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血脑屏障破坏与阿尔茨海默病的机制研究全文

血脑屏障破坏与阿尔茨海默病的机制研究（全文）

摘要

阿尔茨海默病（AD）是以β-淀粉样蛋白的异常沉积、神经原纤维缠结和神经元不可逆死亡为病理特征的多因素和异质性神经退行性疾病。

AD的病因及发病机制至今仍不清楚。

近年来的研究发现血脑屏障损害与AD发病密切相关，血脑屏障完整性的破坏被认为是AD的早期生物标志物。

AD病理与血脑屏障损伤相互作用，形成恶性循环，促进AD进展，而AD的主要风险基因载脂蛋白E也参与血脑屏障完整性的调控。

通过脑脊液和动态对比增强磁共振成像的在体评估可发现血脑屏障完整性的改变。

文中简述了近年来AD中血脑屏障破坏的机制研究和检测方法的进展，并探讨未来的研究方向。

阿尔茨海默病（Alzheimer′sdisease，AD）是最常见的痴呆，除了认知功能和日常生活能力的逐渐丧失外，还伴发精神行为异常和人格的改变［1,2］。

虽然历经了上百年的研究，但其确切致病机制仍不明确。

目前较为公认的“β-淀粉样蛋白（amyloid-β，Aβ）级联假说”认为Aβ为导致AD复杂病理事件的始动因素，可比临床症状提前10~20年出现，是AD发生发展的核心［3,4］。

然而，20多年来以Aβ为靶点的药物研发却多以失败告终，更为重要的是，目前发现神经元损伤可先于Aβ沉积出现，种种迹象表明“Aβ级联假说”并不能真正反映AD的发生发展规律［4,5,6］。

近年来的研究发现AD中血脑屏障完整性的破坏可比认知损害症状提前数年出现，且早期的血脑屏障损伤独立于Aβ和tau蛋白病理，其中海马中的脑毛细血管损伤和血脑屏障破坏被认为是认知功能障碍的早期生物标志物［7,8,9］。

因此，关注AD中血脑屏障的破坏对于超早期发现潜在的AD人群及对AD致病机制的深入研究均有重大意义。

一、血脑屏障研究的历史进程

1885年Ehrlich发现注射到动物体内的某些水溶性染料会使周围组织染色，但不会使大脑染色，当时Ehrlich认为这是由于染料对中枢神经系统（centralnervoussystem，CNS）组织的亲和力低所致。

1909年Goldmann发现从外周注射染料不会与CNS结合，但采取蛛网膜下腔注射时CNS出现明显的染色。

1921年Stern和Gautier首次使用了“血脑屏障”（barrièrehémato-encéphalique）一词表明其在维持脑稳态中的生理功能，此后展开了近百年的关于血脑屏障本质的争议［10,11］。

随着研究技术的改进，1967年Reese和Karnovsky使用电子显微镜发现脑内皮结构的2个特殊特征：

存在紧密连接（tightjunctions）和缺少内皮囊泡［12］。

在20世纪70、80年代，对各物种进行的多项研究表明，脑脊液和血浆之间存在明显的离子梯度［11］。

近年来对血脑屏障的研究已经涵盖了基因组学、蛋白质组学、多模态影像学等多个领域，并已发现血脑屏障改变与众多神经退行性疾病的内在关联，如AD［13,14］、肌萎缩侧索硬化［15］、癫痫［16］、亨廷顿病和帕金森病等［17］。

二、血脑屏障的构成及生理特性

血脑屏障主要由脑微血管内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞等细胞成分组成，受神经血管单元的调节和维持，限制血液和脑组织之间物质的自由交换。

血脑屏障独特的滤过功能主要与脑内皮细胞的2个关键特性有关，即存在于内皮细胞间的紧密连接复合物和高度限制的跨细胞转运［18,19］。

紧密连接复合物为血脑屏障特有的分子结构，由闭锁蛋白（claudins）、咬合蛋白（occludins）、胞质附着蛋白-1（ZO-1）、ZO-2、ZO-3和黏附分子（junctionaladhesionmolecules）等共同构成［20］。

