烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法.docx
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烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法
《烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法》
标准项目技术报告
《烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法》项目组
2019年5月
1概述
水溶性糖，可降低烟气的刺激性，产生令人满意的吃味[1]，水溶性糖含量高的烟叶柔软、富有弹性，色泽鲜明。
水溶性总糖和还原糖含量被公认为是体现烟草品质的指标，是烟草化学分析的重要项目之一[2,3]。
在烟草行业中，糖类物质分析方法主要有费林试剂法[4]、近红外光谱法[5]、气相色谱法（GC）[6,7]、高效液相色谱‒示差折光检测法（HPLC-RID）[8-10]和连续流动法[11‒18]等。
其中，连续流动法[11‒13]是最常用的水溶性糖检测方法。
国内普遍采用的YC/T159—2002《烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法》[11]是以烟草科学研究合作中心（CORESTA）的38号推荐方法（ISO15154:
2003）[13]为基础建立的，而且该方法是基于AA3型连续流动分析仪进行烟草中水溶性总糖和还原糖含量测定的。
YC/T159-2002方法可测定水溶性总糖和还原糖，当测定总糖时，95℃加热槽和85℃加热槽均使用；当测定还原糖时，95℃加热槽不加热，只使用85℃加热槽。
由于烟草为植物样本，其萃取液中含有金属离子，而渗析器中的渗析膜是一个双向渗透膜，因此渗析器下层流路中的氢氧化钠溶液会渗析到渗析器上层，使渗析器上层流路中液体为碱性，所以当进行样品测试时，随着样品量的增加，易在渗析膜上产生沉淀，影响渗析效果，峰高会逐步降低，当进样次数达到20杯以后，会出现渗析膜被沉淀完全覆盖，样品无法渗析，导致无法出峰；ISO15154:
2003（CORESTA第38号）标准方法渗析器上层及之前的管路里为样品萃取液和醋酸，可使渗析器上层流路中液体为弱酸性，减缓渗析膜上沉淀的生成，当进样次数达到40杯以后，随着渗析膜上生成的沉淀增加，会对渗析造成显著影响，仍然会出现峰高逐渐下降的现象。
YC/T159-2002方法的目标物是在强碱性、85℃条件下进行测试，因此YC/T159-2002方法采用0.5mol/L的氢氧化钠溶液来保证测试环境的强碱性，但是如氢氧化钠溶液浓度过高，其腐蚀性增强，易使85℃加热槽使用寿命缩短，通过实验研究发现目前YC/T159-2002方法采用的氢氧化钠浓度可进行适当的降低，进而延长85℃加热槽的使用寿命。
连续流动方法对流入检测器溶液的温度要求是要在室温左右，由于还原糖测试主要反应是85℃条件下进行的，因此ISO15154:
2003（CRMN°38）标准方法在85℃加热槽后采用冷却器和30匝混合圈来达到这个要求；YC/T159-2002方法中样品在85℃加热槽后至进入检测器之前设置了20匝混合圈，在实际测定过程中发现进入检测器溶液温度并不能有效的降到室温左右，而检测器是一个密闭的空间，随着样品量的增加，检测器温度会逐步升高，从而影响检测结果的准确性，使数据的可比性下降。
质检中心在标准颁布后发现以上问题，并做了大量的实验，探索并形成了目前行业统一使用的解决方案。
考虑到修改后的方法有别于YC/T159-2002标准方法，而且行业也一直未对该标准进行修订，所以行业内部分实验室有可能还是延续标准方法进行检测，这样就容易造成检测数据的偏差。
进一步降低了数据的可比性。
综上所述，有必要对YC/T159-2002进行修订。
本标准修订后，可使连续流动测定烟草水溶性糖的方法更为完善、准确，特别是在大样品量检测中排除干扰，提高检测效率。
2标准适用范围
本标准规定了烟草及烟草制品中水溶性糖含量的测定——连续流动法。
本标准适用于烟草及烟草制品中水溶性糖含量的测定。
3方法原理
用5%乙酸水溶液萃取烟草样品，萃取液中的糖（水溶性总糖测定时应水解）与对羟基苯甲酸酰肼反应，在85℃的碱性介质中产生一黄色的偶氮化合物，其最大吸收波长为410nm，用比色计测定。
