关于四种紫花苜蓿干旱胁迫和复水的研究解读.docx
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关于四种紫花苜蓿干旱胁迫和复水的研究解读
干旱和复水对四个紫花苜蓿品种的水分利用效率、蒸腾作用和净二氧化碳交换的研究
摘要：
预计世界范围内的干旱和水资源匮乏将严重影响作物的生长，植物已经形成了广泛的且多样的抗旱机制。
光合作用下降，进而年产量下降，这是对干旱的一种常见的反映，而光合作用水分利用效率和生产力水分利用效率则是产量增加的反映。
我们研究的目的是确定四个苜蓿品种在持续的干旱和复水后的生理效果，这四个苜蓿品种中的三个是适宜地中海气候的Tafilalet，TierradeCampos和Moapa，另一个是适宜海洋性气候的Europe。
通过苜蓿芽中光合作用水分利用效率或生产力水分利用效率和碳同位素分辨率关系的准确性，来确定水分胁迫的函数式。
与生产力水分利用效率有关而非光合作用水分利用效率，这可能与后期的g值下降有关。
中度干旱（14天）后，所有品种的A值和g值下降，但光合作用水分利用效率增加。
在此期间，生产力水分利用效率也有所增加。
两种水分利用效率都与
有关，这可能表明中度水分胁迫末期的g值代表生长期。
21天后，在严重干旱条件下，品种间的干物质积累差别不大，但Tafilalet的生产力水平是最高的。
复水后，叶面积增加，但总干物质没有增加，这表明叶片是复水最敏感的植物器官。
严重的水分胁迫没有降低光合作用水分利用效率或生产力水分利用效率，且复水后，
没有增加。
这种现象表明21天的干旱胁迫对苜蓿光合机构产生了显著影响。
至于轻度干旱，
与生产力水分利用效率而非光合作用水分利用效率有关，这更能说明生产力水分利用效率是一个比光合作用水分利用效率更加综合的参数。
关键词:
紫花苜蓿干旱胁迫净二氧化碳交换叶片导水度水分利用效率碳同位素分辨率
1.引言：
在北美和欧洲许多国家，紫花苜蓿是畜牧业中主要的豆科牧草，这是因为在所有的豆科牧草中它单位面积上能产出最多的植物蛋白（Huyghe,2003）。
此外，紫花苜蓿是一种适应范围非常广的植物，从赤道到北极圈附近的地区都可以生长（Michaudetal.,1988）。
然而，紫花苜蓿由于不利的生长环境很多植物产量往往会受到影响（Bajajetal.,1999）。
此外，国际气候变化小组预测世界范围的干旱和水分缺乏将会对作物产生影响。
结论得出，缺水是一个重要的非生物胁迫。
因此，可持续用水和抗旱策略的建立是非常急切的，并且应结合常规育种和生物技术的方法（Chavesetal.,2003）。
植物已形成多种形态的抗旱生理机制（Blum,1996）。
干旱将限制植物生长和减少叶面积（Aranjueloetal.,2007）。
由于植物具有干旱适应策略，减小叶面积扩展和蒸腾就可以限制水分的损失。
当植物缺水时，光合作用下降，这可能是由于单位叶面积光合作用碳合成减少或光合作用叶片气孔关闭的原因。
无论怎样，在水分缺乏的情况下，光合作用二氧化碳的减少主要还是由于气孔关闭，较高的气孔开放度增加二氧化碳的扩散，从而增加叶片的物质合成量。
在水分受限制的条件下，决定植物生产力的一个关键因素是水分利用效率，它被看做一种可以提高作物表现性能的策略。
在农艺方面，水分利用效率的定义是干物质生产与消耗水的比例，在植物生理方面，是合成碳的效率与水分蒸腾率之间的比值。
Farquhar和Richards（1984）在C3植物中通过同位素分辨率描述了水分利用效率和碳之间的关系。
这个分辨率可以分辨出较重的碳同位素
，用于计算植物吸收气体后产生相同比值的植物材料中13C/12C的比率。
一些作者已经提出了把碳同位素分辨率作为在干旱条件下显示作物产量的间接选择标准。
在小麦品种上，已经证明13C和水分利用效率有关系。
因此，植物体内被同位素标记的二氧化碳的量越小，植物的水分利用效率越大。
