细菌对抗菌药物敏感试验.docx
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细菌对抗菌药物敏感试验
怀化医专《微生物学检验》教案编号：
10
2009年下期
授课教师
李争鸣
教研室主任审核签名
李争鸣
教学课题
细菌对抗菌药物敏感试验
课时
授课时间
10月8日
月日
月日
月日
月日
月日
2
星期一
星期
星期
星期
星期
星期
授课对象
检验专业
班级
1～6
目的要求
1、掌握药敏试验（扩散法和稀释法的原理、操作、结果判断及报告）。
2、了解结核杆菌，厌氧性细菌和真菌的药敏试验。
3、熟悉联合药敏试验。
4、了解实验室生物安全防护有关知识。
教学重点及难点
重点：
需氧菌及兼性厌氧菌的药物敏感试验（扩散法和稀释法的原理、操作、结果判断及正确发报告）。
难点：
扩散法结果的解读。
教法与
学法
讲解，启发式教学
课型
理论课
教学手段
多媒体
教学
内容
与
时间
分配
1、临床常用的抗菌药物（15min）
2、需氧菌及兼性厌氧菌的药物敏感试验
（1）扩散法（30min）
（2）稀释法（30min）
（3）联合药敏试验（10min）
3、实验室生物安全防护知识简介（10min）
小结（5min）
复习
思考题
什么是敏感、耐药、中度敏感？
参考资料
1、叶应妩主编全国临床检验操作规程东南大学出版社第3版2006.11
2、张卓然主编《临床微生物学与微生物检验》人卫出版社第3版2006.11
3、倪语星主编《临床微生物学与检验》人卫出版社第4版，2007年
自评
本次课做到重点讲解清楚，难点分析透彻，并适当增加了抗菌药物种类等新内容，原理部分讲授详细，而方法部分需在实验课再介绍。
细菌对抗菌药物敏感试验
药敏试验（antimicrobialsusceptibility,AST）
（一）概念：
在体外检测药物抑制或杀死细菌能力的试验。
（二）检测意义：
1、疾病的治疗：
指导用药。
2、耐药菌检测和流行病学调查。
3、评价新药抗菌作用。
4、某些菌种的鉴定。
第一节临床常用的抗菌药物
抗菌药物：
是指具有杀菌或抑菌活性的抗生素和化学合成药物。
一、青霉素类抗生素：
青霉素种类抗菌活性
1、天然青霉素不产青霉素酶的G+G-球菌、普雷沃菌等。
青霉素G、青霉素V
2、耐青霉素酶青霉素产青霉素酶的G+G-球菌
甲氧西林、奈夫西林、苯唑西林等
3、广谱青霉素青霉素G敏感细菌、大部分大肠埃希菌、
氨苄西林、阿莫西林奇异变形杆菌、流感嗜血杆菌等G-菌
替卡西林、羧苄西林、氨苄西林无效的G-菌，产β-内酰胺酶
美洛西林、派拉西林克雷伯菌、铜绿假单胞菌、肠杆菌、厌氧菌
二、头孢菌素类抗生素：
1、第一代头孢菌素
（头孢噻啶、头孢噻吩、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢羟氨苄等）
作用：
对G+菌作用强，如金葡菌、链球菌等。
2、第二代头孢菌素
（头孢羟唑、头孢呋辛、头孢克洛、头孢尼西、头孢雷特等）
作用：
产青β-内酰胺酶G-菌有作用，如肠杆菌科细菌，铜绿假单胞菌等。
3、第三代头孢菌素
注射用头孢噻肟、头孢曲松、头孢他啶、头孢派酮：
对产青β-内酰胺酶G-菌有很大抗菌活性。
口服用头孢克肟、头孢布坦等：
对肠球菌、铜绿假单胞菌及不动杆菌无用。
4、第四代头孢菌素（头孢匹罗、头孢匹美）
作用：
对肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌作用强。
三、其它β-内酰胺类抗生素：
1、单环β-内酰胺类抗生素（氨曲南、卡芦莫南）
对G-菌作用强
2、头霉素类：
对G+菌、厌氧菌作用较好
氧头孢烯类抗生素：
抗菌谱广，对产β-内酰胺酶G-菌作用强，对产酶的金葡菌有效
3、碳青酶烯类抗生素（亚胺培南、米洛培南等）
广谱（最广），抗菌活力强
4、β-内酰胺酶抑制剂（克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦）
与β-内酰胺类抗生素联用能增强后者的抗菌活性。
四、氨基糖苷类抗生素：
