特点是无机盐数量较低，适于生根培养。

（4）中等无机盐含量的培养基：

有Nitsch（1969）培养基等。

三、培养基配制

1、母液的配制

为什么要配制母液？

　1）方便2）准确（有些成分量太小）　3）母液要分类配，否则有些成分混合一起会产生沉淀

2.母液的配制方法

母液的配制一般采用混配法。

即混配法：

将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数称量，分别溶解后每一类混合在一起定容到一定体积配成混合母液。

（1）大量元素母液：

以原用量的10倍配制（10～50倍），用0.01托盘天平按配方次序称取，分别溶解，混合定容1000ml。

（2）微量元素母液：

一般配制100倍，定容1000ml，称量时最好用万分之一的分析天平。

（3）铁盐母液：

亦配制100倍，硫酸亚铁和乙二胺四乙酸钠（Na2-EDTA）一般比原用药量扩大100倍，分别溶解后，混合后再螯合30分钟，最后定容1000ml。

具体方法如下：

在装有400ml蒸馏水的烧杯中加入2粒苛性钠，溶解后加入3.73gEDTA-Na2，加热使其全部溶解，然后边搅拌边慢慢加入2.78gFeSO4.7H2O直至全部溶解，冷却后定容至500ml，置于冰箱中备用。

铁盐母液必须储存于棕色玻璃瓶中。

（4）有机营养母液：

与配制铁盐相同，比原用量扩大100倍，定容1000ml。

（5）生长调节物质母液：

配制要求更为严格。

各种激素分别配制其母液，一般浓度0.5～1mg/ml，1次配成50或100ml，贮存于冰箱中备用。

通常母液的浓度是培养基浓度的10倍、100倍或更高。

生长素类配制方法：

IAA、2.4-D、NAA、IBA为有机的酸，制备时用碱液溶解。

可用少量0.5mol/L的NaOH或95%酒精溶解后再定容。

例如：

IAA、IBA、GA、ZT先溶95%酒精再定容；

NAA先溶于热水或95%酒精再加水；

2，4—D可用1mol／L的NaOH或KOH助溶，加入温水定容。

IAA的溶解方法：

一般称25mgIAA，加0.1mol/LNaOH2～3ml，溶解后，加水定容25ml，即为IAA1mg/ml，也可用无水乙醇溶解后定容。

细胞分裂素类配制方法：

一般先用少量1的HCl加热溶解后，再加入温水冷却后定容。

例如：

KT、BA先溶于1mol/LHCl溶解后加水定容

配制母液的注意事项：

①配制倍数不宜过高，这样一方面可避免一时用不完造成的浪费，另一方面也可避免倍数过高，吸取量相对少而影响准确性。

②无机盐类母液配制好后应放在2～4℃冰箱内保存。

维生素等有机营养元素的母液要在冷冻箱内保存，在使用前取出，在温水中溶解后取用。

③母液贮备时间不宜过长，尽量作到有计划配制，预期用完为宜。

过长时宜出现沉淀和微生物污染。

母液配制流程图：

确定培养基--------称量---------溶解-------定容----------母液分装--------贴标签------保存于冰箱

3.培养基配制的具体步骤：

1）取出母液并按顺序放好，并将有机营养物质融化待用。

将洁净的各种玻璃器皿如量筒、烧杯、移液管、移液枪和玻璃棒等放在指定位置。

2）取一支烧杯，放入1/3左右（配制培养基总量的1/3）纯水，将母液按顺序加入，并不断搅拌。

3）加入植物生长调节剂和蔗糖（25-30g/L），待糖溶解后定容。

4）加入琼脂7-10g/L，并加热使其完全溶解。

5）调整PH值。

用预先配制好的1mol／L的NaOH和HCl进行调整。

PH值在5·6－5·8范围内适合大多数植物细胞的分裂、生长和转化。

6）将培养基分装到培养器皿中，封好瓶口。

100ml的三角瓶约装入30－40ml,35瓶/L。

7）用高压锅灭菌（121℃,20min）或过滤除菌。

8）灭菌后，待高压锅温度下降到60℃以下时，便可以取出，放冷凝固后待用。

移母液

大量元素母液---------取100ml---------容量瓶　

微量元素母液---------取10ml----------容量瓶　

铁盐母液-------------取10ml----------容量瓶

有机物母液------------取10ml----------容量瓶　

要求：

一次性移取，不能吸进吸气球里，数量看准，不滴不漏，吹净为度。

注：

MS培养基配制

定容：

用蒸馏水定容至1升

分装：

趁热分装，100ml的三角瓶约装入30－40ml,35瓶/L。

第4节培养条件

1.温度一般为25℃，最高不高于35℃，最低不低于15℃.