4实验方法
4.1仪器与设备
BRAN＋LUEBBEAA3连续流动分析仪；ALLIANCEFUTURAⅡ连续流动分析仪；API305D流动分析仪，SKALARSAN++流动分析仪；HP8453型紫外一可见分光光度计（美国HP公司）；BSA2245-CW电子天平（感量0.0001g，德国赛多利斯公司）；Milli一Element超纯水装置（美国Millipore公司）；烘箱（FD115，德国Binder公司）；振荡器（HY-8调速，常州国华电器有限公司）。
4.2试剂和材料
D-葡萄糖（≥98%,Riedel-deHaen）；冰乙酸（≥99.5%，Regent）；盐酸（质量分数36%-38%,烟台双双化工有限公司）：
氢氧化钠（98%，AlfaAesar）；氯化钙（≥95.0%,天津市瑞金特化学品有限公司）；聚乙氧基月桂醚（Brij-35，上海安妍生物有限公司）；对羟基苯甲酸酰肼（98%，ACROS），柠檬酸（≥99.5%,天津市瑞金特化学品有限公司）；超纯水（电阻率≥18.2MΩ.cm）；烤烟、白肋烟、香料烟监控样品（国家烟草质量监督检验中心提供）、3R4F、烤烟型卷烟（由河南中烟和贵州中烟提供）、混合型卷烟（由北京卷烟厂提供）、加热不燃烧样品（由云南中烟提供）、再造烟叶（由云南中烟再造烟叶提供）以及原料样品（由郑州烟草研究院提供）共计10个样品。
4.3样品的前处理和分析
烟叶样品制备参照YC/T31-1996。
准确称取0.25g样品至50mL具塞三角烧瓶中，加入25mL5%醋酸或去离子水，室温下振荡30min后过滤，使用连续流动分析仪测定，测定管路见图1.1和图1.2。
图1.1测定烟草中的水溶性糖流程分析图（大流量）
图1.2测定烟草中的水溶性糖流程分析图（小流量）
5结果与讨论
5.1定性分析实验
图2所示为不同浓度的标准样品的紫外可见吸收光谱曲线。
根据反应原理，通过标准样品的测试结果来建立标准曲线。
从图2可以判断光谱的最大吸收波长为400nm-410nm之间，由于仪器配套滤光片的波长基本都是10的倍数，故本实验维持原标准的410nm滤光片。
图2不同浓度标准样品的紫外可见吸收光谱曲线
5.2萃取剂及萃取时间的选择
由于本方法主要是部分试剂的替换和修改，其它试剂保持不变，YC/T159－2002《烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法》的方法在制定过程中已进行过萃取剂及萃取时间的实验，因此本方法直接采用水或5%醋酸溶液对样品进行萃取，不再进行萃取剂及萃取时间的实验。
5.3盐酸溶液浓度的选择
5.3.1AA3机型实验
原标准中规定，当测定还原糖含量时，位于加热槽上层的红/红管路为活化水，此时渗析器下层流路中的NaOH溶液会渗析到上层，与烟草萃取液反应，易在渗析膜上产生沉淀，随着样品进样次数的增加生成的沉淀逐渐增加，从而导致样品峰高逐渐下降，在20杯以后表现尤为明显。
本研究中，选择将红/红管路活化水改为0.10mol/L、0.20mol/L、0.30mol/L、0.50mol/L、1.00mol/L五种不同浓度HCl溶液测定烤烟监控样品的还原糖含量，样品进样数n=6。
结果（图3）显示,当使用不同浓度盐酸溶液时，其还原糖含量均在标注值范围之内（均大于最小值），当盐酸浓度低于0.20mol/L时，烤烟还原糖含量最接近标注值，且与原标准方法（即盐酸浓度为0）结果无显著差异。
随着盐酸浓度的升高，还原糖含量在逐渐降低，这可能与还原糖于无机酸产生脱水反应，生成5-羟甲基糠醛有关，这也与前人研究结果一致。
图3不同浓度HCl溶液测定烤烟还原糖含量（a代表0.05显著水平，下同）
鉴于以上结论，项目组还考察了0.00mol/L、0.10mol/L、0.20mol/L、0.30mol/L盐酸浓度的连续进样数。
结果（图4）可以看出，当盐酸浓度为0.20mol/L和0.30mol/L时，测定还原糖含量的有效进样数均达到60杯以上，远大于原标准方法（盐酸浓度为0）的20杯和0.10mol/L盐酸的40杯，结合成本考虑，故选择将原标准方法中红/红管路活化水改为0.20mol/L盐酸溶液，不影响测定结果，且能极大提高工作效率。
图4不同浓度HCl溶液连续进样的烤烟还原糖含量变化
5.3.2不同机型验证结果
图5不同机型验证实验结果