链霉素、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素、奈替米星、阿米卡星等
作用：
对需氧G-杆菌有强大抗菌活性
对沙雷菌属、气单胞菌属、产碱杆菌、不动杆菌属、分枝杆菌属也有一定抗菌活性。
但对G-球菌效果差。
五、喹诺酮类抗生素：
第一代：
（新恶酸等）窄谱抗生素（G-）
第二代：
（环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等）对G+G-菌均有作用。
第三代：
（斯帕沙星、妥舒沙星、左氟沙星等）超广谱抗生素。
六、大环内酯类抗生素：
红霉素、麦迪霉素、乙酰螺旋霉素等
作用：
和青霉素相似，主要是G+菌、厌氧菌。
新一代：
克拉霉素、罗红霉素、地红霉素、氟红霉素、阿齐霉素等。
七、四环素、氯霉素、林可酰胺类抗生素：
八、糖肽类抗生素
九、磺胺类药物及其增效剂
药敏试验常规抗菌药物选择：
根据NCCLS（Nationalcommitteeforclinicallaboratorystandars）非苛氧菌和苛氧菌有各自常规药敏试验标准。
在标准中分成ABCU四组——
A组：
常规首选药，作为一级试验并常规报告的抗生素。
B组：
临床使用主要抗生素，在某些情况下使用。
为一级试验，有选择报告的抗生素。
C组：
补充试验，有选择报告的抗生素。
用于对A组药物耐药的菌株或过敏的病人。
U组：
仅用于泌尿道的补充试验的抗生素。
第二节需氧菌和兼性厌氧菌药物敏感试验
一、纸片琼脂扩散法（K-B法）
纸片扩散法是一种操作简单，易于掌握的半定量的药物抑菌测定法。
为使结果更可靠，1971年世界卫生组织推荐了Kirby-Bauer（K-B）法作为标准化的药敏方法。
该法要求所需试剂、药物纸片、培养基、菌液浓度以及操作方法都必须标准化，主要适宜于需氧菌和兼性厌氧菌的药敏测定，是目前临床工作中最常用的药敏试验方法。
（一）原理
将含有抗菌药物的纸片贴在已接种待测菌的琼脂平板上，纸片中的药物吸收琼脂中水分后向纸片周围扩散，形成递减的梯度浓度，纸片周围的待测菌生长如果被该药物所抑制，就会形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映了待测菌对该测定药物的敏感程度，并与该药对待测菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关关系。
MIC（最低抑菌浓度）：
抑制待测菌生长所需要的最小浓度。
（二）材料
培养基，抗菌药物纸片，菌液等。
（三）实验步骤
（四）影响因素
（五）结果判断和报告
测量抑菌圈直径，作出判断。
敏感（sensitivity）：
待测菌株在体内可被常规剂量的测定药物抑制或杀灭。
中度敏感（morderatesensitivity）：
指通过提高药物浓度或在该药生理性浓集部位，细菌生长可被抑制。
中介度（intermediate）：
为“缓冲域”，以防止由技术因素失误导致的结果偏差。
不能作为临床报告。
耐药（resistant）：
待测菌株不能被常规剂量的抗生素所抑制。
（六）质量控制
1、质控菌株：
金黄色葡萄球菌ATCC25923，大肠埃希菌ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853，粪肠球菌ATCC29212或33186。
2、抑菌圈质控范围：
各种抗菌药物对以上4种质控菌株的抑菌圈允许范围为95％可信限。
（即：
实验室日间质控得到的抑菌圈直径在连续20个数值中仅允许1个超出范围）
见P134表15－1
二、稀释法
为定量法，体外检测某抗菌药物抑制待测菌生长的最低浓度（minimalinhibitoryconcentration，MIC）值。
根据稀释培养基不同，分为：
肉汤稀释法和琼脂稀释法。
（一）肉汤稀释法
1、原理：
用M-H液体培养基将抗菌药物作不同浓度稀释，然后接种待测菌，定量测定抗菌药物抑制或杀死该菌的最低抑菌浓度（MIC）或最低杀菌浓度（MBC）
2、材料：
抗菌药物原液，M-H液体培养基，菌液等
3、步骤：
稀释药物→加菌液，混匀→培养，检测结果
注：
每种药物稀释的浓度范围见P137页表15－4