2.湿度瓶内：

培养初期接近100%，随着培养时间的推移，水分会逐渐逸失，相对湿度也会有所下降。

培养室内的相对湿度，常年保持在70-80%为宜。

3.光照光强3000-4000勒克斯光照时间：

16小时/天

4.光周期

光周期是指昼夜周期中光照期和暗期长短的交替变化.试管苗培养时要选用一定的光暗周期来进行组织培养，在一般情况下培养室的光周期被设定为16h的光照，8h的黑暗。

5.培养基的PH

不同的植物对培养基最适pH值的要求也是不同的，大多在5-6.5左右，一般培养基PH皆要求5.7-5.8，这基本能适应大多植物培养的需要。

一般来说当pH值高于6.5时，培养基全变硬；低于5时，琼脂不能很好地凝固。

因为高温灭菌会降低pH值（约0.2—0.3个pH值）因此在配制时常提高pH值0.2—0.3单位。

lml的NaOH可使pH值升高0.2单位，lml的HCl可使pH值降低0.2单位。

调节时一定要充分搅拌均匀。

6.气体氧气：

缺氧时不利于组织生长。

乙烯：

含量过高时，不利于组织生长

二氧化碳：

含量过高时，不利于组织生长

第5节植物组织培养中经常出现的问题与解决的办法

一、初代培养外植体的褐变（browning）

外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。

它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。

在褐变过程中，在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其它酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。

（一）褐变的主要原因如下：

1、植物品种：

研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的。

由于多酚氧化酶活性上的差异

2、生理状态：

由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不同。

一般来说，处于幼龄期的植物褐变程度较浅，而从已经成年的植物采收外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。

3、培养基成分：

浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加。

此外，细胞分裂素的水平过高，也会刺激某些外植体的多酚氧化酶活性，从而使褐变现象加深。

4、培养条件不当：

如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养外植体的褐变程度。

（二）褐变的防止措施:

1、选择合适的外植体：

一般来说，最好选择生长旺盛的外植体。

这样可使褐变现象明显减轻。

2.合适的培养条件：

无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。

3.添加褐变抑制剂和吸附剂

褐变抑制剂包括抗氧化剂和多酚氧化酶（PPO）抑制剂，前者包括抗坏血酸、半胱氨酸、柠檬酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等，后者包括二氧化硫、亚硫酸盐、氯化钠等。

在培养基中加入褐变抑制剂，能较为有效的避免或减轻很多外植体的褐变现象。

PVP是酚类物质的专一性吸附剂，常用作酚类物质和细胞器的保护剂，用于防止褐变。

另外，使用0.1%-0.5%的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。

4、连续转移

对于容易褐变的材料，在外植体接种后1-2天立即转移到新鲜培养基中，可减轻酚类物质对培养物的毒害，连续转移5-6次可基本解决外植体的褐变问题，褐变现象便会得到控制或大为减轻。

二、玻璃化:

在进行植物组织培养时，经常会出现“玻璃苗”，即试管苗生长异常，叶、嫩茎呈透明或半透明水浸状，植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷伸，脆弱易碎，这种现象称为“玻璃化”。

它的出现会使试管苗生长缓慢，繁殖系数有所下降。

玻璃化为试管苗的生理失调或生理病变，很难继续继代培养和扩繁。

成为茎尖脱毒、工厂化育苗和材料保存等方面的严重障碍，是组织培养的一大难题。

具体解决的办法如下：

（1）适当控制培养基中无机盐成分，适当提高蔗糖和琼脂浓度，增加培养基中溶质的水平，以降低培养基的水势。

（2）减少培养基中含氮化合物的用量。

（3）适当降低培养基中CTK和GA的含量。

考虑加入适当的脱落酸。

（4）增加自然光照，控制光照时间；增加容器通气，控制温度（降低培养温度，进行变温培养）有助于减轻试管苗玻璃化现象发生。

三、污染

1.含义：

在组培过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。

2.污染原因：

细菌、真菌为病源菌；污染途径有外植体带菌，培养基及器皿灭菌不彻底，操作人员未遵守操作规程，环境不清洁。

3.污染的预防措施:

（1）防止材料带菌：

避免阴雨天在室外采集外植体；春秋组培；材料预培养。

（2）严格外植体灭菌　　（3）接种用具灭菌彻底　　（4）严守无菌操作规程　　（5）保持培养室清洁

4.抗生物质（antibiotic）有青霉素、链