这一理论已经由大量的文献证实，尽管有一些人反对。
更重要的是，除了Johnson和Tieszen（1994）与Ray（2004）等对紫花苜蓿的研究结果表明，尚没有明确的数据表明水分利用效率和13C之间的关系。
有关两个以上干旱品种的比较研究是稀缺的。
此外，关于不同抗旱品种紫花苜蓿的研究比较也难以得到（Hattendorfetal.,1990;Grimesetal.,1992;Casadebaigetal.,2008;Pembletonetal.,2010），而且新品种的缺水评估是新耐旱作物育种计划的必要前提。
我们在先前的研究已经表明（Ericeetal.,2010），严重水分胁迫下没有品种间差异，但在中等干旱条件下，改变地中海品种的叶形态可以降低水分的胁迫。
在目前的研究中，我们的目的是通过比较海洋和地中海紫花苜蓿品种来更好的理解影响13C和水分利用效率的生理机制。
根据相关情况，我们假设紫花苜蓿品种来源不同显示不同的水分利用效率，干旱胁迫的程度可能会改变叶片的水分利用效率。
为了查明最准确的参数表征紫花苜蓿抗旱水平的生理性状，这次研究的第一目标是要确定持续的干旱抑制和随后灌溉的恢复对作物生产性能，叶面积，蒸腾速率，净CO2交换，叶片导水及水分利用效率的影响，以及4种不同紫花苜蓿品种对干旱的敏感度；第二个目标是对紫花苜蓿供应不同量的水分的情况下确定13C是否和水分利用效率有关。
4个紫花苜蓿品种作为此次实验的选用品种，分别是：
Tafilalet，TierradeCampos，Moapa，Europe。
Tafilalet是一种来自摩洛哥生态型；TierradeCampos是一个来自西班牙的品种，被归类为地中海式紫花苜蓿；Moapa源自美国，是来自于非洲的品种（Meltonetal.,1988）；因此，这三个品种适应地中海气候。
相比之下，Europe被列为北欧型紫花苜蓿（Crochemoreetal.,1998），此苜蓿适应海洋性气候，当暴露在干旱条件下叶形态会有一定的差异（Ericeetal.,2010）。
2.材料与方法：
2.1植物材料
四个紫花苜蓿品种种子在培养皿中培养发芽。
15天后，当前三片叶子出现后，将幼苗移植到30厘米高塑料盆（176盆与2株/盆），里面装有按1:
1混合的珍珠岩和蛭石的混合物，留有保证幼苗根正常生长的足够空间。
每个苜蓿品种做4组重复，苜蓿处理按照随机的原则。
植物生长在白天20℃、晚上18℃的温室当中，每天14小时的光照。
植物每天补充的营养液包括4mMKNO3,0.4mMKH2PO4,1mMK2SO4,3mMCaCl2,0.5mMMgSO4,0.15mMK2HPO4,0.2mMFe–NaEDTA,14uMH3BO3,5uMMnSO4,3uMZnSO4，0.7uMCuSO4，0.7uM（NH4）6Mo7O2和0.1uMCoCl2（Kimetal.,1991）。
经过一个月的不受限制生长后，对其进行干旱处理（7天，14天，21天），然后在经历一个7天的复水期。
2.2控制和干旱处理
最大的土壤含水量，对照最佳的灌溉处理量，大约是每立方厘米土壤灌溉0.4㎝3水，做好每天的灌溉和养护。
干旱处理（图1）吸收水分7天（轻微处理）、14天（中度处理）、21天（高度处理），然后给予7天的复水期。
经过7天、14天、21天的处理期，盆中植物覆盖率要分别达到0.33，0.27和0.24。
为了避免在控制和植物干旱处理期间的养分差异，在干旱处理之前添加10克Osmocote缓释肥（10N:
11P:
18K）。
在营养水平上，Osmocote缓释肥的养分足以应付在控制和干旱处理期间植物安全生长。
2.3组织取样
将植物收获并分离叶、茎和根，植物总干物质是在80℃下进行48小时干燥后得到的。
枯萎但没有脱离的叶片中包括在干物质计算中。
2.4叶面积和具体蒸腾
