鸭沙门氏菌的分离鉴定及其对部分抗生素的药敏实验.docx
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鸭沙门氏菌的分离鉴定及其对部分抗生素的药敏实验
本科毕业论文（设计）
题目鸭沙门氏菌的分离鉴定及对荣昌市售氨基糖苷类抗生素制剂的药敏试验
系别动物医学系
专业动物医学
年级2012级
学号2011000199
姓名杨溢欢
指导教师孙裕光
成绩
二O一六年五月一十六日
鸭沙门氏菌的分离鉴定及其对部分抗生素制剂的药敏实验
杨溢欢
西南大学荣昌校区动物医学系，重庆荣昌402460
摘要：
无菌采取四川某鸭场疑似沙门氏菌病病死鸭的心脏、肝脏和脾脏等进行病原菌的分离、鉴定、生化试验、动物实验和药敏实验。
实验结果表明：
分离到的沙门氏菌对鸭子具有致病性，对6～10日龄的雏鸭具有较高的致死率。
用兽药企业生产的在市场上销售的抗生素制剂做体外药敏实验，其结果发现壮观霉素、卡那霉素、庆大霉素具有较强的抑菌作用。
本实验的研究为临床用药提供理论依据。
关键词：
鸭；鸭沙门氏菌；分离鉴定；药敏实验
IsolationandidentificationofduckSalmonellaandantibioticpreparationsonthepartofthesusceptibilitytesting
YANGYihuan
DepartmentofVeterinaryMedicine,SouthwestUniversity，RongchangCampus,Chongqing,402460，PRChina
ABSTRACT：
AsepticallytakeaduckSichuansuspectedsalmonellosisdeadduckheart,liverandspleenandotherpathogenswereisolatedandidentified,biochemicaltests,animalexperimentsandsensitivitytest.Theresultsshowthat:
theisolatedSalmonellapathogenicforducks,for6to10-day-oldducklingshaveahighfatalityrate.Producedbyveterinaryantibioticpreparationsonthemarkettodotheinvitrosusceptibilitytesting,itwasfoundthatRadixinjection,sodiumselenitevitaminEinjection,ofloxacininjection,ampicillinsodiuminjection,ceftiofursodiuminjection,enrofloxacininjection,injectionlevofloxacin,amikacinsulfateinjection,ceftazidimehasstrongantimicrobialeffect.Inthisexperiment,itprovidesatheoreticalbasisforclinicalapplication.
keywords:
Duckduck;Salmonella;isolationandidentification;drugsensitivitytest
第1章导论
1.1研究背景
