实验八蛋白质含量的测定.docx

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实验八蛋白质含量的测定

实验八、蛋白质含量的测定

教学目的要求：

基本知识点

1、掌握凯氏定氮法（Kjedahl法）测定蛋白质的原理、基本过程和操作关键。

2、熟练消化、蒸馏、称量、过滤、定容、滴定等基本操技术。

3、掌握龙科－A型K氏定氮仪的操作方法

4、掌数据处理和结果计算技术。

重点

1、熟练消化、蒸馏、称量、过滤、定容、滴定等基本操技术。

2、掌握龙科－A型K氏定氮仪的操作方法

难点

凯氏定氮法（Kjedahl法）测定蛋白质的原理、基本过程和操作关键。

课时教学方案：

复习与提问：

1、检查实验准备情况，

（1）实验内容；

（2）实验仪器与试剂有哪些？

（3）凯氏定氮法（Kjedahl法）测定蛋白质程序。

2、凯氏定氮法（Kjedahl法）测定蛋白质的原理。

3、样品消化时应注意的事项。

4、龙科－A型K氏定氮仪的工作原理与蒸馏操作方法。

实验八、蛋白质含量的测定

一、实验目的

1、掌握凯氏定氮法测定蛋白质的原理；

2、熟悉凯氏定氮法中样品的消化、蒸馏、吸收等基本操作技能；

3、熟练称量、溶液转移、滴定等基本操作技能。

二、实验原理

食品与硫酸和催化剂一起加热消化，使蛋白质分解，其中C、H形成CO2及H20逸去而氮以氨的形式与硫酸作用，形成硫酸铵留在酸液中。

将消化液碱化、蒸馏，使氨游离，随水蒸气蒸出，被硼酸吸收，用盐酸标准溶液滴定所生成的硼酸铵，根据消耗的盐酸标准溶液的量，计算出总氮量，反应式如下：

2CH3－CH－COOH+13H2SO4=（NH4）2SO4+6CO2↑+12SO2↑+16H2O↑

∣

NH2

（NH4）2SO4+2NaOH=2NH3↑+Na2SO4+2H2O

2NH3+4H3BO3=（NH4）2B4O7+5H2O

（NH4）2B4O7+HCL+5H2O=2NH4CL+4H3BO3

Kjeldah法测定蛋白质含量主要分三个步骤：

（一）消化

样品中的有机物和含N有机化合物，经浓H2SO4加热消化，H2SO4使有机物脱水，炭化为碳；碳将H2SO4还原为SO2，而本身则变为CO2；SO2使N还原为NH3，而本身则氧化为SO3，而消化过程中所生成的新生态氢，又加速了氨的形成。

在反应中生成物CO2、H2O和SO2、SO3逸去，而NH3与H2SO4结合生成（NH4）2SO4留在消化液中。

蛋白质+H2SO4——→C

C+H2SO4——→SO2+CO2↑

SO2+[N]——→NH3+SO3↑

NH3+H2SO4——→（NH4）2SO4

2CH3－CH－COOH+13H2SO4=（NH4）2SO4+6CO2↑+12SO2↑+16H2O↑

∣

NH2

（二）碱化、蒸馏

（NH4）2SO4在碱性条件下，加热蒸馏，释放出氨。

（NH4）2SO4+2NaOH=2NH3↑+Na2SO4+2H2O

（三）吸收、滴定

蒸馏过程中所放出的NH3，可用一定量的标准硼酸溶液吸收，再用标准盐酸溶液直接滴定。

2NH3+4H3BO3=（NH4）2B4O7+5H2O

（NH4）2B4O7+HCL+5H2O=2NH4CL+4H3BO3

硼酸溶液仅呈极微弱的酸性，在此反应中并不影响所加的指示剂的变色反应，但具有吸收氨的作用，所以采用之作吸收剂。

三、试剂

所有试剂，如未注明规格，均指分析纯；所有实验用水，如未注明其他要求，均指三级水。

1、硫酸（密度为1.8419g/L）2、硫酸钾3、硫酸铜（CuSO4·5H2O）

4、硼酸溶液（20g/L）

5、氢氧化钠溶液（400g/L）。

6、混合指示液：

1份甲基红乙醇溶液（1g/L）与5份溴甲酚绿乙醇溶液（1g/L）临用时混合。

变色点pH=5.4，呈灰色；酸色为红紫色，碱色为绿色。

注:

（婴幼儿配方食品和乳粉蛋白质的测定GB5410—1999）配制方法:

甲基红-溴甲酚绿混合指示剂：

用体积分数为95%的乙醇，将溴甲酚绿及甲基红分别配成1g/L的乙醇溶液，使用时按1g/L溴甲酚绿：

1g/L甲基红为5：

1的比例混合。

7、硫酸标准滴定溶液[c（1/2H2SO4）=0.0500mol/L]或盐酸标准滴定溶液[c（HCl）=0.0500mol/L]。

8、过氧化氢溶液：

体积分数为30%。

9、乙戊醇

四、仪器设备

1、100mL凯氏烧瓶

2、龙科A—凯氏定氮仪

3、扭力天平

4、分析天平

5、5mL移液管

6、温度可以控制的电炉

7、小漏斗

8、酸式微量滴定管

9、150mL锥形瓶

五、操作方法

（一）样品的制备

将样品全部移入约两倍于样品体积的洁净干燥容器中，立即盖紧容器，反复旋转振荡，使样品彻底混合均匀。

（二）消化准备

称取0.20g～2.00g固体试样或2.00g～5.00g半固体试样或吸取10.00mL～25.00mL液体试样（约相当氮30mg～40mg），用纸卷成筒状，小心无损地将试样移入100mL或500mL洗净、烘干、编号的凯氏烧瓶内，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20mL浓硫酸，加入2～3粒玻璃珠，在凯氏烧瓶的瓶口放一小漏斗。

注意：

小心转移20mL浓硫酸，防止烧伤！

【注】：

1、加入样品及试剂时，避免粘附在瓶颈上。

你准备怎么处理？

2、加入硫酸钾的作用：

提高硫酸的沸点（338℃），增进反应速度。

在消化过程中温度起着重要的作用，消化温度一般控制在360℃～410℃间，低于360℃，消化不易完全，特别是杂环氮化物，不易分解，使结果偏低，高于410℃则容易引氮的损失。

而H2SO4的沸点仅为330℃，K2SO4沸点：

400℃，10g硫酸钾将沸点提高至接近400℃，在消化过程中，随着H2SO4的不断分解，水分不断蒸发，K2SO4浓度逐渐升高，则沸点升高，加速对有机物的分解作用。

但过多的硫酸钾会造成沸点太高，生成的硫酸氢铵在513℃会分解。

3、消化中若H2SO4消耗过多,则会影响盐的浓度,一般在凯氏瓶口插一小漏斗,以减少H2SO4的损失:

K2SO4+H2SO4=2KHSO42KHSO4=K2SO4+H2O+SO3↑

4、消化中加入硫酸铜的作用：

作催化剂，加速氧化作用加速。

3C+4CuSO4+2H2SO4→2Cu2SO4+4SO2↑+3CO2↑+2H2O

Cu2SO4+2H2SO4→2CuSO4+2H2O+SO2↑

（三）消化

将准备好的凯氏烧瓶以45°斜放于温控电炉上（先垫上石棉网），开始用微火小心加热，（小心瓶内泡沫冲出而影响结果！

），待内容物全部炭化,泡沫完全停止，瓶内有白烟冒出后，升至中温，白烟散尽后升至高温，加强火力,并保持瓶内液体微沸,（为加快消化速度,可分数次加入10mL30%过氧化氢溶液，但必须将烧瓶冷却数分钟以后加入！