项目组组织了3家拥有不同机型（SKALARSAN++、API、ALLIANCE）的连续流动分析仪的实验室对这一条件进行了验证，选用监控样品烤烟（A）和香料烟（C）作为样品，结果如图5所示，3种机型的验证结果均在监控样品的扩展不确定度范围内，均为有效结果。
5.4氢氧化钠溶液浓度的选择
5.4.1AA3机型实验
YC/T159-2002方法的目标物是在强碱性、85℃条件下进行测试，因此YCT159-2002方法采用绿/绿管路中0.5mol/L的NaOH溶液来保证测试环境的强碱性，实际检测中发现如果NaOH溶液浓度过高，易使85℃加热槽使用寿命缩短，本研究选择0.15mol/L、0.25mol/L、0.40mol/L、0.50mol/L（原标准方法）、0.60mol/L、0.70mol/L六种不同浓度NaOH，其他条件不变，测定烤烟监控样中还原糖的含量。
结果见图6和图7。
图6不同NaOH溶液浓度测定烤烟还原糖含量
图7不同氢氧化钠浓度通过检测器溶液pH值
图6可见，与原标准方法（0.5mol/L）相比，采用0.40mol/L氢氧化钠溶液的测定结果更接近标注值，且结果无显著差异。
结合图7，选择0.40mol/L氢氧化钠溶液能较好的维持原标准方法要求的强碱性环境（pH值大于12）。
5.4.2不同机型验证结果
图8不同机型验证实验结果
项目组组织了3家拥有不同机型（SKALARSAN++、API、ALLIANCE）的连续流动分析仪的实验室对这氢氧化钠溶液浓度进行了验证，选用监控样品烤烟（A）和香料烟（C）作为样品，结果如图5所示，3种机型的验证结果均在监控样品的扩展不确定度范围内，均为有效结果。
5.5测定还原糖加热槽温度的选择
图9不同加热槽温度测定还原糖实验结果
连续流动方法对流入检测器溶液的温度要求是要在室温左右，YCT159-2002方法中样品在85℃加热槽后至进入检测器之前设置了20匝混合圈，但在实际测定过程中进入检测器溶液温度并不能有效的降到室温左右，而检测器是一个密闭的空间，随着样品量的增加，检测器温度会逐步升高，从而影响检测结果的准确性，使数据的可比性下降。
本研究设置了77℃、79℃、81℃、83℃、85℃、87℃、89℃、91℃7种温度梯度，其他条件不变，测定烤烟还原糖的含量。
结果（图9）表明，加热槽温度为79℃时，其测定还原糖含量最接近标注值，且与原标准方法（85℃）结果无显著差异。
项目组鉴于前期实验结果拟打算修改加热槽温度为79℃，并组织了12家实验室对这一条件进行验证，结果见表1。
表1监控样品还原糖测定值实验室统计结果
样品
参加实验室数
还原糖数据超标数
烤烟（A）
12
4
香料烟（C）
12
6
由表1可知，从选用的2个样品测定结果来看，12家实验室对于监控样品烤烟（A）测定结果有4家数据超过标注值范围，对于香料烟（C）有6家实验室超过标注值范围，综合考虑到不同机型以及不同实验室的环境（海拔、温湿度等）的影响，项目组认为测定还原糖加热槽温度由原来的85℃条件检测结果较79℃更稳定，因此本标准加热槽温度继续维持85℃。
5.6检测器温度比较
连续流动方法对流入检测器溶液的温度要求是要在室温左右，由于还原糖测试主要反应是85℃条件下进行的，因此ISO15154:
2003（CRMN°38）标准方法在85℃加热槽后采用冷却器和30匝混合圈来达到这个要求；YC/T159-2002方法中样品在85℃加热槽后至进入检测器之前设置了20匝混合圈，在实际测定过程中发现进入检测器溶液温度并不能有效的降到室温左右，而检测器是一个密闭的空间，随着样品量的增加，检测器温度会逐步升高，从而影响检测结果的准确性，使数据的可比性下降。
表2不同进样杯数检测器内部温度变化
方法
进样杯数
10
20
30
40
50
60
70
YCT159
22.3
23.5
24.8
25.6
26.2
27.0
27.1
增加散热装置
22.2
22.3
22.5
23.4
23.8
23.6
23.4
表2可见，原标准随着检测样品量的增加，检测器内部温度在逐渐上升而增加了散热装置，其检测器内部温度基本稳定在一个恒定值，说明进入检测器溶液的温度能有效的降到室温，能持续满足检测器对于环境的要求。
5.7方法的验证
5.7.1标准曲线、检出限和定量限
将D-葡萄糖用水配制成浓度为39.9592mg/ml的标准储备液，分别准确移取0.5ml、1.0ml、2.5ml、3.0ml、5.0ml标准储备液于50ml容量瓶中，用萃取液定容，换算成AA3仪器要求浓度分别为9.9898mg/25ml、19.9796mg/25ml、49.9490mg/25ml、59.9388mg/25ml、99.8980mg/25ml。