4、结果判断：
以肉眼观察无菌生长的最低药物浓度为该待测菌的最低抑菌浓度（MIC）。
再以0.01ml容量接种环从肉眼观察无菌生长的试管中取一环接种于血琼脂平板作次代培养，经35℃培养过夜后观察最低药物浓度能杀死99.9％原始种入的细菌即为最低杀菌浓度（MBC）。
（二）琼脂稀释法
1、原理：
将待测菌接种于含有不同浓度药物的琼脂平板上，经培养后观察菌落的生长情况，以能抑制细菌生长的最低药物浓度为该菌的最低抑菌浓度（MIC）。
2、结果判断：
以无菌落生长的最低药物浓度为该药对待测菌的MIC。
3、质量控制：
标准菌株同前。
方法评价：
本法的优点是可同时进行多株细菌的MIC测定，结果较液体稀释法可靠，且易于发现污染或耐药交叉菌株，为开发新药的体外药敏试验常用的参照标准；缺点是制备药物琼脂平板时费时费力。
三、联合药敏试验
在制药工业中，为了得到抗菌增效的配方，常进行两种或两种以上抗菌药物复方制剂的筛选。
中成药也有配方中含多种抗菌药物的情况。
更重要的是在临床上，对于尚未确定由何种病菌引起的急、重症感染以及由多种细菌混合感染的治疗，常采取联合用药，以此获得较理想的疗效。
1、联合药敏试验的意义：
（1）治疗混合性感染或未确定病原菌的急、重症感染（如败血症）；
（2）预防或推迟细菌耐药的发生；
（3）联合用药可以减少剂量避免达到毒性剂量；
（4）联合用药比单一用药效果更好。
2、联合药敏试验的结果与类型
（1）协同作用：
两种药物联合作用显著大于其单独作用的总和。
（2）相加作用：
两种药物联合作用时的活性等于两种单独抗菌活性之和。
（3）无关作用：
两种药物联合作用时的活性等于活性最大的抗菌药物的药效。
（4）拮抗作用：
两种药物联合作用显著低于单独抗菌活性。
3、联合药敏试验的方法
（1）扩散法：
（定性）
如：
单药纸片搭桥法，纸条扩散法。
（2）稀释法：
（定量）
棋盘法——是目前常用的定量联合抗菌试验法，由两种抗菌药物的不同稀释度加以组合，每一种药物浓度都有单独的和另一种药物不同浓度的联合，能精确测定出两种抗菌药物在适当浓度的比例下所产生的相互作用，因其排列呈棋盘状而得名。
由于使用的培养基不同，又分液体棋盘稀释法和琼脂盘稀释法。
四、E试验
是一种结合稀释法和扩散法原理对微生物药敏试验直接定量的技术。
原理：
E试条是一条5×50mm的无孔试剂载体，一面固定有一系列预先准备的、浓度呈连续指数增长稀释抗生素，另一面有读数和判别的刻度。
抗生素的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围，其斜率和浓度范围对判别有临床意义的MIC范围和分界点值具有较好的关联。
将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘与试条交点的刻度浓度即为抗生素抑制细菌的特定浓度，又称抑制浓度（IC），它与MIC呈高度相关。
第三节细菌耐药性检查方法
一、细菌耐药性表型检测
（一）琼脂筛选试验：
以单一药物单一浓度检测细菌的耐药性，常用于对耐甲氧西林葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌、耐庆大霉素或链霉素的肠球菌。
（二）折点敏感试验：
仅用特定抗生素浓度（敏感、中介、耐药折点MIC）测定细菌对药物的敏感性。
（三）双相纸片试验：
是非NCCLS规定ESBL检测方法。
方法：
挑取在血平板上生长的细菌菌落，稀释成0.5麦氏比浊管浓度，均匀涂布于M-H平板，中央贴上阿莫西林/克拉维酸纸片，在距该纸片25mm处（中心－中心）分别贴上头孢曲松、头孢他啶、头孢噻污、氨曲南等纸片作为指示剂，35℃孵育16～18h，若指示剂在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大的现象（协同现象），则说明待测菌产生超广谱β－内酰胺酶（ESBL）。
（四）自动化仪器
二、β－内酰胺酶检测
1、头孢硝噻吩滤纸片法
用接种环挑取待测菌菌落于商品化头孢硝噻吩滤纸片上，于10min内由黄色变为红色即（＋）。
2、碘淀粉测定法