内皮细胞的紧密连接会减少细胞旁扩散并限制跨细胞活性，严格控制血脑屏障的非特异性流入或流出。

其次，细胞间黏附连接以动态打开和关闭的方式调节血脑屏障的通透性［21］。

此外，血管内皮-钙黏连蛋白可以控制血脑屏障的内皮通透性和白细胞外渗，对血脑屏障功能的维持至关重要［22］。

血脑屏障的另一个特征是内皮细胞具有多种严格的跨细胞运输途径，包括溶质载体、肽和蛋白质受体和离子转运蛋白介导的跨细胞转运，但显著缺乏能直接穿透的窗孔结构和吞饮小泡［23］。

CNS内皮细胞的囊泡密度远低于外周，基线条件下，大鼠肺和肠毛细血管内皮细胞囊泡数量约为30~40个/μm2，肌肉中的细胞质囊泡数量约为70~90个/μm2，而脑毛细血管（直径<6μm）的囊泡密度低至1~10个/μm2，从而限制了CNS囊泡介导的跨细胞运动［24,25］。

血脑屏障可通过受体介导的胞吞作用控制蛋白质等大分子的出入，包括胰岛素受体、转铁蛋白受体和低密度脂蛋白受体等［26］。

多种严格限制的特异性跨细胞运输对于有效清除大脑内毒素及保证能量和营养物质的输入具有非常重要的作用。

此外，血脑屏障内皮细胞因缺乏白细胞黏附分子如E-选择蛋白和内皮细胞间黏附分子1等的表达，导致外周免疫细胞入脑受限，从而可以限制抗原引起的适应性免疫反应的发展，避免大脑免疫损伤［24］。

三、血脑屏障与AD病理之间的关联

AD患者的尸检研究发现血脑屏障的破坏与AD病理标志物和认知功能损害密切相关［27,28,29,30］。

已有研究者利用过表达淀粉样前体蛋白的转基因鼠证实，血脑屏障完整性破坏早于神经元变性和AD病理标志物出现［31,32］。

生理情况下，完整的血脑屏障功能可以促进Aβ的清除，并阻止外周Aβ向脑内的转移，避免Aβ的毒性聚集。

但当血脑屏障的渗透性升高时则会造成Aβ的清除减少、Aβ积累和神经原纤维缠结的增加。

更为重要的是，增加的Aβ神经毒性又进一步破坏血脑屏障的结构基础、分子调控以及免疫应答等，形成恶性循环，加剧血脑屏障损害［33］。

1.血脑屏障分子结构的破坏：

血脑屏障分子结构的损伤与AD之间的关联是最早涉及的研究，Aβ可通过抑制紧密连接蛋白表达（claudins1/5/12、occludins、ZO-1、ZO-2、ZO-3）和诱导破坏性基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs；如MMP2和MMP9）的激活，损伤血脑屏障结构的完整性［34］。

此外，tau蛋白积聚可独立导致血脑屏障受损，而无需Aβ参与［35］。

随着研究的深入，周细胞在调控血脑屏障的完整性并参与AD发生机制中的作用受到越来越多的重视。

尸检显示，与对照组相比轻度认知功能障碍和AD患者海马中的周细胞大量减少，紧密连接遭到破坏，血脑屏障通透性增加［30］。

敲除周细胞标志物——可溶性血小板源性生长因子受体-β（solubleplatelet-derivedgrowthfactorreceptor-β，sPDGFR-β）的动物模型显示，周细胞呈年龄依赖性的丢失，血脑屏障完整性显著破坏，神经血管偶联和毛细血管的密度减少，局部脑血流量降低，并显著促进AD源性的病理沉积和神经元丢失［31，36］。

由此可见，血脑屏障分子结构和AD病理之间存在明显的相互作用，并互相促进，形成恶性循环。

2.血脑屏障跨细胞转运的破坏：

血脑屏障的跨细胞转运长期以来并未受到重视，先前的研究认为这种跨细胞的途径并不重要［37］。

然而其后的研究证实在紧密连接等分子结构未受损情况下，血脑屏障渗透性依然可以出现明显升高。

Ben-Zvi等［38］发现敲除主要促进因子超级家族2α（majorfacilitatorsuperfamilydomaincontaining2α）的小鼠与野生小鼠相比，血脑屏障紧密连接结构无改变，而内皮细胞的胞吞小泡明显增加，血脑屏障渗透性显著增加。