总叶面积测量用li-3100自动叶面积仪，蒸腾速率是指一天内通过每盆植物叶片总叶面积的水分总和。
2.5净二氧化碳交换和气孔导水度的测定
测量使用带光源的Li-Cor6400光合系统。
在20℃且完全展开的嫩叶上进行净二氧化碳交换和气孔导度的测定。
2.6水分利用效率
为了比较在叶和整株植物的水分利用效率水平,两组参数进行了分析：
生产力的水分利用效率和光合作用的水分利用效率。
用干物质的生产力和消耗水的比率分析生产力的水分利用效率；净二氧化碳交换和蒸腾作用的气体交换之间的关系分析光合作用的水分利用效率。
生产力的水分利用效率是每周经过干旱和复水处理后测量，而光合作用的水分利用效率是经过7天、14天、21天干旱胁迫和经理复水期后测量。
2.7碳同位素分辨率
用粉碎机（MM400,Retsch,Leeds,UK）粉碎经过冷冻干燥的叶片，并用质谱仪进行分析。
样品中的碳同位素含量计算公式：
其中Rsample和Rstandard分别是植物组织和标准样的13C/12C比值，通常被普遍使用的是PeeDeeBelemnite（PDB）石灰石。
根据Farquhar和Richards碳同位素分辨率（13C）计算公式为：
（其中
是空气中的
，
是样品叶中的
）
由于碳同位素分辨率水平、水分利用效率、控制条件和干旱植物之间是相关的，因此生产力水分利用效率被认为是从胁迫处理的开始一直到结束的这段时间。
2.8数据分析
使用SPSS12.0软件进行数据分析。
数据通过单向方差分析来确定各处理之间的显着差异。
用LSD-测试确定各个处理之间是否存在显著地差异。
当P<0.05时结果被认为是显著地，相关测定使用Spearman的简单相关性测试。
3.结果
3.1干旱和复水的短期影响
经过7天的处理，总干物质间没有什么差异（图2A），与对照组相比，轻度干旱的干物质没有减少，但经过复水后，所有的品种表现出较高的生产力（图2A）。
对照组的叶面积，与轻度干旱组之间没有发现明显的差异（图3A）。
但经过复水期之后，Moapa表现出较比TierradeCampos和Tafilalet高的叶面积值，Europe也表现出比Tafilalet较高的叶面积值（图3A）。
在控制条件下，Europe表现出最高的特定的蒸腾效率，但经过7天的干旱，Europe显示的值最低（图3B）。
恢复期后，尽管轻度干旱处理后TierradeCampos和Moapa的具体蒸腾降低，但两者之间没什么差异（图3B）。
与对照组相比，Europe和Moapa经过轻度干旱和7天恢复期后具体蒸腾有所下降（图3B）。
虽然对照组的净CO2交换（A）没有什么明显差异，但经过轻度干旱后Europe是呈现下降的唯一品种（图3C）。
恢复期之后，TA表现出最高值，所有品种达到控制值（图3C）。
在控制条件下，轻度干旱后，TierradeCampos是唯一比Tafilalet的叶导水度高，但在复水期后有少许的减少（图3D）。
在轻度干旱和经过复水期后，Europe的导水度比其他品种都低，且是最低的品种。
在控制条件下，四个品种之间光合作用的水分利用效率没有什么差别（图3E）。
尽管欧盟是经过轻度干旱和复水期后光合作用水分利用效率唯一增加的品种，但其品种内没有什么差异（图3E）。
在控制条件下，生产力的水分利用效率是Moapa表现最高而Europe表现最低，但在轻度干旱后，相比对照组，四个实验组都没有什么差别（图3F）。
复水期后，对比干旱处理，Tafilalet和Moapa生产力的水分利用效率显着下降。
轻度干旱后，13C没有什么明显的变化而且品种间也没用什么变化，13C与光合作用的水分利用效率没有什么关联但与生产力的水分利用效率有关（P<0.001，图6A和B）。
（图1）
（图2）
（图3）
3.2干旱和复水的中期影响
经过14天的处理，对照组的各品种总干物质含量没有差异（图2B）。
在中度干旱条件Moapa总干物质减少，但通过观察，各品种之间无显著差异。
