植物活性多糖的分离纯化与鉴定.docx
《植物活性多糖的分离纯化与鉴定.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《植物活性多糖的分离纯化与鉴定.docx(7页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
![植物活性多糖的分离纯化与鉴定.docx](https://file1.bdocx.com/fileroot1/2023-2/2/3b0b1d8a-00d0-4607-b0bb-a2b939b6aaa2/3b0b1d8a-00d0-4607-b0bb-a2b939b6aaa21.gif)
植物活性多糖的分离纯化与鉴定
实验四、植物活性多糖的分离、纯化与鉴定
第一部分多糖的提取、纯化
【实验目的】
1、了解多糖提取和纯化的一般方法。
2、学习多糖的定量测定方法。
【实验原理】
多糖类物质是除蛋白质和核酸之外的又一类重要的生物大分子。
早在60年代,人们就发现多糖复杂的生物活性和功能。
多糖是普遍存在于自然植物界中的由许多相同或不同的单糖以α-或β-糖苷键所组成的化合物,其分子量一般为数万甚至数百万,是构成生命活动四大基本物质之一,与维持生命功能密切相关。
大部分植物多糖不溶于冷水,在热水中呈粘液状,遇乙醇能沉淀。
多糖具有抗氧化性、抗病毒性、反互补特性[1],大量药理及临床研究表明,多糖类化合物是一种免疫调节剂,它具有明显的抗补体活性和促进淋巴细胞增殖作用,能激活免疫受体,提高机体的免疫功能,在用于癌症的辅助治疗中,具有毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好等优点[2]。
本实验采用常规法(即水溶醇沉法)从植物组织中提取出水溶性粗多糖,对提取得到的多糖进行分离纯化,除去色素及小分子杂质,并采用Sevage法除蛋白。
用蒽酮比色法测定多糖的含量。
多糖的纯化,就是将存在于粗多糖中的杂质去除而获得单一的多糖组分。
一般是先脱除非多糖组分,再对多糖组分进行分级。
常用的去除多糖中蛋白质的方法有:
Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法,这些方法的原理是使多糖不沉淀而使蛋白质沉淀,其中Sevag方法脱蛋白效果较好,它是用氯仿:
戊醇或丁醇,以4:
1比例混合,加到样品中振摇,使样品中的蛋白质变性成不溶状态,用离心法除去。
本实验采用Sevag法(氯仿:
正丁醇=4:
1混合摇匀)进行脱蛋白,用DEAE-纤维素层析柱进行纯化,然后合并多糖高峰部分,浓缩后透析,冻干,得多糖组分。
多糖被浓硫酸水合产生的高温迅速水解,产生单糖,并迅速脱水生成醛糖衍生物,在这种强酸条件下与苯酚反应生成橙色衍生物,该衍生物在波长490nm处和一定浓度范围内,吸光度与糖浓度呈线性关系,采用比色法对多糖含量进行测定。
【实验试剂和器材】
1.试剂
活性炭、硫酸,5%苯酚溶液,葡萄糖,过氧化氢,乙酸铅,丙酮,乙醇、无水乙醇Na2HPO4·12H2ONaH2PO4·2H2O乙醚
平衡缓冲溶液:
0.01mol/LTris-HCL,PH=7.2。
洗脱液:
A:
0.1molNaCl,0.01molTris-HClPH=7.2;
B:
0.5molNaCl,0.01molTris-HClPH=7.2。
Sevag试剂:
氯仿:
正丁醇=3:
1
2.材料
香蕉皮粉末市售香蕉的皮。
3.器材
多功能粉碎机、恒温水浴锅、DEAE-纤维素,离心机,透析袋、分光光度计、层析柱(2.5×30cm)
【操作方法】
一、粗多糖的提取
将香蕉皮切碎烘干后,粉碎过筛。
称取2g,采用热水浸提法,每次原料和水之比均为1:
10,浸提温度为80℃,浸提时间1.5h,共提取4次,合并4次浸提液。
浓缩一倍体积。
对多糖提取液需进行脱色处理,即以1%的比例加入活性炭,搅拌均匀15min后过滤即可。
在浓缩液中加入3倍体积的95%乙醇搅拌,置冰箱24h,沉淀为多糖和蛋白质的混合物,此为粗多糖。
它只是一种多糖的混合物,其中可能存在中性多糖、酸性多糖、单糖、低聚糖、蛋白质和无机盐,必须进一步分离纯化。
二、粗多糖的纯化
粗多糖溶液置于分液漏斗中,按照提取液体积的1/5量加入Sevag试剂(氯仿:
正丁醇=3:
1混合摇匀),振荡20min,3000r/min的转速下,离心15min,得上清液测其体积,继续加相应体积的Sevag试剂,并重复上述操作,直至氯仿层与正丁醇层之间无乳白色变性蛋白质析出为止。
收集上清液,加足量活性炭,摇匀,恒温30min,过滤,得滤液备用。
将上述滤液倒入下端扎好的截流分子量为6000~8000的半透膜袋中,将袋的另一端用绳扎好后,悬挂在盛有水的烧杯里,将烧杯放在磁力搅拌器上,开动搅拌,蒸馏水透析48h,期间每2h更换一次水,经常更换清水使透析膜内溶液的浓度差加大,并加以搅拌,加快透析速度,除去无机盐、单糖、双糖等小分子杂质。
加3倍体积95%乙醇醇沉。
沉淀放入冰箱干燥,获得白色固体粉末,即得精制香蕉皮多糖。
