植物活性多糖的分离纯化与鉴定.docx

1、植物活性多糖的分离纯化与鉴定实验四、 植物活性多糖的分离、纯化与鉴定第一部分多糖的提取、纯化【实验目的】1、 了解多糖提取和纯化的一般方法。2、 学习多糖的定量测定方法。【实验原理】多糖类物质是除蛋白质和核酸之外的又一类重要的生物大分子。早在60年代，人们就发现多糖复杂的生物活性和功能。多糖是普遍存在于自然植物界中的由许多相同或不同的单糖以-或-糖苷键所组成的化合物，其分子量一般为数万甚至数百万，是构成生命活动四大基本物质之一，与维持生命功能密切相关。大部分植物多糖不溶于冷水，在热水中呈粘液状，遇乙醇能沉淀。多糖具有抗氧化性、抗病毒性、反互补特性1，大量药理及临床研究表明，多糖类化合物是一种免

2、疫调节剂，它具有明显的抗补体活性和促进淋巴细胞增殖作用，能激活免疫受体，提高机体的免疫功能，在用于癌症的辅助治疗中，具有毒副作用小、安全性高、抑瘤效果好等优点2 。本实验采用常规法（即水溶醇沉法）从植物组织中提取出水溶性粗多糖，对提取得到的多糖进行分离纯化，除去色素及小分子杂质，并采用Sevage法除蛋白。用蒽酮比色法测定多糖的含量。多糖的纯化，就是将存在于粗多糖中的杂质去除而获得单一的多糖组分。一般是先脱除非多糖组分，再对多糖组分进行分级。常用的去除多糖中蛋白质的方法有：Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法，这些方法的原理是使多糖不沉淀而使蛋白质沉淀，其中Sevag方法脱蛋白效果较好，它

3、是用氯仿：戊醇或丁醇，以4：1比例混合，加到样品中振摇，使样品中的蛋白质变性成不溶状态，用离心法除去。本实验采用Sevag法(氯仿：正丁醇4：1混合摇匀)进行脱蛋白，用DEAE -纤维素层析柱进行纯化，然后合并多糖高峰部分，浓缩后透析，冻干，得多糖组分。多糖被浓硫酸水合产生的高温迅速水解，产生单糖，并迅速脱水生成醛糖衍生物，在这种强酸条件下与苯酚反应生成橙色衍生物，该衍生物在波长490 nm 处和一定浓度范围内，吸光度与糖浓度呈线性关系，采用比色法对多糖含量进行测定。【实验试剂和器材】1.试剂活性炭、硫酸，5%苯酚溶液，葡萄糖，过氧化氢，乙酸铅，丙酮，乙醇、无水乙醇 Na2HPO412H2O

4、NaH2PO42H2O 乙醚 平衡缓冲溶液：0.01mol/L Tris-HCL, PH=7.2。洗脱液：A: 0.1mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2; B: 0.5mol NaCl, 0.01 mol Tris-HCl PH=7.2。Sevag试剂：氯仿：正丁醇3：12.材料香蕉皮粉末 市售香蕉的皮。3.器材多功能粉碎机、恒温水浴锅、DEAE-纤维素，离心机，透析袋、分光光度计、层析柱 (2.530cm)【操作方法】一、粗多糖的提取将香蕉皮切碎烘干后，粉碎过筛。称取2g，采用热水浸提法，每次原料和水之比均为1：10，浸提温度为80，浸提时间1.5h，共提取

5、4次，合并4次浸提液。浓缩一倍体积。对多糖提取液需进行脱色处理，即以1的比例加入活性炭，搅拌均匀15min后过滤即可。在浓缩液中加入3倍体积的95%乙醇搅拌，置冰箱24 h,沉淀为多糖和蛋白质的混合物，此为粗多糖。 它只是一种多糖的混合物，其中可能存在中性多糖、酸性多糖、单糖、低聚糖、蛋白质和无机盐，必须进一步分离纯化。二、粗多糖的纯化粗多糖溶液置于分液漏斗中，按照提取液体积的1/5量加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇3：1混合摇匀)，振荡20 min，3 000 r/min的转速下，离心15 min，得上清液测其体积，继续加相应体积的Sevag试剂，并重复上述操作，直至氯仿层与正丁醇层之间无乳

6、白色变性蛋白质析出为止。收集上清液，加足量活性炭，摇匀，恒温 30min，过滤,得滤液备用。将上述滤液倒入下端扎好的截流分子量为6 0008 000的半透膜袋中，将袋的另一端用绳扎好后，悬挂在盛有水的烧杯里，将烧杯放在磁力搅拌器上，开动搅拌，蒸馏水透析48 h，期间每2h更换一次水，经常更换清水使透析膜内溶液的浓度差加大，并加以搅拌，加快透析速度，除去无机盐、单糖、双糖等小分子杂质。加3倍体积95%乙醇醇沉。沉淀放入冰箱干燥，获得白色固体粉末，即得精制香蕉皮多糖。三、多糖的测定（苯酚-硫酸法）1.样品溶液的制备精密称取适量样品，用蒸馏水溶解，定容至50 ml，即为待测样液。2.标准曲线的制备精