生理情况下，脑内的Aβ主要依靠血脑屏障上的三磷酸腺苷结合盒转运体、磷酸-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、葡萄糖转运蛋白1和低密度脂蛋白受体相关蛋白1（lowdensitylipoproteinreceptor-relatedprotein1，LRP1）等透过血脑屏障从脑内向血液转运清除［39］。

研究发现Aβ寡聚物可直接诱导内皮细胞糖基化终末产物与其受体的表达（促进外周Aβ入脑），从而抑制P-gp、LRP1的活性和葡萄糖转运蛋白1的表达（抑制脑Aβ外流），共同破坏血脑屏障跨细胞转运功能，加速脑内Aβ的异常沉积［39,40］。

另一个不能忽视的事实是，目前已有多项研究证实，Aβ可引起星形胶质细胞去极化，促进细胞因子和趋化因子如白细胞介素1（interleukin-1，IL-1）、IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白1、巨噬细胞炎性蛋白1β等的释放，也可以直接激活内皮细胞，诱导内皮细胞间黏附分子1、血管细胞黏附分子1和内皮选择素的表达，共同促进血脑屏障白细胞的黏附、转运和神经炎症的发生，损伤神经元［41,42,43,44］。

四、血脑屏障与载脂蛋白E（apolipoproteinE，ApoE）之间的关联

研究者很早就发现ApoE的缺乏可导致血脑屏障渗漏增加［45］，而ApoE基因不同亚型对血脑屏障完整性的调节呈现明显的差异［46］。

动物模型显示，ApoE4转基因小鼠模型显示出血脑屏障易损性的增加［47］，而携带ApoE2和ApoE3基因的小鼠血脑屏障完整性则不受影响［46］。

与ApoE3基因携带者相比，AD患者中ApoE4基因携带者周细胞变性和血脑屏障破坏显著增加，且携带ApoE4基因的人群具有更为明显的Aβ1-42的下降［48,49］。

最近的一项人群研究发现，在认知正常的老年人中，ApoE4基因携带者表现出明显的血脑屏障渗漏，而ApoE3基因携带者直至轻度认知功能障碍阶段才出现血脑屏障的轻微渗漏［9］。

ApoE4基因通过激活周细胞和内皮细胞中LRP1相关的促炎性亲环素A-MMP9通路，导致血脑屏障紧密连接蛋白降解，血脑屏障渗透增加［9］。

此外，目前还假设ApoE4通过改变血脑屏障跨细胞转运机制来影响Aβ的外排：

（1）ApoE4竞争性抑制Aβ外排转运体（如LRP1）与Aβ的结合，使血脑屏障受体介导的Aβ清除减少［50］；

（2）ApoE4与Aβ结合后形成的复合物难以透过血脑屏障，可加速脑内Aβ的沉积［51］。

但此假设存在较多争议［52,53,54］，因为LRP1等不仅在血脑屏障内皮细胞中表达，在神经元中也大量表达。

最近的研究发现在携带ApoE3/3基因型的AD小鼠模型中，不溶性Aβ水平与神经元LRP1表达之间呈负相关，但在ApoE3/4和ApoE4/4基因背景下，不溶性Aβ水平与LRP1表达之间存在正相关，ApoE4通过与神经元LRP1相互作用促进了Aβ沉积，但当神经元LRP1缺失时，ApoE4的这种改变被逆转［55］。

这些研究结果表明，携带ApoE基因亚型的不同，Aβ转运受体表达区域的不同，对Aβ的清除会造成不同甚至完全相反的结局，但ApoE4基因无论在血脑屏障内皮细胞还是在神经元上对Aβ的清除均表现出负向的作用。

五、血脑屏障破坏的检测

1.生化检测：

生化检测的证据来源多以尸检和动物模型为主，但尸检难以排除因死后缺乏循环和内环境失衡而导致血脑屏障损伤和生化指标变化的可能，并且尸检难以获得AD早期血脑屏障受损的证据。

同样，因为AD为多因素异质性疾病，动物模型的结果难以体现人类病理生理的改变［56］。

目前较为常用的评价血脑屏障破坏的指标是白蛋白指数（albuminratio，AR），即脑脊液与血清中白蛋白浓度的比值，并已有众多的研究证实轻度认知功能障碍及AD患者脑脊液AR升高［39，57,58］。