和干旱相比，Moapa是唯一在复水期之后总干物质含量没有增加的品种，呈现出比Tafilalet还低的生物产量（图2B）。
经过14天的对照处理，发现叶面积最高的为Tafilalet，但在中度干旱条件下，所有品种的叶面积表现出相似的情况（图4A）。
经过中度干旱后，当与对照组相比，Tafilalet和Moapa的叶面积减少。
与中度干旱相比，所有的品种的叶面积在复水期之后都有所增加，但Moapa的增加量最小（图4）。
经过14天的条件控制，Europe的具体蒸腾作用比Tafilalet高，但中度的干旱后，所有的品种的蒸腾作用都有一个相似水平的减少（图4B）。
与干旱相比，在复水期之后，所有的品种的具体蒸腾都有所增加，尽管Moapa的表现不是很明显（图4B）。
与对照组相比，恢复期蒸腾速率的影响由于品种而导致不同的结果：
TierradeCampos表现出最高的蒸腾速率且高于对照组；Tafilalet和Moapa表现出相同水平的蒸腾率；Europe的蒸腾率低于对照组（图4B）。
（图4）
经过14天的控制或者干旱条件，种内A的量没有表现出差异性，尽管由于水分胁迫所以植物A有所降低（图4C）。
复水期后，中度干旱后所有品种的A高于对照组，但与对照组相似，尤其是Tafilalet表现出比Europe和Moapa更高的价值（图4C）。
经过14天的处理，Moapa表现出最高的量，而Tafilalet也表现出比TierradeCampos更高的量（图4D）。
中度干旱后，所以品种迅速下降到同一水平。
与干旱对照相比，复水后g的量有所增加，但种间没有差异。
复水期后，对照组中只有TierradeCampos能够达到g值（图4D）。
14天后，对照组种间的生产力水分利用效率（图4F）或者光合作用水分利用效率（图4E）没有差异。
中度干旱下，所以品种的光合作用水分利用效率（图4E）都提高到最大值，尤其是Tafilalet提高的最多，它的提高量是对照组的4.5倍。
与干旱相比，复水期后种间的光合作用水分利用效率减少没有差异（图4E）。
中度干旱后，TierradeCampos和Europe的生产力水分利用效率达到与对照组Tafilalet和Moapa相似的值（图4F）。
中度干旱恢复后，所以品种的生产力水分利用效率都有迅速的减少，与对照组相比，Tafilalet、TierradeCampos和Moapa更是达到一个更低的水平（图4F）。
经过14天的条件控制，复水后种间
没有变化（表1）。
中度干旱后，种间除了Tafilalet和TierradeCampos的
减少（表1），其它没有变化。
复水后，所有植物
达到控制值，但Europe的
是唯一在复水后没有显著增加的品种。
经过14天的处理，
明显与生产力水分利用效率和光合作用水分利用效率有关（图6C和D）。
3.3干旱和复水的长期影响
经过21天控制条件的处理，TierradeCampos是干物质含量最高的品种（图2C）。
严重的干旱使所有植物的这个参数降低到同一水平，复水后，与干旱条件下相比，四个研究品种的总干物质没有增加（图2C）。
经过21天的处理后，TierradeCampos的叶面积比Europe高，严重的干旱使叶面积迅速降低，种间的变化没有显著差异（图5A）。
复水期后，相比于干旱条件所有品种的叶面积增加但没有达到控制值
（图5A）。
在干旱或者对照组中种间的光合效率没有差异，相比于对照组植物，所有进行21天干旱的品种都表现出较低的蒸腾效率（图5B）。
复水期后，TierradeCampos表现出最高的蒸腾率，Tafilalet的蒸腾率也有增加，并且增大的值比Europe和Moapa大（图5B）。
（图5）
严重的干旱使所有的品种的A值下降（图5C）。
复水后，与干旱条件相比，所有品种的A值有所增加，Tafilalet的增值最大，但TierradeCampos和Europe没有达到控制条件下的A值水平（图5C）。