采用优化后的方法测定，以目标物的浓度（y，mg/25ml）对其峰高（x）进行线性回归，回归方程y=0.0024x-7.8938，相关系数为0.9999。
采用改进管路将萃取液（5%冰乙酸）连续10次进样，计算还原糖的标准偏差（SD）为0.0021%、检出限（3SD）为0.0063%，定量限（10SD）为0.0210%。
结果见表3。
表3方法的检出限和定量限
测定项目
平均值/（%）
SD/（%）
检出限/（%）
定量限/（%）
还原糖
0.0043
0.0021
0.0063
0.0210
5.7.2方法的精密度
选用国家烟草质量监督检验中心烤烟、香料烟监控样品、烤烟型卷烟和混合型卷烟按照本方法进行测定还原糖和总糖，每天测试5次，分5天测试。
稳定性和重复性实验结果见表4。
两种样品的日间和日内相对标准偏差均小于5%，说明改进后的方法稳定性和重复性好。
表4方法的精密度
烟叶类型
指标
日内（n=5）
日间（n=5）
平均值/（%）
相对标准偏差/（%）
平均值/（%）
相对标准偏差/（%）
烤烟
还原糖
27.2
2.6
27.1
3.2
总糖
31.5
1.8
31.4
2.6
香料烟
还原糖
8.52
3.2
8.49
3.3
总糖
9.44
2.6
9.48
3.4
烤烟型卷烟
还原糖
23.4
2.8
23.5
2.6
总糖
24.6
3.1
24.5
3.4
混合型卷烟
还原糖
13.1
3.3
13.3
3.9
总糖
14.3
3.7
14.4
4.1
5.7.3方法的回收率
取监控样品A、C、混合型卷烟及烤烟型卷烟，按照改进后管路测定还原糖和总糖，分别加入高、中、低三个浓度水平标准溶液，每个样品重复5次，计算回收率。
结果（表5）显示：
回收率在98.01%-102.04%之间，说明该方法的准确度较高，可以满足定量分析的要求。
表5方法的加标回收率
样品
指标
样品含量/（%）
加标量/（%）
测定量/（%）
回收率/（%）
烤烟（A）
还原糖
27.1
21.5
47.82
98.40
27.1
27.0
54.14
100.07
27.1
32.5
59.14
99.23
总糖
31.2
25.5
56.43
99.52
31.2
31.0
62.33
100.21
31.2
37.5
67.66
98.49
香料烟（C）
还原糖
8.21
6.5
14.65
99.59
8.21
8.2
16.33
99.51
8.21
9.9
17.75
98.01
总糖
9.45
7.5
16.69
98.47
9.45
9.5
19.22
101.42
9.45
11.5
20.62
98.42
烤烟型卷烟
还原糖
23.2
18.5
41.45
99.40
23.2
23.5
46.04
98.59
23.2
28.0
51.85
101.27
总糖
24.7
20.0
43.83
98.05
24.7
24.5
48.36
98.29
24.7
29.5
54.66
100.85
混合型卷烟
还原糖
13.0
10.5
23.98
102.04
13.0
13.0
26.02
100.08
13.0
15.5
28.96
101.61
总糖
14.2
11.5
25.26
98.29
14.2
14.0
28.65
101.60
14.2
17.0
31.08
99.62
5.7.4比对实验
为了考察新老方法检测结果的差异，同时考察方法的可靠性和普适性，项目组选用了质检中心3个监控样品和8种市售卷烟样品进行了检测结果的数据比对，卷烟样品信息见表6，比对结果见表7。
表6卷烟样品信息表
卷烟类型
编号
盒标烟气指标
焦油量/mg
烟气烟碱量/mg
CO含量/mg
烤烟型
1
11
1.1
13
2
11
0.8
13
3
11
1.0
11
4
8
0.8
9
5
10
0.9
11
混合型
6
11
1.0
12
7
8
0.7
10
8
11
1.0
13
表7两种方法测定结果对比
样品
平行测定次数
标准方法/%
本方法/%
F值
F临界值
烤烟
5
26.53
26.62
1.94
5.98
白肋烟
5
0.16
0.16
3.00
香料烟
5
8.52
8.53
0.88
卷烟1
5
15.65
15.29
1.36
卷烟2
5
11.25
11.27
1.56
卷烟3
5
16.29
