miRNAs在PAH肺动脉重塑中的研究进展全文.docx

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miRNAs在PAH肺动脉重塑中的研究进展全文

2021年miRNAs在PAH肺动脉重塑中的研究进展（全文）

一、简介

  PAH是一种隐匿进展性疾病，临床表现为进行性呼吸困难、右心室后负荷增加，及致右心功能衰竭而死亡。

肺动脉重塑是PAH的主要病理特征，是指肺血管结构和功能异常，包括肺血管床内膜损伤、中层肥厚、外膜纤维化以及基底膜的硬化，最后导致肺动脉管腔进行性狭窄、闭塞，肺血管阻力不断升高。

  MicroRNAs是一类进化上高度保守的单链核苷酸，miRNAs主要与靶mRNA的3′非翻译区（3′－untranslatedregion，3′－UTR）相互作用，在转录水平上调控基因表达。

其中，动物miRNAs与靶mRNA的3′－UTR部分互补匹配，多使靶序列被抑制[1]。

miRNAs特异性低，作用于多个靶基因，形成复杂的调控网络，在细胞生长、发育和死亡等许多生理和病理过程中发挥重要作用。

PAH预后差、死亡率高，研究PAH疾病进程中miRNAs对肺动脉重塑的作用机制对提高治疗手段和帮助诊断具有重要意义。

二、MiRNAs与血管重塑

  目前血管具体重塑过程尚未阐明，但一般认为，肺动脉内皮细胞（PAECs）的损伤导致其丧失屏障及功能完整性，出现自体凋亡，经过一定过程转化为为凋亡抵抗的、促血管生成的内皮细胞（ECs）。

同时，肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）和外膜成纤维细胞（PAFs）也在增殖，三者在细胞外基质（ECM）分解和沉积改变的帮助下，推动血管重构[2]。

（一）内膜

  内皮功能障碍是PAH血管病理发生和发展的主要因素，包括血管收缩受损、内皮细胞增殖不平衡、内皮血管活性介质的生成异常和内皮间充质转化。

正常细胞通过一系列严格的调控机制监控细胞周期，但在PAH中miRNAs直接或间接的影响细胞周期调控因子，破坏ECs增殖平衡。

对人肺动脉内皮细胞（HPAECs）缺氧处理后，miR－125a显著上升，靶向调节BMPR2的蛋白水平，而抑制miR－125a可以上调CDKN1A和CDKN2A，从而抑制HPAEC的增殖。

CDKN作为一种肿瘤抑制因子，抑制细胞周期蛋白依赖性激酶，阻止细胞从G1期进入S期。

考虑到已有实验证实了BMP－2诱导CDKN1A产生这种下游效应，所以在PAH中miRNA－125a可能通过靶向BMPR2表达介导CDKN调节内皮细胞增殖[3]。

  新的一些研究表示miRNAs可以影响PAECs线粒体和细胞的代谢，从而改变细胞增殖和迁移表型。

遗传性和特发性PAH患者外周血来源的过度生长内皮细胞（BOECs）表型异常，概括为患者PAECs代谢异常，从氧化磷酸化向需氧糖酵解的表型转变。

对正常BOECs进行BMPR2基因敲除，miR－124显著下调，其靶蛋白剪接因子多嘧啶结合蛋白（PTBP1）增加，糖酵解增强。

在严重PAH的大鼠模型中，除了上述表现，PKM2表达也增加。

相反，过表达miR－124或沉默PTPB1可恢复BOECs的正常增殖和糖酵解，部分恢复线粒体呼吸。

因此，miR－124表达下调改变PTPB1和PKM2/PKM1水平，导致PAH内皮细胞代谢和增殖异常[4]。

  在长期缺氧状况下，肺高血压（PulmonaryHypertension，PH）患者PAECs中miR－210表达上调，铁硫簇支架蛋白ISCU1/2和Fe－S下调。