待测菌落＋青霉素溶液→室温振摇30min＋淀粉＋碘液→溶液变蓝→继续振摇，10min内变为无色为（＋）。
三、其它：
耐药基因检测，特殊耐药菌检测
第四节体外抗菌试验的影响因素
体外抗菌试验受培养基、试验细菌、药物本身以及其它因素的影响。
试验时，只有严格控制试验条件，才能保证实验结果的准确性，重复性及科学性。
一、培养基的成份
尽量使用成份较简单的培养基，培养基中应避免含有药物的干扰物质和拮抗物质，如钙、镁离子可以降低氨基糖苷类药物的抗菌活性；胸腺嘧啶核苷和对氨基苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性，目前大多使用M-H培养基。
二、培养基的PH
培养基的PH值应在7.2-7.4之间，太酸或太碱不仅会直接影响细菌的生长，更重要的是还影响药物的抗菌活性。
培养基的PH值可以改变药物的离子化程度而影响药物渗入细胞内。
一般情况下，非离子化的物质比离子化的物质更易进入细菌壁和细菌膜。
三、试验菌的菌种及菌量
试验菌种必须是标准菌株，如金黄色萄葡球菌ATCC25923，大肠埃希菌ATCC25922，铜绿假单胞菌ATCC27853及粪肠球菌ATCC29212等。
如需要应用临床分离的菌株时，也必须经过严格纯化，鉴定及合理保藏的菌株。
接种的菌量要恒定，菌液须经标准比浊管比浊，其细菌含量应在103～106个细胞/ml范围内，否则，细菌太多，因其菌体表面吸附的药物多，而进入细胞内的药物分子则相应减少，抑菌效果就差。
此外，细菌接种量越大，产生耐药性突变的细菌就越多，从而影响MIC值。
四、药物的物理状态，浓度及PH药物的物理状态
浓度及稀释方法等可直接影响抗菌试验的效果，必须精确配制。
固体药物必须制成溶液，难溶于水的药物要用有机溶剂或酸、碱溶解后再使用。
药物的PH应尽量接近中性，以确保药物的稳定性，而不影响细菌的生长。
中药制剂因有颜色，在观察实验结果时要特别注意。
五、培养时间
短时间接触到抗菌药物的细菌，仅是受到抑制而并非被杀死。
若培养的时间过长，耐药突变株出现的机会则大大增加，耐药菌株大量繁殖，从而导致药物MIC的改变。
补充内容：
生物安全防护知识简介
医学检验工作人员长期接触有潜在传染性的血液、粪便、体液等标本，这些标本往往是各种细菌、病毒等病原微生物的传播载体，无论是实验人员感染，还是造成实验室和周围环境的污染，都将导致严重的后果。
因此实验室工作人员在实验过程中必须高度重视实验室生物安全防护，强化生物安全意识，熟悉生物安全防护有关知识，严格无菌操作。
1．微生物的分类等级
根据世界卫生组织（WHO）出版的《实验室生物安全手册》，将微生物分为四个不同危险度等级：
危险度1级是指不能引起人或动物致病的微生物，此类微生物无或仅具有极低的个体和群体危险；危险度2级的病原体具有中度个体危险，低度群体危险，能引起人或动物致病，但对实验室工作人员、社区、家畜或环境不易导致严重危害，所引起的感染具有有效的预防和治疗措施，并且疾病传播的危险有限；危险度3级的病原体具有高度个体危险，低度群体危险，通常能引起人或动物的严重疾病，但一般不会发生感染的播散，并且对感染具有有效的预防和治疗措施；危险度4级的病原体具有高度的个体危险和群体危险，通常能引起人或生物的严重疾病，并且很容易发生个体之间的直接或间接传播，对感染一般没有有效的预防和治疗措施。
基于以上划分标准，结合微生物的致病性、传播方式、目前所具有的预防和治疗措施等因素，我国卫生部于2006年制定了《人间传染的病原微生物名录》，对各种病原微生物的危害程度及其相关实验活动需要达到的生物安全实验室级别做了详细分类，各实验室进行有关实验均需参照此标准。
2．生物安全实验室分级与要求
由于各种病原微生物的危险度等级不同，因此实验室必须达到相应的生物防护等级才能开展有关实验。
根据WHO《实验室生物安全手册》和我国卫生部2002年颁布的《微生物和生物医学实验室生物安全通用准则》，实验室从生物安全防护的角度共分为四级：
一级生物安全防护实验室（BSL-1）为实验室结构设施、安全操作规程、安全设备适用于危险度1级的微生物，依据标准操作程序可进行开放性操作，如用于教学的普通微生物实验室即属此类。