16.32
2.18
卷烟4
5
19.65
19.63
2.02
卷烟5
5
16.77
16.80
2.91
卷烟6
5
7.54
7.58
1.74
卷烟7
5
10.20
10.13
0.96
卷烟8
5
11.55
11.56
1.47
由表7可见，可以看出，F值均小于F临界值，说明两种方法测定的还原糖含量无显著差异。
为了考察本方法在不同实验室间的再现性，项目组分别在上海烟草集团北京卷烟厂、云南中烟工业有限责任公司、云南中烟再造烟叶有限责任公司、郑州烟草研究院和云南省烟草质量监督检测站、贵州中烟工业有限责任公司、河南中烟工业有限责任公司、河南省烟草质量监督检测站、西北烟草质量监督检测站、广东省烟草质量监督检测站、山东中烟工业有限责任公司等12家单位组织开展比对实验。
本次比对实验选用了不同烟草及烟草制品共8个类型，进行总糖和还原糖的测定，结果见表8。
表8比对实验结果
样品
实验室
总糖
还原糖
实验室内
实验室间
实验室内
实验室间
平均值（%）
RSD（%）
平均值（%）
RSD（%）
平均值（%）
RSD（%）
平均值（%）
RSD（%）
烤烟（A）
贵州中烟
31.1
3.6
31.0
2.7
27.6
1.8
27.4
1.6
北京卷烟厂
30.9
2.6
27.6
2.4
云南站
31.4
2.8
27.2
3.4
西北站
30.6
3.4
27.4
2.6
云南再造烟叶
29.8
4.2
27.2
4.1
郑州院
31.1
3.5
27.7
2.1
河南站
32.8
4.5
27.8
3.3
云南中烟
32.0
3.5
28.1
4.5
广东站
30.4
3.6
26.9
4.6
河南中烟
30.9
3.4
27.1
2.5
山东中烟
29.9
2.9
26.4
2.8
质检中心
31.1
2.4
27.3
3.2
香料烟（C）
贵州中烟
9.64
0.9
9.6
1.6
8.34
1.2
8.3
2.7
北京卷烟厂
9.46
4.2
8.45
2.6
云南站
9.51
3.6
8.39
1.8
西北站
9.70
2.5
8.35
1.5
云南再造烟叶
9.31
3.5
8.56
1.5
郑州院
9.72
1.8
7.97
4.0
河南站
9.44
4.4
8.53
3.8
云南中烟
9.83
4.1
8.18
1.9
广东站
9.43
3.2
8.09
2.2
河南中烟
9.56
2.6
8.49
2.8
山东中烟
9.63
4.3
7.88
2.8
质检中心
9.72
2.8
8.13
2.4
3R4F
贵州中烟
8.81
1.5
8.8
2.4
8.08
4.2
8.0
1.8
北京卷烟厂
8.75
1.8
7.82
2.8
云南站
8.81
1.2
7.84
3.5
西北站
8.92
0.6
7.95
3.4
云南再造烟叶
8.28
1.5
7.98
3.5
郑州院
9.03
2.4
7.81
4.1
河南站
9.07
3.3
8.16
1.2
云南中烟
9.09
4.5
8.23
0.6
广东站
8.77
0.9
8.16
2.4
河南中烟
8.84
2.2
7.94
2.2
山东中烟
8.72
2.5
8.10
1.5
质检中心
8.76
2.0
8.02
2.1
混合型卷烟
贵州中烟
14.7
1.1
14.3
2.2
13.0
0.9
12.9
0.9
北京卷烟厂
14.2
1.5
12.8
4.4
云南站
14.2
2.2
13.0
1.2
西北站
14.8
3.5
13.0
3.3
云南再造烟叶
14.0
2.4
13.2
3.6
郑州院
14.5
3.3
13.0
3.3
河南站
14.5
2.1
13.0
2.6
云南中烟
14.1
1.2
12.9
3.2
广东站
14.0
4.4
12.9
1.2
河南中烟
13.9
2.1
12.8
3.5
山东中烟
14.0
0.8
12.8
0.8
质检中心
14.2
0.9
13.0
1.5
新型烟草制品
贵州中烟
11.9
4.2
11.7
2.6
11.1
3.4
10.9
1.2
北京卷烟厂
11.6
3.6
10.9
4.2
云南站
11.0
3.5
10.9
2.5
西北站
11.8
4.4
11.2
3.5
云南再造烟叶
11.6
3.2
10.8
1.2
郑州院
11.6
1.5
11.0
1.5
河
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