经过21天的灌溉，Tafilalet显示最低的g值，严重的干旱使所有的品种迅速降低，但种间没有什么差异（图5D）。
复水期后，与干旱条件相比，所有品种的g值都有增加，但TierradeCampos、Europe和Moapa没有达到控制水平，但Tafilalet显示比它对应的对照组g值高（图5D）。
经过21天的处理，不论什么品种，水的胁迫或者复水后植物的光合作用水分利用效率都没有改变（图5E）。
尽管生产力水分利用效率没有因为严重干旱改变，但在控制或干旱条件下生产力水分利用效率最高的品种是Tafilalet（图5F）。
与干旱条件相比，除Moapa外，复水后所以的品种的生产力水分利用效率都减少（图5F）。
经过21天的处理，对照组植物品种的叶
没有什么变化。
严重干旱使叶片的
降低，但复水后研究的品种中却没有显著增加（表1）。
21天后，叶片的
与光合作用水分利用效率没有显著相关，但与生产力水分利用效率密切相关（图6E和F）。
（图6）
4.讨论
对比所选择的苜蓿品种起源的差异性，摩洛哥（Tafilalet）、西班牙（TierradeCampos）、美国（Moapa）和法国（Europe），，这可能是不同水分胁迫条件下引起不同反应的原因，而对于其他作物，这又是否可以提供用于证明水分利用效率和
变化有关的数据（Halletal.,1992;Ismailetal.,1994）。
4.1轻度干旱的结论
经过7天的水分处理，总干物质（图2A）或叶面积产量（图3A）没有受到轻度干旱影响。
由于植物干物质产量没有受到干旱的影响，经过7天的复水，所有品种的生物量增加。
尽管所有品种叶片导水度降低（g，图3D），但只有Europe的净CO2交换（A）（图3C）下降最显著，g值最低。
经过7天的干旱，Europe被证实是唯一蒸腾效率下降的品种（图3B）。
对于水分限制，气孔响应是有差异的，干旱的持续时间和强度可能会引起水分利用效率的差异（WUE;Sarangaetal.,1999）。
一些研究已经证明，旱能大幅提高水分利用效率，而其他的则没有表明这样效果（Halletal.,1994）。
水分利用效率的计算公式为A/g的比值，称为光合作用的水分利用效率（WUEph;Howell,2001）。
这个公式也可用于某一时间段干物质生产和蒸发水的计算，即生产力水分利用效率。
由于较低的导水度，Europe（图3E）是唯一在干旱后光合作用水分利用效率增加的品种，尽管它的A值下降。
由于植物水分受到限制，气孔关闭引起的蒸腾下降比A值下降还明显（Stanhill,1986;JohnsonandAsay,1993）。
与此相反，经过7天的轻度干旱，生产力水分利用效率却没有明显变化。
生产力水分利用效率与光合作用水分利用效率之间的不同是因为光合作用水分利用效率的测定是在干旱期的末期，而生产力水分利用效率是进行一周的测定，因此呈现的是一个总和的参数（Aranjueloetal.,2006）。
轻度干旱没有改变
的分辨率（表1）。
在很多牧草中
已经被证明与水分利用效率有关，包括苜蓿（JohnsonandTieszen,1994）。
7天后光合作用水分利用效率的相关值非常明显，可能是因为在轻度干旱下，
与蒸腾或导水度关系不明显。
经过7天的干旱，
与光合作用水分利用效率并没有显著的相关性，可能是因为所以的品种在前7天干旱末期不能代表一整周，所以导致g值较低。
尽管如此，生产力水分利用效率在干旱期间是一个更全面的参数也加强了生产力水分利用效率与
有关这个观点（图6）。
4.2中度干旱的结论
经过14天中度干旱后，只有Moapa的总干物质减少，但种间没有什么差异（图2B）。
Moapa的干物质减少同样可以通过叶面积减少反映出来（图4A）。