）,经常转动烧瓶，观察瓶内溶液颜色的变化情况，当烧瓶内容物的颜色逐渐转化成透明的淡绿色时，继续消化0.5h～1h（若凯氏烧瓶壁粘有碳化粒时，进行摇动或待瓶中内容物冷却数分钟后，用过氧化氢溶液冲下，继续消化至透明为止）。

然后取下并使之冷却。

提示：

控制加热温度是关键！

（四）定容

将消化好并冷却至室温的样品消化液加入20mL蒸馏水摇匀放冷，小心转移到100mL容量瓶中，再用蒸馏水少量多次洗涤凯氏烧瓶，并将洗液一并转入容量瓶中，直至烧瓶洗至中性，表明铵盐无损地移入容量瓶中，充分摇匀后，加水至刻度线定容，静置至室温，混匀备用。

同样条件下做一试剂空白试验。

注：

在消化完全后，消化液应呈清澈透明的兰绿色或深绿色（铁多）,故CuSO4在消化中还起指示作用。

同时应注意,凯氏瓶内液体刚清澈时并不表示所有的N均已转化为氨,因此消化液仍要加热一段时间。

（五）蒸馏

1、水蒸汽发生器的准备：

按要求安装好定N装置，保证管路密闭不漏气。

在水气发生瓶内装水至2/3处，加甲基橙指示剂3滴，及1mL～5mL硫酸，以保持水呈酸性（防止水中含有N，加硫酸使成为（NH4）2SO4形式固定下来，使蒸馏中不会被蒸发），开通电源加热至沸腾。

2、清洗凯氏定氮仪：

打开进气口，关闭废液出口，接通冷凝水，空蒸5min～10min，冲洗定N仪、样杯、碱杯和内室。

分别关闭进气口（注意不要同时关闭所有进气口！

），使废液自动倒吸于定氮仪外室，再由样杯加入少量水，冲洗再次，当废液全部吸入外室后，再放排液口，并使其敞开。

3、吸收液准备：

在250mL锥形瓶中加入10mL（20g/L）硼酸溶液和1滴～3滴混合指示剂，放置冷凝器的下端，并使冷凝管下端插入液面下。

4、蒸馏准备：

准确量取10mL消化溶液，由样杯加入定氮仪内室，并用10mL水冲洗样杯，但内室中溶液总体积不超过内室的2/3（约50mL），盖上棒状玻塞，加水至杯口1cm～2cm，以防漏气，关闭排队液口，迅速由碱杯加入10mLNaOH溶液（400g/L）（溶液应呈强碱性，注意内室颜色变化），通入蒸汽开始蒸馏。

注：

NaOH必须充分，即在反应中是过剩的，保证消化液中的硫酸铵完全转变为氨气，故，Cu2SO4还可在碱蒸馏时作为碱性反应的指示剂：

CuSO4+2NaOH（要充分）→Cu（OH）2（棕褐色）+Na2SO4

5、蒸馏：

关闭排液口，蒸汽进入反应室（内室），使NH3通过冷凝定而进入接收瓶被硼酸吸收，蒸馏5min，移开接收瓶，使冷凝管下端离开液面，让玻璃管靠在锥形瓶的瓶壁，继续蒸馏1min。