7、密称取105干燥至恒重的葡萄糖标准品1 g，置于100 ml容量瓶中，溶解并稀释至刻度，配成10 mg/ml的标准贮备液，吸上述贮备液1 ml定容至100 ml，配成0.1 mg/ml的工作液。精密移取葡萄糖标准液0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 ml于25 ml具塞刻度试管中，加蒸馏水至2.0 ml，再各加5%苯酚溶液1.0 ml摇匀，迅速加入浓H2SO4溶液5 ml，振摇5 min，放置10 min，置沸水浴中加热20 min，取出冷却至室温，于490 nm，以试剂空白为参比测定吸光度。3.样品测定取2支试管各加入样品溶液2mL，按标准曲线制备方法

8、操作，测定每只试管中反应液的吸光度值。从标准曲线上查得相应的多糖含量。并计算百分得率。三多糖条件的研究（一）单因素实验1.料液比的影响准确称量一定量的香蕉皮粉五份，料液比分别为1:10、1:15、1:20、1:25和1:30，提取温度为75，提取1 次，时间为2h。按照一、二中方法操作，测出吸光度。2.提取时间的影响料液比为1:20，提取温度75，提取1 次，每次提取时间分别为0.5 、1.0 、1.5和2.0h。按照一、二中方法操作，测出吸光度3.提取温度的影响准确称取香蕉皮粉六份，料液比为1:20，分别在70、75、80、85、90 和95条件下，提取1 次，提取时间1.0h。按照一、二中

9、方法操作，测出吸光度。4.提取次数的影响在料液比为1:20，提取温度为80条件下，分别提取1、2 、3、4 次，每次提取时间为1h。按一、二中的步骤操作，测出吸光度。（二）提取条件的优化在单因子条件探讨的基础上，制定因素水平表：考察四个因素（料液比、温度、提取次数、每次提取时间），每个因素取三个水平（如温度选择75、80 和85 三个水平）。如表1。表1 因素水平表 因素 A每次提取时间 B温度 C料液比 D提取次数水平 (h) （） (n)10.5751：10 221.0801：15331.5851：204利用正交试验设计，选择正交表L9（34）表研究香蕉皮多糖的最佳提取条件。表2 正交试验

10、结果与分析A B C D 得率试验号 时间(h) 温度( ) 料液比 次数 吸光度 (%)1 0.5 75 1:15 2 2 0.5 80 1:20 3 3 0.5 85 1:25 4 4 1.0 75 1:20 4 5 1.0 80 1:25 2 6 1.0 85 1:15 3 7 1.5 75 1:25 3 8 1.5 80 1:15 4 9 1.5 85 1:20 2 K 1 K 2 K 3 极差R 最优方案 第二部分 多糖的鉴定【实验目的】了解薄层层析法分析单糖组分的原理和方法。【实验原理】采用薄层层析法分析单糖组分。薄层层析显色后，比较多糖水解所得单糖斑点的颜色和Rf值与不同单糖标样

11、参考斑点的颜色和Rf值，确定样品多糖的单糖组分。【实验试剂和器材】1.试剂硅胶、浓硫酸，氢氧化钡。展开剂:正丁醇：乙酸乙酯：异丙醇：醋酸：乙醇：水：吡啶7：20：12：7：6：6。显色剂:1，3二羟基萘硫酸溶液（0.21，3二羟基萘乙醇溶液）：浓硫酸1：0.04（V/V）。单糖标准品。2.器材烘箱、玻璃板 【实验操作】一、单糖组分分析1薄层板制备：称取硅胶5g于50ml烧杯中，加入用 12 mL 0.3molL 磷酸二氢钠水溶液，用玻璃棒慢慢搅拌至硅胶分散均匀，铺在玻璃板上(75cm10cm)，110活化1h。即置有干燥剂的干燥箱中备用。2点样：称取少许的多糖(01克)于20mL离心管中，加入

12、1M的硫酸1mL，沸水浴水解2h，然后加氢氧化钡中和至中性，过滤除去硫酸钡沉淀，得多糖水解澄清液。以此水解液和单糖标准品进行点样进行薄层层析展开。用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边2.0cm，点样直径为24mm，点间距离约为1.52.0cm，点间距离可视斑点扩散情况以不影响检出为宜。点样时必须注意勿损伤薄层表面。3展开：展开室如需预先用展开剂饱和，将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.51.0cm（切勿将样点浸入展开剂中），密封室盖，等展开至规定距离（一般为1015cm），取出薄层板，晾干。4显色：将展开凉干后的薄板再在100烘箱内烘烤30分钟，将显色剂均匀地喷洒在薄板上，此板在110下烘烤10分钟即可显色。薄层显色后，将样品图谱与标准样图谱进行比较，参考斑点颜色、相对位置及Rf值，确定样品中有哪几种糖。