三、多糖的测定(苯酚-硫酸法)
1 .样品溶液的制备
精密称取适量样品,用蒸馏水溶解,定容至50ml,即为待测样液。
2 .标准曲线的制备
精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品1g,置于100ml容量瓶中,溶解并稀释至刻度,配成10mg/ml的标准贮备液,吸上述贮备液1ml定容至100ml,配成0.1mg/ml的工作液。
精密移取葡萄糖标准液0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6ml于25ml具塞刻度试管中,加蒸馏水至2.0ml,再各加5%苯酚溶液1.0ml摇匀,迅速加入浓H2SO4溶液5ml,振摇5min,放置10min,置沸水浴中加热20min,取出冷却至室温,于490nm,以试剂空白为参比测定吸光度。
3.样品测定
取2支试管各加入样品溶液2mL,按标准曲线制备方法操作,测定每只试管中反应液的吸光度值。
从标准曲线上查得相应的多糖含量。
并计算百分得率。
三.多糖条件的研究
(一)单因素实验
1.料液比的影响
准确称量一定量的香蕉皮粉五份,料液比分别为
1:
10、1:
15、1:
20、1:
25和1:
30,提取温度为75℃,提取1次,时间为2h。
按照一、二中方法操作,测出吸光度。
2.提取时间的影响
料液比为1:
20,提取温度75℃,提取1次,每次提取时间分别为0.5、1.0、1.5和2.0h。
按照一、二中方法操作,测出吸光度
3.提取温度的影响
准确称取香蕉皮粉六份,料液比为1:
20,分别在70、75、80、85、90和95℃条件下,提取1次,提取时间1.0h。
按照一、二中方法操作,测出吸光度。
4.提取次数的影响
在料液比为1:
20,提取温度为80℃条件下,分别提取1、2、3、4次,每次提取时间为1h。
按一、二中的步骤操作,测出吸光度。
(二)提取条件的优化
在单因子条件探讨的基础上,制定因素水平表:
考察四个因素(料液比、温度、提取次数、每次提取时间),每个因素取三个水平(如温度选择75℃、80℃和85℃三个水平)。
如表1。
表1因素水平表
因素A每次提取时间B温度C料液比D提取次数
水平(h)(℃)(n)
1
0.5
75
1:
102
2
1.0
80
1:
15
3
3
1.5
85
1:
20
4
利用正交试验设计,选择正交表L9(34)表研究香蕉皮多糖的最佳提取条件。
表2正交试验结果与分析
ABCD得率
试验号时间(h)温度(℃)料液比次数吸光度(%)
10.5751:
152
20.5801:
203
30.5851:
254
41.0751:
204
51.0801:
252
61.0851:
153
71.5751:
253
81.5801:
154
91.5851:
202
K1
K2
K3
极差R
最优方案
第二部分多糖的鉴定
【实验目的】
了解薄层层析法分析单糖组分的原理和方法。
【实验原理】
采用薄层层析法分析单糖组分。
薄层层析显色后,比较多糖水解所得单糖斑点的颜色和Rf值与不同单糖标样参考斑点的颜色和Rf值,确定样品多糖的单糖组分。
【实验试剂和器材】
1.试剂
硅胶、浓硫酸,氢氧化钡。
展开剂:
正丁醇:
乙酸乙酯:
异丙醇:
醋酸:
乙醇:
水:
吡啶=7:
20:
12:
7:
6:
6。
显色剂:
1,3-二羟基萘硫酸溶液(0.2%1,3-二羟基萘乙醇溶液):
浓硫酸=1:
0.04(V/V)。
单糖标准品。
2.器材
烘箱、玻璃板
【实验操作】
一、单糖组分分析
1.薄层板制备:
称取硅胶5g于50ml烧杯中,加入用12mL0.3mol/L磷酸二氢钠水溶液,用玻璃棒慢慢搅拌至硅胶分散均匀,铺在玻璃板上(7.5cm×10cm),110℃活化1h。
即置有干燥剂的干燥箱中备用。
2.点样:
称取少许的多糖(0.1克)于2.0mL离心管中,加入1M的硫酸1mL,沸水浴水解2h,然后加氢氧化钡中和至中性,过滤除去硫酸钡沉淀,得多糖水解澄清液。
以此水解液和单糖标准品进行点样进行薄层层析展开。
用点样器点样于薄层板上,一般为圆点,点样基线距底边2.0cm,点样直径为2—4mm,点间距离约为1.5—2.0cm,点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。
点样时必须注意勿损伤薄层表面。
3.展开:
展开室如需预先用展开剂饱和,将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中,浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5—1.0cm(切勿将样点浸入展开剂中),密封室盖,等展开至规定距离(一般为10—15cm),取出薄层板,晾干。
4.显色:
将展开凉干后的薄板再在100℃烘箱内烘烤30分钟,将显色剂均匀地喷洒在薄板上,此板在110℃下烘烤10分钟即可显色。
薄层显色后,将样品图谱与标准样图谱进行比较,参考斑点颜色、相对位置及Rf值,确定样品中有哪几种糖。