在干旱条件Tafilalet的叶面积也相应减少，这是对水分胁迫一种常见的反映，因为这可以更好的控制蒸腾失水（Arandaetal.,2005）。
然而，中度干旱后品种间干物质或叶面积没有表现出明显差异，复水后这两个参数明显增加，但是Moapa除外（图2B和4A）。
轻度干旱后观察，经过14天的水胁迫处理，植物净CO2交换（A，图4C）减少，所以品种的叶片导水度、蒸腾效率都同样减少（图4B）。
很少有研究关于两个以上品种的抗旱比较（Casadebaigetal.,2008）。
以前的研究证实，有一个关于马铃薯叶面积扩展（Jefferies,1993）和玉米（RayandSinclair,1997）气孔关闭在应对干旱时显著地效果。
以前的研究结果表明，改变地中海品种的叶面积比（LAR）和叶面积率（SLA），这取决于水的供应，而Europe改变了叶重比（LWR）（Ericeetal.,2010）。
在我们的实验中，与地中海品种相比，在轻度干旱后，经常只有Europe的g值和蒸腾对干旱表现出不同的反应。
当中度干旱胁迫延长，品种间叶片导水度和蒸腾未表现出什么差异。
在中度干旱后有一个复水期的情况下，种间发生变化，例如，TierradeCampos呈现出最高的蒸腾率（图4B），Tafilalet表现出最高的A值（图4C），Moapa表现出最大的g值（图4D）。
经过14天的水胁迫，所以品种的A值和g值下降，这导致他们的光合作用水分利用效率增加，尤其是Tafilalet。
与此相反，中度干旱后，只有TierradeCampos和Europe生产力水分利用效率明显增加（图4F）。
复水后，由于水的供给量增加所以品种的生产力水分利用效率下降。
在此期间，Tafilalet和TierradeCampos由于干旱
减少（表1）。
持续的干旱使生产力水分利用效率大幅提高（Li,1999;Sarangaetal.,1999），尽管这种效果不能一直检测到（Ehdaie,1995;Walleyetal.,1999）。
与生产力水分利用效率和光合作用水分利用效率密切相关。
这种相关性或许可以表明，这一时期末期的g值可以反映植物的整个生长期（Zhaoetal.（2004））支持这种相关性。
4.2严重干旱的结论
经过21天的浇水，产出总干物质最多的是TierradeCampos，但严重缺水使所有品种产量下降到一个相似的水平（图2C）。
叶面积也得到相似的结果（图5A）。
尽管叶面积在复水后有所增加，但这并没有反映出总干物质增加（图2C）。
一些研究表明，叶子比根对干旱更敏感（Yinetal.,2004;Ericeetal.,2006），这是一种对叶面水平减少水分的消耗和增加根部吸水的的一种适应（Wuetal.,2008）。
在我们的研究中已经证明，叶子是吸水最敏感的植物器官。
先前的研究已经表明，水分胁迫可以增加根冠比，以减少水的消耗提高对水吸收（Ericeetal.,2010）。
虽然所有品种显示叶重比（LWR）下降，TA的叶面积率（SLA）同样下降，这可能意味着干旱会更严重（Ericeetal.,2010）。
严重干旱使气体交换的参数（A和g）同样会下降，但品种间无显著差异（图5C和5D）。
复水后，地中海型苜蓿Tafilalet中的A和g值最高，然而北欧型苜蓿Europe的A和g值并没有恢复（图5C）。
TierradeCampos是另一个没有恢复A和g值的品种，但中度干旱后有所恢复，这使得蒸腾效率在严重干旱后有所恢复（图5B）。
中度干旱后，严重水分胁迫没有使生产力水分利用效率和光合作用水分利用效率增加，这与记录结果相反（图5E和F）。
A与g按比例减少。
Zhaoetal（2004年）观察到中度水分胁迫可以增加水分利用效率，严重的水分胁迫可能会降低光合酶的活动，导致水分利用效率减少。
TierradeCampos的干
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