对小鼠分别进行低氧、miR－210过表达以及ISCU1/2敲除的处理，也发现Fe－S水平下降，使糖酵解和代谢转移增强，PAECs增殖。

相反，抑制miR－210表达可以形成对Fe－S和PH抵抗表型，此外，ISCU1/2可以独立影响线粒体代谢。

可见，miRNA－210－ISCU1/2轴改变Fe－S依赖的线粒体呼吸，促进低氧性PH发展[4]。

  内皮间充质转换（EndMT）是指PAH患者肺动脉内皮细胞形态发生改变，并且通过标志蛋白的表达检测发现有平滑肌样细胞和小部分移行细胞（即同时含有内皮样细胞标志蛋白和平滑肌样细胞标志蛋白）的存在[8,9]，研究发现miRNAs在EndMT过程中发挥重要作用。

在大鼠PAECs和HPAECs中，缺氧诱导miR－27a的表达上调，抑制miR－27a可抑制缺氧诱导的EndMT。

miR－27a的高表达通过靶向Smad5来抑制骨形态发生蛋白（BMP）信号，从而减轻分化抑制因子Id2对EndMT的两个关键介质（Snail、Twist）的抑制[10]。

针对新生儿持续性肺动脉高压（PPHN）的研究发现，缺氧诱导的新生大鼠循环、肺微血管内皮细胞的miR－126a－5p的表达升高，血小板内皮细胞粘附分子（Pecam1）表达降低，而平滑肌肌动蛋白（SMA）表达升高，在miR－126a－5p敲除的细胞内表达相反[11]，进一步实验表明miR－126a－5p可能通过p85－beta/p－AKT通路参与新生儿肺动脉高压内皮间质转化。

血管活性介质及其受体在PAH动脉血管收缩机制中已受到广泛研究并应用于PAH患者的临床治疗，而事实上，这类物质在缓解和逆转肺动脉重构也有很大的意义。

在PAH患者分离的PAECs中，miR－98表达下调，内皮素（ET－1）表达上调，细胞增殖增加。

在对PAECs在体内外进行缺氧处理也得到相同结果并发现PPAR－γ对miR－98有正向调节作用，而miR－98的上调可以靶向抑制ET－1水平和减缓细胞增殖。

所以，通过PPAR－γ的激活恢复miR－98、ET－1的水平不失为一个好的治疗机制[6]。

  此外，miRNAs也可以作为旁分泌信号进行细胞间通讯。

在针对抗凋亡微血管内皮细胞（PVECs/AR）的研究发现，缺氧时PVECs/AR分泌的miRNA－195－5P水平增加。

通过与PASMCs共培养分析，miRNA－195－5p作为介质作用于共培养的PASMCs，调节其增殖和迁移。

通过进一步实验，考虑ECs可能通过HIF－1a/miRNAs－195－5p/Smad7途径，以旁分泌方式促进PASMCs的增殖和迁移[7]。

（二）中膜

  中膜的肥厚主要是PASMCs异常增殖导致的，是PAH最重要的病理过程。

在病理状态下，PASMCs突破内弹性膜的限制，获得更大的肌节数和长度，增殖为新内膜，使血管壁硬化，管腔狭窄，导致肺动脉压的持续升高。

  上文提到miR－125a促进ECs增殖的机制，事实上，根据不同细胞的类型和背景，miR－125家族通过不同信号转导参与血管重构。

在缺氧PASMCs中，miR－125a调控线粒体融合蛋白（Mfn1）的上调，介导线粒体稳态破坏，并促进细胞由G0/G1进入S期。

而miR－125a激活剂在体内外都可以减轻Mfn1对肺血管重塑的作用，miR－125a抑制剂则模拟缺氧对线粒体稳态的影响[12]。

本中心研究发现在野百合碱（MCT）诱导的PAH大鼠体内，上调miR－125a－5p的表达，PASMCs的增殖抑制、凋亡增加，延缓了肺血管重构。

进一步实验表明，miR－125a－5p受TGF－β1和IL－6负反馈调节，直接靶向STAT3的3′－UTR，抑制下游分子增殖细胞核抗原、Bcl－2和生存素，影响细胞表型变化[13]。