近年来随着养鸭规模的扩大，养鸭数量和品种的增多，饲养密度加大，国内外引种、运销和贸易的日益频繁，饲养管理技术仍比较落后与简陋，导致鸭场鸭病的频繁发生和交叉感染。
鸭沙门氏菌病（Salmonellaanatis）又叫鸭副伤寒沙门氏菌病。
因为患本病的雏鸭死前有时见身体翻转,腹部向上,所以又叫做“仰卧病”或“猝倒病”。
雏鸭很容易得这种病,尤其是出壳后几天到二周龄左右的雏鸭。
得了这种病的雏鸭精神沉郁,独处一隅,不愿走动,低头闭眼,双翅下垂,羽毛松乱;不想吃料,但饮水增加;下痢,肛门周围羽毛被稀疏。
目前养鸭场患病鸭的治疗多采用GMP兽药厂生产的抗生素制剂来治疗，而不是用标准抗生素原药粉来治疗。
所以药敏试验就用荣昌县兽药市场销售的抗生素制剂来完成，几乎不用期刊杂志上刊登的标准药敏纸片上抗生素药物，也就是不用抗生素原粉。
1.2研究意义
希望通过本试验对生产上出现的鸭病做出临床诊断和实验室诊断，给出处治方案，同时验证荣昌市售的氨基糖苷类抗生素制剂做一系列的药敏试验，以验证其抗菌效果，对在生产上指导用药提供理论根据。
1.3研究现状分析
真正的鸭沙门氏菌病是非常罕见的。
鸭沙门氏菌病一般多发生于3～12日龄的雏鸭，因为这时候的鸭抵抗力很弱。
一般情况下病鸭多表现为精神不振。
伴随有剧烈的腹泻，而且败血症和急性肠炎等疾病随之发生，致死率约为15％。
一般出现的沙门氏菌病并不会对鸭群造成较大的经济损失。
只要管理得当，可以有效减少损失，但是此种病原体常常在鸭群中反复存在，想要彻底净化不太现实，只能做好鸭舍鼠类的监杀与饮水消毒等措施，减少传播媒介。
【1】
1材料与方法
1.1材料
1.1.1病料荣昌某鸭场送检的表现为排绿色稀粪、腹围较大、精神萎靡、站立时腹部下垂、呈现企鹅状。
剖检为肝脏肿大、呈现青铜色、脾脏肿大，呈现紫黑色、心包上有一层纤维渗出物、腹腔中有淡黄色腹水等病变的鸭心脏、肝脏、脾脏和脑组织等。
1.1.2培养基营养肉汤培养基、营养琼脂培养基、麦康凯培养基和伊红美蓝培养基，均按常规方法配置。
【2】
1.1.3生化试剂硫化氢、乳糖、蔗糖、麦芽糖、甘露醇、甲基红（MR）、二乙醇（VP）、靛基质（吲哚）、枸橼酸盐、过氧化氢等。
1.1.4试验动物30只6～10日龄，体重约150克的雏鸭购买于荣昌县市场。
1.1.5药物板蓝根注射液、亚硒酸钠维生素E注射液、氧氟沙星注射液、柴胡注射液、磺胺间甲氧嘧啶注射液、氨苄西林钠注射液、头孢噻呋纳注射液、盐酸多西环素注射液、四季青注射液、氟苯尼考注射液、盐酸林可霉素注射液、恩诺沙星注射液、土霉素注射液等市场销售药物制剂。
1.2试验方法
1.2.1病原的分离培养无菌采取荣昌某鸭场送检病死鸭的心脏、肝脏、脾脏和脑组织等明显病变部位，直接触片，革兰氏染色、镜检。
在无菌操作台里接种在麦康凯琼脂平板培养基上。
1.2.2细菌的分离培养将接种了细菌的麦康凯培养基放于37℃的培养箱中培养24小时。
观察形态结构、颜色变化。
再取特征明显的菌落接种于伊红美蓝培养基上，同样在37℃的培养箱中培养24小时。
观察结果，再取菌落特征明显的菌落在普通斜面培养基上纯化培养，勾取纯化细菌在普通肉汤培养基上放于37℃的水浴恒温震荡仪中培养24小时。
另外，对菌落特征明显的菌落进行革兰氏染色【3】，再镜检。
培养好的斜面放在4℃的冰箱中保存。
1.2.3细菌的形态学观察勾取菌落特征明显的菌落做镜检观察细菌的形态学。
1.2.4生化鉴定在无菌操作台中，勾取分离纯化得到的细菌分别接种于半固体培养基、葡萄糖发酵管和三糖铁琼脂培养基中。
放于37℃的培养箱中培养。