最近一项纳入1015名被试的大型队列研究发现，与对照组相比，痴呆患者AR显著升高且与淀粉样蛋白病理无关［59］。

但是将AR作为AD血脑屏障渗漏指标仍存在缺陷。

首先，AR无法定位血脑屏障渗漏的具体部位［56］。

其次，大型荟萃分析结果提示AR与年龄和血管性痴呆的血脑屏障渗透增加明显相关，但与AD的血脑屏障渗透性改变相关性较低，因此，AR更多反映的是血管病理的相关改变，而不是AD病理改变［60］。

更为重要的是，AR不一定反映的是血脑屏障损害，如白蛋白可通过蛛网膜下腔血管或脊髓漏出导致AR增加，但血脑屏障并未受损［56］。

因此，寻获更加具有代表性的AD相关的血脑屏障损伤标志物，并纳入大型队列研究是当前和未来研究的重点。

值得一提的是，随着周细胞对于维持血脑屏障功能完整性的重要作用逐渐被证实［30,31，36］，周细胞标志物sPDGFR-β水平有潜力成为检测血脑屏障通透性的关键生化指标。

脑脊液sPDGFR-β水平不仅与脑脊液AR和血脑屏障通透性显著相关［8，32，61］，而且认知损害越重，sPDGFR-β水平越高，表明脑脊液中sPDGFR-β不仅可以反映血脑屏障的完整性，且与AD严重程度相关［8］。

这提示脑脊液中sPDGFR-β可以作为血脑屏障破坏的潜在生物标志物，但仍需要更多的研究去证实。

2.神经影像学检测：

随着神经影像技术飞速发展，基于顺磁性钆基造影剂的动态对比增强磁共振成像（dynamiccontrast-enhancedmagneticresonanceimaging，DCE-MRI）技术已被广泛应用于在体血脑屏障完整性的检测。

最近利用改良的DCE-MRI技术已经初步证实正常老龄时的海马及CA1、齿状回等亚区血脑屏障通透性随着年龄增加而增加，在轻度认知障碍阶段，血脑屏障的完整性被进一步破坏，其通透性增加与AR和脑脊液sPDGFR-β水平显著相关，并早于脑脊液中Aβ和tau蛋白的异常［8，62,63］。

改良后的DCE-MRI不仅具有较高的空间分辨率、较好的对比噪声比和选择特定感兴趣区分析等优点，还可以联合多模态影像评估脑组织的灌注状态、神经血管的功能偶联等［64］，为实现在体评估血脑屏障通透性并分析其在AD病理进程中的作用和机制提供有力的技术手段。

此外，另一个值得关注的是通过正电子发射断层摄影术检测血脑屏障完整性。

虽然早期利用乙二胺四乙酸作为示踪迹的研究并未发现血脑屏障通透性在AD组和健康对照组之间的异常［65］，但其后使用针对P-gp功能的（R）-［11C］维拉帕米和定量PET成像检测发现，相比健康对照，AD患者血脑屏障的P-gp功能显著下降［66,67］。

虽然目前P-gp的生理功能尚未被完全阐释，但基于血脑屏障转运功能改变的PET成像为探索AD病理生理改变开辟了新的思路和方向［66］。

六、总结与展望

越来越多的证据指出血脑屏障破坏在AD发病及进展中的重要性。

血脑屏障的破坏可提前并独立于Aβ或tau蛋白病理的改变［8］。

迟发性AD的主要风险基因ApoE4破坏血脑屏障完整性，通过生化和影像学检测可以发现临床前AD及AD的血脑屏障改变，为进一步探究AD的致病机制提供了新的方法和思路。

目前已有学者建议将扩散张量成像、DCE-MRI、动脉自旋标记和动态磁敏感增强灌注成像等成像生物标志物与sPDGFR-β等分子生物标志物结合，以综合评估血脑屏障的变化［13，68］。

未来可以采取针对Aβ转运体的造影剂成像研究，如P-gp、LRP1等，精确评估AD谱系人群血脑屏障功能变化。

也可以采取遗传影像策略，整合风险基因和血脑屏障完整性评估，构建基于AD个体化早期诊断标记，为早期识别AD高危人群及其向痴呆转化的时机提供新的切入点，同时为开发新的干预靶点提供重要依据。