  同内皮细胞一样，PASMCs的线粒体和细胞代谢的改变是肺动脉重塑中重要的病理机制，而miRNAs的调节在这个过程中有着重要意义。

  线粒体钙单向转运蛋白（MCU）障碍会降低线粒体内Ca2+，抑制丙酮酸脱氢酶活性和葡萄糖氧化，增加胞浆Ca2+，启动了Warburg效应，使细胞在氧气充分条件下进行糖酵解。

在PAH患者PASMCs中，miR－138和miR－25直接或通过下调转录调控子抑制MCU，而在MCT－PAH大鼠中，雾化抗miR－25和miR－138可恢复MCU的表达。

MCU水平增加，线粒体钙浓度下降，从而抑制了细胞分裂，减少细胞迁移，而抑制MCU可以重现PAH的表型[14]。

  瞬时受体电位通道（TRPC1）是一种质膜阳离子通道，介导Ca2+内流。

miR－135a－5p靶向与TRPC1的mRNA，降低TRPC1蛋白表达。

在MCT－PAH大鼠中，在疾病的早期肺中miR－135a－5p的表达急剧下降，在后期却增加了12倍或10倍。

而在体内外试验中，早期激动miR－135a－5p可以抑制TRPC1，抑制PASMCs的增殖和迁移，逆转肺动脉重建[15]。

  PASMCs也可以通过外泌体（EXOs）介导的miRNAs沟通内皮细胞，以旁分泌方式调节邻近细胞表型。

在PAH患者和牛犊模型的动脉血管壁中，miR－143的表达升高，且miR－143－3p有在PASMCs迁移时选择性的上调，而在慢性缺氧小鼠中，下调miR－143水平对PAH有预防和逆转作用。

在转染pre－miR－143－3p的PASMCs中，EXOs可以富集miR－143－3p，并被邻近PAECs吸收，诱导细胞迁移和血管生成[16]。

  此外，在PAH患者和大鼠的肺组织中，miR－221－3p表达升高。

AXIN2异位表达或对β－catenin的药理抑制可以减弱miR－221－3p的影响，而沉默miR－221－3p则可以减缓大鼠PAH的发展。

轴向抑制蛋白（AXIN2）是miR－221－3p的靶基因，而β－catenin表达的调节依赖于AXIN2。

因此，miR－221－3p的表达上调，靶向抑制AXIN2的表达，促进PASMCs增殖和抑制其凋亡[17]。

  （三）外膜

  在PAH病变中，异常表观遗传机制的调节，诱导肺血管外膜主要成分成纤维细胞（PAFs）形成高增殖、迁移、纤维化、炎症特性[18]。

在严重PAH的患者和牛犊的PAFs中，miR－124的表达显著降低，PKM2/PKM1比值显著高于对照组。

其作用与在内皮中相似，miRNA－124选择性调控PTBP1，上调丙酮酸激酶PKM2/PKM1比例，调节肺动脉高压血管外膜成纤维细胞的整体代谢、增殖和炎症状态[19]。

此外，MiR－124下调介导的PTBP1也可通过Notch1/PTEN/FOXO3等通路调节p21/Cip1和p27/Kip1细胞周期调控基因，上调PAFs单核细胞趋化蛋白（MCP－1）的表达[20]，形成高度增殖、迁移和炎症表型。