其中，糖酵解、VP、甲基红、吲哚在37℃的培养箱中培养24～48小时即可观察结果；枸橼酸盐实验则需要再培养7d观察培养基颜色的变化。
1.2.5致病性检验将购买的30只雏鸭随机分成两组，每组15只。
一组为试验组，另外一组为对照组。
在相同的环境、相同的饲养条件下进行实验。
在试验组雏鸭的腓肠肌上注射5ml的菌液。
另外对照组都注射菌液，隔离饲养。
观察结果。
1.2.6药敏实验配置普通琼脂培养基平板，将平板均匀划为两区、打孔、用划线法将被检细菌涂布到普通培养基上，再用移液枪移取待测药物注入打好的孔中，做到满而不溢、标记、放在37℃的恒温箱中培养24小时、取出平板观察是否有抑菌圈和测量抑菌圈的大小、记录结果。
2结果分析
2.1剖检结果
肝脏肿大、呈现青铜色、脾脏肿大且有轻微出血，呈现紫黑色、心包上有一层纤维渗出物、腹腔中有淡黄色腹水等病变。
肝脏肿大，边缘钝圆，表面色泽不均匀，有的呈灰黄色，肝表面及实质中有针尖大密集的灰白色坏死点：
整个肠道黏膜充血、出血，表面可见针头大、灰白色坏死点，有的肠黏膜坏死脱落，表面形成一层糠麸样物：
部分雏鸭盲肠肿大，内有干酪样物形成栓子；胆囊肿胀、充满胆汁；有的气囊混浊不透明；肾脏色泽较淡，有尿酸盐沉积。
2.2细菌分离培养
将接种了细菌的麦康凯培养基放在37℃的恒温培养箱中培养24小时后观察菌落，在麦康凯培养基上形成了灰白色、半透明、表面光滑、湿润、边缘整齐的圆形菌落。
在伊红美蓝培养基上形成了细小、边缘整齐、突起、湿润、与培养基颜色相同的光滑型菌落。
接种在普通培养基上的则形成细小、边缘整齐、突起、湿润、无色的光滑型菌落。
【4】
2.3细菌的形态学
涂片、革兰氏染色、镜检观察。
在油镜下观察到长短不一、两端钝圆、大多呈直线型少数略弯曲的革兰氏阴性细小杆菌。
2.4生化鉴定
将分离纯化得到的细菌分别接种于半固体培养基、葡萄糖发酵管和三糖铁琼脂培养基中，在37℃的培养箱中培养24小时。
结果如表1
表1：
分离菌的生化试验结果
Table1:
Isolatedbacteriabiochemicaltestresults
尿素酶
接触酶
氧化酶
明胶液化
硫化氢
枸橼酸盐
二乙酰
甲基红
吲哚
甘露醇
麦芽糖
乳糖
蔗糖
葡萄糖
葡萄糖
生化项目
+
+
+
+
+
+
▔
▔
▔
+
▔
▔
▔
+
▔
结果
注：
“+”表示阳性，“-”表示阴性
2.5毒力测定实验
取分离纯化的细菌接种在普通肉汤培养基上在37℃的恒温水浴震荡仪上培养24小时后观察到，培养液变浑浊，底部有沉淀和锥形瓶壁上有白色菌环。
取菌液5ml注射在试验组的15只雏鸭上，采用腓肠肌注射法。
第二天观察结果，被注射了菌液的15只雏鸭全部死亡。
剖检后出现肝脏肿大、呈现青铜色、脾脏肿大且有轻微出血，呈现紫黑色、心包上有一层纤维渗出物、腹腔中有淡黄色腹水等病变。
取病变严重的组织继续在麦康凯培养基上分离培养，结果是在麦康凯上出现红色菌落、涂片、镜检观察形态类似鸭沙门氏菌。
对照组没有出现死亡的现象。
2.6药敏实验
配制普通琼脂培养基平板，将平板均匀划为两区、打孔、挑取待测菌于少量灭菌的生理盐水制成细菌浑浊液，用灭菌棉签将待测菌液混悬液均匀而致密的涂布于平板培养基上，再用移液枪移取待测药物注入打好的孔中，做到满而不溢、标记、放在37℃的恒温箱中培养24小时、取出平板观察是否有抑菌圈和测量抑菌圈的大小、记录结果，如表2
表2药敏试验结果
Table2：
TraditionalChinesemedicinedrugsusceptibilitytestresults
药物名称