二级生物安全防护实验室（BSL-2）适用于对人或环境具有中等潜在危害的微生物，即危险度2级的病原体，该级别实验室应具备生物安全柜和密封的离心管，以免发生泄漏和产生气溶胶。
三级生物安全防护实验室（BSL-3）适用于有明显危害、可以通过空气传播的病原微生物（如结核杆菌、伯氏立克次体等），通常已有预防传染的疫苗，该级别实验室除了有严格的一级和二级安全设施要求外，还需具备合适的空气净化系统。
四级生物安全防护实验室（BSL-4）适用于对人体具有高度的危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不明，目前尚无有效的疫苗或治疗方法的致病微生物及其毒素。
BSL-4实验室必须与其他实验室隔离，并具备特殊的空气和废物处理系统，实验操作须在Ⅲ级生物安全柜内或全身穿戴特制的正压防护服。
根据以上定义，医院内的临床实验室因接触可能含有致病微生物的标本，通常应达到二级生物安全防护实验室要求。
根据《实验室生物安全认可准则》，二级生物安全实验室结构设施需符合以下几点：
（1）实验室需具有防止节肢动物和啮齿动物进入的设计，有可开启的窗户，有纱窗，实验室门有可视窗带锁并能自动关闭。
（2）每个实验室均应设置洗手池，宜设置在靠近出口处。
（3）实验室工作区域外有足够的存储空间及摆放个人衣物的设施。
（4）实验室内墙壁、地面应平整、防滑、易于清洁，不适宜用地毯。
（5）实验台面应能防水、耐腐蚀、耐热。
（6）实验室内应保证工作照明，避免反光和强光。
（7）在实验室内应穿戴隔离衣、帽、手套，必要时戴防护眼镜。
实验室应备有生物安全柜。
（8）有适当的消毒设施，如高压蒸汽灭菌器，并设置洗眼装置、应急喷淋装置、急救药箱、灭火器等。
（9）有可靠的电力供应和应急照明。
（10）在实验室出口处设有在黑暗中可明确辨认方向、通道的标识。
（11）在实验室入口处和装有传染性物质的设备表面贴有生物危险标志。
3．实验室生物安全管理制度
实验室生物安全制度建设对于临床实验室而言是生物安全防护的核心，实验室生物安全管理制度应包括：
实验室准入制度、生物安全培训制度、生物安全责任制和责任追究制度、生物防护与安全制度、安全检查制度、个人防护制度、实验室管理制度、清洁消毒制度、安全计划审核制度、废弃物处理制度、事故报告制度、生物安全防护应急预案、标准操作程序等。
建立健全了各项生物安全制度，还应成立生物安全管理领导小组，加强生物安全制度实施情况的监督管理，实验室入口处须粘贴生物安全标志，注明危险因素，生物安全级别，负责人姓名和电话，进入实验室的特殊要求及离开程序，禁止非工作人员进入实验室，如需参观实验室等特殊行为需经实验室负责人的批准后方可进入。
4．实验室常见生物危险
实验室生物污染的途径包括：
空气传播（临床标本中的污染源在空气中传播、微生物气溶胶的吸入）、直接传播（工作中偶然刺伤、割伤，碎玻璃划伤直接感染）、皮肤粘膜接触（临床标本中的传染源通过破损皮肤粘膜接触造成的感染）、其他不明原因的实验室相关感染。
实验室伤害以及与工作有关的感染主要是由于人为失误﹑不良实验技术以及仪器使用不当造成的。
因此，实验室人员必须提高生物安全意识，认真学习生物安全相关的各种法规和文件，定期进行生物安全防护知识培训，熟悉生物防护有关知识，加强基本技能的培养，严格执行操作规程。
实验室管理者应对实验室的风险级别进行分析，尤其对风险级别较高的、接触高危标本几率较大的区域如微生物和分子生物学室予以高度重视，保护实验室工作人员和环境的安全。
5．生物废弃材料的管理
实验室内所有用过的样本、培养物及其他生物性材料等废弃物，严禁未经处理就随意丢弃，应置于贴有生物危害标志的专用废弃物处理容器内，注意容器的充满量不能超过其设计容量，利器（如针头、小刀、玻璃等）应置于耐扎锐器盒内，在去污染或最终处置前应存放在指定的安全地方，经过高压灭菌或其他无害化处理后再安全运出实验室；有害气体、气溶胶、污水、废液等均需经无害化处理后排放；动物尸体、组织的处置和焚化应符合国家相关要求。
处理危险废弃物的人员需经过专业培训，并使用适当的防护设备。
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