植物活性多糖的分离纯化与鉴定.docx
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植物活性多糖的分离纯化与鉴定
实验四、植物活性多糖的分离、纯化与鉴定
第一部分多糖的提取、纯化
【实验目的】
1、了解多糖提取和纯化的一般方法。
2、学习多糖的定量测定方法。
【实验原理】
多糖类物质是除蛋白质和核酸之外的又一类重要的生物大分子。
早在60年代，人们就发现多糖复杂的生物活性和功能。
多糖是普遍存在于自然植物界中的由许多相同或不同的单糖以α-或β-糖苷键所组成的化合物，其分子量一般为数万甚至数百万，是构成生命活动四大基本物质之一，与维持生命功能密切相关。
大部分植物多糖不溶于冷水，在热水中呈粘液状，遇乙醇能沉淀。
多糖具有抗氧化性、抗病毒性、反互补特性[1]，大量药理及临床研究表明，多糖类化合物是一种免疫调节剂，它具有明显的抗补体活性和促进淋巴细胞增殖作用，能激活免疫受体，提高机体的免疫功能，在用于癌症的辅助治疗中，具有毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好等优点[2]。
本实验采用常规法（即水溶醇沉法）从植物组织中提取出水溶性粗多糖，对提取得到的多糖进行分离纯化，除去色素及小分子杂质，并采用Sevage法除蛋白。
用蒽酮比色法测定多糖的含量。
多糖的纯化，就是将存在于粗多糖中的杂质去除而获得单一的多糖组分。
一般是先脱除非多糖组分，再对多糖组分进行分级。
常用的去除多糖中蛋白质的方法有：
Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法，这些方法的原理是使多糖不沉淀而使蛋白质沉淀，其中Sevag方法脱蛋白效果较好，它是用氯仿：
戊醇或丁醇，以4：
1比例混合，加到样品中振摇，使样品中的蛋白质变性成不溶状态，用离心法除去。
本实验采用Sevag法（氯仿：
正丁醇＝4：
1混合摇匀）进行脱蛋白，用DEAE-纤维素层析柱进行纯化，然后合并多糖高峰部分，浓缩后透析，冻干，得多糖组分。
多糖被浓硫酸水合产生的高温迅速水解，产生单糖，并迅速脱水生成醛糖衍生物，在这种强酸条件下与苯酚反应生成橙色衍生物，该衍生物在波长490nm处和一定浓度范围内，吸光度与糖浓度呈线性关系，采用比色法对多糖含量进行测定。
【实验试剂和器材】
1.试剂
活性炭、硫酸，5%苯酚溶液，葡萄糖，过氧化氢，乙酸铅，丙酮，乙醇、无水乙醇Na2HPO4·12H2ONaH2PO4·2H2O乙醚
平衡缓冲溶液：
0.01mol/LTris-HCL,PH=7.2。
洗脱液：
A:
0.1molNaCl,0.01molTris-HClPH=7.2;
B:
0.5molNaCl,0.01molTris-HClPH=7.2。
Sevag试剂：
氯仿：
正丁醇＝3：
1
2.材料
香蕉皮粉末市售香蕉的皮。
3.器材
多功能粉碎机、恒温水浴锅、DEAE-纤维素，离心机，透析袋、分光光度计、层析柱（2.5×30cm）
【操作方法】
一、粗多糖的提取
将香蕉皮切碎烘干后，粉碎过筛。
称取2g，采用热水浸提法，每次原料和水之比均为1：
10，浸提温度为80℃，浸提时间1.5h，共提取4次，合并4次浸提液。
浓缩一倍体积。
对多糖提取液需进行脱色处理，即以1％的比例加入活性炭，搅拌均匀15min后过滤即可。
在浓缩液中加入3倍体积的95%乙醇搅拌，置冰箱24h,沉淀为多糖和蛋白质的混合物，此为粗多糖。
它只是一种多糖的混合物，其中可能存在中性多糖、酸性多糖、单糖、低聚糖、蛋白质和无机盐，必须进一步分离纯化。
二、粗多糖的纯化
粗多糖溶液置于分液漏斗中，按照提取液体积的1/5量加入Sevag试剂（氯仿：
正丁醇＝3：
1混合摇匀），振荡20min，3000r/min的转速下，离心15min，得上清液测其体积，继续加相应体积的Sevag试剂，并重复上述操作，直至氯仿层与正丁醇层之间无乳白色变性蛋白质析出为止。
收集上清液，加足量活性炭，摇匀，恒温30min，过滤,得滤液备用。
将上述滤液倒入下端扎好的截流分子量为6000～8000的半透膜袋中，将袋的另一端用绳扎好后，悬挂在盛有水的烧杯里，将烧杯放在磁力搅拌器上，开动搅拌，蒸馏水透析48h，期间每2h更换一次水，经常更换清水使透析膜内溶液的浓度差加大，并加以搅拌，加快透析速度，除去无机盐、单糖、双糖等小分子杂质。
加3倍体积95%乙醇醇沉。
沉淀放入冰箱干燥，获得白色固体粉末，即得精制香蕉皮多糖。
三、多糖的测定（苯酚-硫酸法）
1 .样品溶液的制备
精密称取适量样品，用蒸馏水溶解，定容至50ml，即为待测样液。
2 .标准曲线的制备
精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品1g，置于100ml容量瓶中，溶解并稀释至刻度，配成10mg/ml的标准贮备液，吸上述贮备液1ml定容至100ml，配成0.1mg/ml的工作液。