抑菌圈直径（mm）
1链霉素
2卡那霉素
3庆大霉素
4新霉素
5阿米卡星
6大观霉素
7安普霉素
注：
抑菌圈大小：
＜10mm耐药10-15mm低度敏感
16-20mm中度敏感＞20mm高度敏感[16]
注：
抑菌圈直径>20mm，为极敏感；抑菌圈直径为15～20mm，为高度敏感；抑菌圈直径为10～14mm，为中度敏感；抑菌圈直径<10mm，为低度敏感；抑菌圈直径为0的为不敏感。
3讨论分析
3.1菌落形态特性、生化鉴定可以确定分离菌是鸭沙门氏菌且具有较强的致死性。
根据细菌的分离培养、细菌的形态学观察、细菌的生化鉴定表明分离得到的细菌为鸭沙门氏菌。
根据实验动物的结果表明，在注射了5ml菌液的15只雏鸭中，接种后12小时内全部死亡，说明分离得到的鸭沙门氏菌具有很强的致死率。
3.2采用兽药企业生产的抗生素制剂做药敏试验对养殖场具有应用价值。
根据体外药敏实验结果表明：
板蓝根注射液、亚硒酸钠维生素E注射液、氧氟沙星注射液、氨苄西林钠注射液、头孢噻呋纳注射液、氟苯尼考注射液、恩诺沙星注射液、盐酸左氧氟沙星注射液、硫酸阿米卡星注射液、头孢他啶对分离的致病性鸭沙门氏菌具有极其敏感的作用；柴胡注射液、盐酸林可霉素注射液、硫酸头孢喹肟、硫酸粘菌素对致病性鸭沙门氏菌具有高度敏感的作用，所以不能够仅根据商品名去判断其功效。
这对临床用药具有指导作用。
3.3鸭沙门氏菌普遍耐药的现象及其耐药机制。
根据体外药敏实验结果表明：
盐酸多西环素注射液、磺胺间甲氧嘧啶注射液、土霉素注射液对致病性鸭沙门氏菌没有抑菌作用。
禽类致病性鸭沙门氏菌对常用抗生素的耐药性已经十分严重，在测试的药物中，一些较早使用的抗生素，如黄胺间甲氧嘧啶对大部分的致病性鸭沙门氏菌已经没有了抗菌作用。
【5】鸭沙门氏菌广泛性耐药现象的原因是在临床上滥用抗生素，导致动物体对抗生素的耐受性增加、细菌对抗生素的耐药性增强，使鸭沙门氏菌产生灭火酶、发生钝化反应，使药物不能进入膜内与核糖体结合而丧失其蛋白质合成的抑制作用，从而导致耐药；革兰氏阴性菌对四环素和氨基糖苷类抗生素产生耐药性还可以是因为它产生了3种新的膜孔蛋白，阻碍了外膜亲水性通道，使药物不能进入菌体而形成耐药性【6】。
影响了养鸭业的健康发展，直接损害了养殖户的经济效益，而且由于生产上的不正确用药，给食品安全带来了潜在的隐患。
为了实现我国的养鸭大国向养鸭强国的转变，满足人们追求无害、安全、绿色鸭产品的愿望，我们要落实“防重于治，养防并重”的疾病防治原则，注重饲养环境的清洁卫生，加强生物安全措施，合理安排饲养密度。
接种自家苗。
在发病时原则最为敏感的药物治疗，注意药物的休药期。
4.结论
4.1分离鉴别出有致病性鸭沙门氏菌一株。
4.2筛选出对鸭沙门氏菌有极其敏感的抗生素制剂，在临床用药上具有指导意义。
参考文献
【1】朱宏阳，朴文英.鸭病的现状与控制[J].《当代畜禽养殖业》,2015
【2】沙莎，宋振辉.动物微生物实验教程[M].重庆：
西南师范大学出版社，2011
【3】陆承平.兽医微生物学[M].北京：
中国农业出版社，2000
【4】邓桦，卢玉葵，马春全.等.鸭的常见病诊断图谱及用药指南[M].北京：
中国农业出版社，2007
【5】金文杰.致病性鸭沙门氏菌耐药基因和毒力因子的分子流行病学及HPllrp1细胞表位作用的研究[J].扬州大学.2006
【6】陈杖榴.兽医药理学[M].北京.中国农业出版社.2002.1
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