同时，用蒸馏水冲洗冷凝管下端，将洗液一并聚集于硼酸溶液中。

注：

蒸馏时要注意蒸馏情况，避免瓶中的液体发泡冲出，进入接受瓶。

火力太弱，蒸馏瓶内压力减低，则接受瓶内液体会倒流，造成实验失败。

6、收尾：

关闭进气口，停止送气，废液将自动倒吸入外室，待倒吸完全时，将样杯中的蒸馏水分数次放入，冲洗内室，待洗液全部吸入外室后，再打开排液口，放净废液。

按上述步骤，换下一试样蒸馏，同时准确吸取10mL试剂空白消化液作空白实验。

（六）滴定

取下接收瓶，用0.05MHCL标准溶液滴定至灰色或蓝紫色为终点。

【GB/T5009.5-2003】

将已吸收氨的硼酸液用已标定的0.0500mol/L的标准硫酸或盐酸溶液滴定，滴定至三角瓶中溶液由蓝绿变灰紫为终点，记下耗酸体积。

每次消化液须重复蒸馏2～3次。

如果几次滴定酸量相差较大，必须重新蒸馏。

直至滴定时耗酸量相差不超过0.05mL为止。

（教材）

【GB/T5413.1-1997】用硫酸标准溶液滴定至溶液出现酒红色为止，记录所用硫酸标准溶液的体积。

同时进行空白试验，并在结果中加以校正。

想一想：

微量滴定管如何使用？

注意观察实验中用0.05MHCL标准溶液滴定时溶液的变色变色情况。

六、数据记录与计算

（一）数据记录：

见下表

※※试样中蛋白质含量测定原始数据记录表：

样品名称

样品质量（g）

标准酸液耗量（mL）

空白实验

盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L）

（二）结果计算

式中：

X—样品中蛋白质的含量，g/100g或g/100mL；

V1—样品消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL；

V2—试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，mL；

c—硫酸或盐酸标准滴定溶液的浓度，mol/L；

0.0140—1.0mL盐酸[c（HCl）=1.000mol/L]或硫酸[c（1/2H2SO4）=1.000mol/L]或标准滴定溶液相当的氮的质量，g；

m—样品的质量或体积，g或mL；

F—氮换算为蛋白质的系数。

乳粉为6.38，纯谷物类（配方）食品为5.90，含乳婴幼儿谷物（配方）食品为6.25。

大豆及其制品为5.71。

计算结果保留三位有效数字。

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

想一想：

公式中各种数字和符号的意义！

七、注意事项（见教材P116）

八、实验结果与分析讨论

（一）检测结果及质量评价

说明检测结果，根据检测结果和产品质量标准，对试样质量作出评价。

（二）分析讨论

1、试样加入浓硫酸后，颜色有什么变化？

总结消化中颜色的变化，试分消化过程中的颜色变化的化学实质？

2、消化完全的标志是什么？

加快消化的措施有哪些？

3、消化过程中所加试剂的作用是什么？

4、蒸馏前加入氢氧化钠后定氮仪内室溶液颜色发生了什么变化？

试分析氢氧化钠在蒸馏中的作用？

5、如何确定蒸馏完全？

为什么蒸馏结束将冷凝器尖端离开接收瓶液面后，还要蒸馏1min？

6、观察滴定中溶液颜色变化，微量滴定管在使用时应注意哪些问题？

7、说明你对本实验的体会。

8、试画出定氮装置的结构示意图。

9、试分析实验中可能导致误差的因素及应对措施？

九、课后作业：

（另附作业上交）

1、凯氏定氮法测定蛋白质的依据是什么？

2、试述凯氏定氮法测定蛋白质的原理和方法摘要？

3、什么是蛋白质换算定系数？

为什么不同试样蛋白质换算定系数不同？

4、凯氏定氮法测出蛋白质是试样中准确的蛋白质含量吗？

为什么？

附:

【GB/T5009.5-2003食品中蛋白质的测定】第二法

一、原理

蛋白质是含氮的有机化合物。

食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。

然后在pH4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中，铵与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4二氢化吡啶化合物.在波长400nm处测定吸光度,与标准系列比较定量,结果乘以换算系数,即为蛋白质含量。

二、试剂

1、硫酸铜。

2、硫酸钾。

3、硫酸。

4、氢氧化钠溶液（300g/L）：

称取30g氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至100mL。

5、对硝基苯酚指示剂溶液（1g/L）：

称取0.1g对硝基苯酚指示剂溶于20mL95%乙醇中，加水稀释至100mL。

6、乙酸溶液（1mol/L）：

量取5.8mL冰乙酸，加水稀释至100mL。

7、乙酸钠溶液（1mol/L）:

称取41g无水乙酸钠或68g乙酸钠（CH3000Na·3H20），加水溶解后并稀释至500mL。

8、乙酸钠一乙酸缓冲溶液:

量取60mL乙酸钠溶液（1mol/L）与40mL乙酸溶液（1mol/L）混合，该溶液为pH4.8。

9、显示剂:

15mL37%甲醛与7.8mL乙酰丙酮混合，加水稀释至100mL，剧烈振摇，混匀（室温下放置稳定三日）。

10、氨氮标准储备溶液（l.0g/L）:

精密称取105℃干燥2h的硫酸铵0.4720g，加水溶解后移人100mL容量瓶中，并稀释至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于1.0mgNH3-N（10℃下冰箱内储存稳定1年以上）。

11、氨氮标准使用溶液（0.1g/L）:

用移液管精密吸取10mL氨氮标准储备液（1.0mg/mL）于100mL容量瓶内，加水稀释至刻度，混匀，此溶液每毫升相当于100ugNH3-N（10℃下冰箱内贮存稳定1个月）

三、仪器

1、分光光度计。

2、电热恒温水浴锅（100℃±0.5℃）。

3、10mL具塞玻璃比色管。

四、分析步骤

1、试样消解

精密称取经粉碎混匀过40目筛的固体试样0.1g～0.5g或半固体试样0.2g～1.0g或吸取液体试样1mL～5mL，移人干燥的100mL或250mL定氮瓶中，加0.1g硫酸铜、1g硫酸钾及5mL硫酸，摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。

小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5h。

取下放冷小心加20mL水，放冷后移人50mL或100mL容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并人容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。

取与处理试样相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸按同一方法做试剂空白试验。

2、试样溶液的制备

精密吸取2mL～5mL试样或试剂空白消化液于50mL～100mL容量瓶内，加1滴～2滴对硝基酚指示剂溶液（1g/L）,摇匀后滴加氢氧化钠溶液（300g/L）中和至黄色，再滴加乙酸（1mol/L）至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。

3、标准曲线的绘制

精密吸取0,0.05,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0mL氨氮标准使用溶液（相当于NH3-N0,5.0,10.0,20.0,40.0,60.0,80.0,100.0ug），分别置于10mL比色管中。

向各比色管分别加入4mL乙酸钠－乙酸缓冲溶液（pH4.8）及4mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀。

置于100℃水浴中加热15min。

取出用水冷却至室温后，移人1cm比色皿内，以零管为参比，于波长400nm处测量吸光度，根据标准各点吸光度绘制标准曲线或计算直线回归方程。

4、试样测定

精密吸取0.5mL～2.0mL（约相当于氮小于100ug）试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于10mL比色管中。

以下按3自“加4mL乙酸钠一乙酸缓酸溶液（pH4.8）及4mL显色剂……”起依法操作。

试样吸光度与标准曲线比较定量或代人标准回归方程求出含量。

五、计算结果

试样中蛋白质的含量按下式进行计算。

式中:

X—试样中蛋白质的含量，单位为克每百克或克每百毫升（g/100g或g/100mL）；

c—试样测定液中氮的含量，单位为微克（ug）；

c0—试剂空白测定液中氮的含量，单位为微克（ug）；

V1—试样消化液定容体积，单位为毫升（mL）；

V2—制备试样溶液的消化液体积，单位为毫升（mL）；

V3—试样溶液总体积，单位为毫升（mL）；

V4测定用试样溶液体积，单位为毫升（mL）；

m—试样质量或体积，单位为克或毫升（g或mL）；

F—氮换算为蛋白质的系数。

蛋白质中的氮含量一般为15%～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为5.30。

精密度：

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。