在不同疾病中，miR－29通过调节成纤维细胞的激活，参与了器官纤维化的发展。

在PAH方面，在体内外缺氧诱导的PAFs活化都伴随着miR－29a－3p的显著下调。

miR－29a－3p抑制剂模拟缺氧对PAFs的影响，而miR－29a－3p模拟物可以抑制PAFs活化相关蛋白，抑制细胞迁移、增殖和分泌[21]。

  （四）基质

  在PAH中，小动脉细胞外基质硬化是一个早期和普遍的过程，ECM通过改变胶原蛋白和弹性蛋白沉积的平衡、基质降解等，为肺血管重塑中细胞增殖、存活和迁移创造外环境。

在不同的血管细胞体外试验中，ECM刚度作为机械刺激，通过YAP/TAZ和POU5F1/OCT4依赖的途径使miR－130/301的表达上调。

有趣的是，miR－130/301也可以调控PPAR－γ－ApoE－LRP8轴调节下游胶原沉积和ECM重塑，形成了一个正反馈调控环。

但是，在刚度减弱的情况下，miR－130/301表达下调，表明它在后期的相关性可能不那么线性。

此外，这种ECM重构诱导了miR－21和miR－27a的表达，控制肺血管其他细胞增殖和功能变化。

进一步实验发现，miR－130/301家族并不依赖于单一的基因靶点或通路，而是在体内诱导纤维化基因程序性表达[22]。

三、MiRNAs在PAH诊断和治疗中的价值

  尽管目前肺动脉高血压诊断意识已明显提高，但由于PAH患者的症状和体征不典型，诊断“金标准”的右心导管需要在有经验的治疗中心才可以实施，使得大多数患者确诊时为疾病晚期。

PAH的诊断缺乏特异的诊断来进行早期预警，来监测疾病进展、预后评估。

miRNAs具有稳定性、易检测性和序列保守性，因此miRNAs在检测癌症和其他疾病方面有作为疾病生物标志物的应用价值[23]。

相当多的研究工作表明血清miRNAs对PAH的诊断有很大的潜能，且部分miRNAs与严重程度相关。

在PAH患者血浆中miR－19a、miR－23a、miR－30a5p、miR－130/301、miR－424显著上调，miR－21、miR－1181、miR－193减少，其中miR－424增加显著，且与患者疾病严重程度有关。

此外，根据ROC曲线评估病人血浆miRNAs诊断价值，发现miR－451与多普勒心超诊断价值相当，而联合应用更有价值[24]，能更好为PAH的早期诊断服务。

  因此，血液循环中miRNAs的研究为PAH的诊断和预测疾病提供了潜在的分子生物标志物。

目前，PAH药物治疗主要是肺血管靶向药物，包括内皮素途径、前列环素途径和一氧化氮（NO）等三大经典途径，使PAH患者1年、3年和5年生存率分别从77％、41％和27％升高至85％、68％和57％[25]。

虽然近年来PAH治疗取得了可观进展，但不能根本阻止肺血管重塑的进展和诱导失去的微血管的再生[26]。

我们亟需一种针对PAH进展的驱动因素的治疗方法。

miRNAs可以作用于多个靶点，同时一个靶点受多个miRNAs调节，为从病理机制的根本上治疗PAH提供了可能。

在很多动物模型实验中miRNAs的模拟物或拮抗剂显示出减轻或逆转PAH的潜力，有实验团队利用功能化脂质纳米粒传递miRNAs拮抗剂[27]逆转大鼠PAH，提出了新的有效、低毒的转染介质。

此外，从间充质细胞的外泌体（MSCS－EXOs）分离的相关miRNAs具有抗炎、抗增殖的能力，因此推测可以外泌体可以通过其miRNAs载量改善肺动脉病变[28]。

四、问题与展望

  在miRNAs进入临床实践之前，仍然存在有待解决的问题。

首先，实验动物模型的不同病理机制、内在差异分子靶点和患者不同的遗传、环境因素，都影响miRNAs的研究准确性和特异性。

其次，从血液中提取miRNAs的方法不同，差异不明显，甚至用作参考基因的内源性miRNAs实际上也是不稳定的，所有的这些都使得研究结论的进一步推广和应用受到限制。

在治疗方面，尽管miRNAs治疗的前景很好，但必须考虑到利用MSCs所产生的副作用。

因为miRNAs的高保守性决定了其低特异性，它可能靶向多种下游蛋白，影响全身细胞[29]，以及如何诱导MSCs的归巢都需要进一步探索。

虽然动物实验与临床有着巨大的鸿沟，但不能否认miRNAs在PAH的发生发展的巨大作用。

随着更稳定精确的技术发展和更深层次的探索，miRNAs在肺动脉高压诊断和治疗中一定具有广阔的应用前景。