精密移取葡萄糖标准液0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6ml于25ml具塞刻度试管中，加蒸馏水至2.0ml，再各加5%苯酚溶液1.0ml摇匀，迅速加入浓H2SO4溶液5ml，振摇5min，放置10min，置沸水浴中加热20min，取出冷却至室温，于490nm，以试剂空白为参比测定吸光度。
3.样品测定
取2支试管各加入样品溶液2mL，按标准曲线制备方法操作，测定每只试管中反应液的吸光度值。
从标准曲线上查得相应的多糖含量。
并计算百分得率。
三．多糖条件的研究
（一）单因素实验
1.料液比的影响
准确称量一定量的香蕉皮粉五份，料液比分别为
1:
10、1:
15、1:
20、1:
25和1:
30，提取温度为75℃，提取1次，时间为2h。
按照一、二中方法操作，测出吸光度。
2.提取时间的影响
料液比为1:
20，提取温度75℃，提取1次，每次提取时间分别为0.5、1.0、1.5和2.0h。
按照一、二中方法操作，测出吸光度
3.提取温度的影响
准确称取香蕉皮粉六份，料液比为1:
20，分别在70、75、80、85、90和95℃条件下，提取1次，提取时间1.0h。
按照一、二中方法操作，测出吸光度。
4.提取次数的影响
在料液比为1:
20，提取温度为80℃条件下，分别提取1、2、3、4次，每次提取时间为1h。
按一、二中的步骤操作，测出吸光度。
（二）提取条件的优化
在单因子条件探讨的基础上，制定因素水平表：
考察四个因素（料液比、温度、提取次数、每次提取时间），每个因素取三个水平（如温度选择75℃、80℃和85℃三个水平）。
如表1。
表1因素水平表
因素A每次提取时间B温度C料液比D提取次数
水平（h）（℃）（n）
1
0.5
75
1：
102
2
1.0
80
1：
15
3
3
1.5
85
1：
20
4
利用正交试验设计，选择正交表L9（34）表研究香蕉皮多糖的最佳提取条件。
表2正交试验结果与分析
ABCD得率
试验号时间（h）温度（℃）料液比次数吸光度（%）
10.5751:
152
20.5801:
203
30.5851:
254
41.0751:
204
51.0801:
252
61.0851:
153
71.5751:
253
81.5801:
154
91.5851:
202
K1
K2
K3
极差R
最优方案
第二部分多糖的鉴定
【实验目的】
了解薄层层析法分析单糖组分的原理和方法。
【实验原理】
采用薄层层析法分析单糖组分。
薄层层析显色后，比较多糖水解所得单糖斑点的颜色和Rf值与不同单糖标样参考斑点的颜色和Rf值，确定样品多糖的单糖组分。
【实验试剂和器材】
1.试剂
硅胶、浓硫酸，氢氧化钡。
展开剂:
正丁醇：
乙酸乙酯：
异丙醇：
醋酸：
乙醇：
水：
吡啶＝7：
20：
12：
7：
6：
6。
显色剂:
1，3－二羟基萘硫酸溶液（0.2％1，3－二羟基萘乙醇溶液）：
浓硫酸＝1：
0.04（V/V）。
单糖标准品。
2.器材
烘箱、玻璃板
【实验操作】
一、单糖组分分析
1．薄层板制备：
称取硅胶5g于50ml烧杯中，加入用12mL0.3mol／L磷酸二氢钠水溶液，用玻璃棒慢慢搅拌至硅胶分散均匀，铺在玻璃板上（7．5cm×10cm），110℃活化1h。
即置有干燥剂的干燥箱中备用。
2．点样：
称取少许的多糖（0．1克）于2．0mL离心管中，加入1M的硫酸1mL，沸水浴水解2h，然后加氢氧化钡中和至中性，过滤除去硫酸钡沉淀，得多糖水解澄清液。
以此水解液和单糖标准品进行点样进行薄层层析展开。
用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边2.0cm，点样直径为2—4mm，点间距离约为1.5—2.0cm，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。
点样时必须注意勿损伤薄层表面。
3．展开：
展开室如需预先用展开剂饱和，将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5—1.0cm（切勿将样点浸入展开剂中），密封室盖，等展开至规定距离（一般为10—15cm），取出薄层板，晾干。
4．显色：
将展开凉干后的薄板再在100℃烘箱内烘烤30分钟，将显色剂均匀地喷洒在薄板上，此板在110℃下烘烤10分钟即可显色。
薄层显色后，将样品图谱与标准样图谱进行比较，参考斑点颜色、相对位置及Rf值，确定样品中有哪几种糖。
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