第十二章 基因工程 分子克隆.docx
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第十二章基因工程分子克隆
第十二章基因工程
第一节概述
基因工程:
又称重组体DNA技术或基因操作，是指在体外将不同来源的DNA分子进行重新组合，并使它们在适当的宿主细胞中实现增殖表达的遗传操作。
在分子水平上进行操作，在细胞水平上实现表达。
基因工程的过程主要包括：
1获得目的基因片断；
2连入合适的载体；
3转入受体系统；
4筛选重组子；
⑤表达外源基因等五个步骤。
特点：
1.不受亲缘关系的限制，即打破了物种界限，把不同种类生物的遗传物质组合在一起，人为的将高等生物的基因引入细菌。
2.可以定向地改变生物的遗传特性：
利用基因工程技术可以有目的地去的某种基因，并将该基因引入原本没有这种基因的生物，从而改变后者的遗传特性。
3.增加目的基因剂量：
大幅度提高了基因产物的水平。
克隆DNA是指得到与目的DNA完全相同的许多DNA分子
应用：
基因工程在科学研究、医药和工农业生产等多方面都有广泛地应用，为基础研究和生产实际提供了强有力地技术支持。
第二节工具酶及基因工程相关技术
一、用于基因科隆地核酸酶
分类：
1.将DNA切开的酶，主要包括限制性内切酶；
2.将四种碱基连接起来成为高分子DNA聚合物的酶，其中主要包括DNA聚合酶、Klenow酶、反转录酶等；
3.将双链DNA片断连接起来的酶，主要包括E.coliDNA连接酶和T4连接酶等；
4.将DNA片断末端进行修饰的酶，主要包括：
末端转移酶、碱性磷酸酶、外切酶、多核苷酸激酶等。
限制性核酸内切酶：
与降解作用有关的酶称之为限制性核酸内切酶。
修饰酶：
起修饰作用的酶称作修饰酶。
在限制酶识别序列的个别碱基发生甲基化作用，所以修饰酶又称之为甲基化酶。
限制修饰系统：
甲基化酶和限制酶共同组成“限制修饰系统”
目前的限制修饰系统可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型
1.Ⅰ型它的酶含有三个亚基：
（1）HsdS－识别特定DNA序列；
（2）HsdM－具有甲基化功能；
（3）HsdR－具有限制性内切酶功能。
只有当三个亚基组成复合体后，全酶才有活性。
其甲基化及内切酶活性紧密偶联。
它对DNA的甲基化作用超过了切割作用。
2.Ⅲ型由HsdM和HsdR两个亚基组成的复合物。
3.Ⅱ型此种酶最简单，切割反应不需要任何特殊条件。
这些酶有一个HsdR亚单位和一个HsdR亚单位，二者的功能相互独立，所以限制酶单独就可以切割DNA。
一般来说，识别4bp序列的酶比识别8bp的米切割产生更小的DNA片段。
特定的酶，其识别序列是固定的，其切割DNA的次数很容易计算出来：
●识别4bp序列的内切酶，每隔44＝256bp，就应该发生一次切割。
●识别6bp序列的内切酶，每隔46＝4096bp就应该切割一次；
●识别8bp序列的内切酶，每隔48＝65536bp就会发生一次切割。
也就是说，识别序列越长，在DNA上切割位点就越少，产生限制片段也就越长。
4.限制性核酸内切酶物理图谱
II型内切酶总是在特定序列或其附近切割，依据这个原理可以获得DNA的物理图谱，从而显示碱基对之间的实际距离。
酶切后产生限制性DNA片段的大小是物理图谱的基础。
通过凝胶电泳，可以将大小不同的片段分开，依据片段迁移率，与已知片段比较，就可判定未知片段的大小。
片段的迁移距离与其大小成指数关系。
在半对数坐标纸，用迁移距离和相对分子质量大小作图，可由标准相对分子质量片段得到一条标准直线。
未知片段的大小可由其迁移率，在该直线上求得。
（1）标出限制性位点：
根据限制性片段的大小，仅可得知酶切位点之间的距离，并不能确定其具体位置。
方法是：
使用两种不同的限制酶来判断两种识别位点的相对位置。
（2）Southern印记杂交作图：
许多噬菌体和质粒的DNA很短，用6核苷酸内切酶消化后，可得到一定数目的限制性片段。
可以利用上述方法，测绘其物理图谱。
但是，细菌和真核生物的DNA要长得多，如使用6核苷酸内切酶，就会产生成千上万个片段，以致无法通过凝胶电泳分离。
可以采用Southern印记杂交的方法从大量片段中检出目的片段。
（3）将文库中的克隆排序将某物种的DNA部分消化，构建文库。
用Southern印迹法对克隆片段排序，找出重叠部分。
（4）遗传图谱核物理图谱的关系
（5）限制性片段长度多肽性：
多态性：
虽然同一物种的遗传图谱基本相同，但是不同个体的DNA序列还是有细微的差别，即具有“多态性”。
在遗传学上，多态性通常指某基因在不同物种中的表现型。
限制性片段长度多态性：
基因的不同表现型反映出DNA序列的不同。
限制性内切酶的识别位点也可能不同。
对同一物种的不同个体而言，这种差异称为“限制性片段长度多肽性”（RFLPs）。
PCR技术也能验证不同个体间DNA序列的多态性。
（6）酶切片段
（1）粘性末端：
限制酶切割后产生的两个突出末端互补，经DNA连接酶作用连接成连续的双链DNA分子，这样的末端称为粘性末端。
（2）兼容粘性末端：
如果两种限制酶切割DNA产生同样的粘末端，就两种酶就被说成是兼容的。
（3）平末端。
没有单链突出的末端。
平末端不存在兼容与否的问题，双链末端可以任意连接。
连接效率要比粘末端低2个数量级。
（4）粘末端转为平末端：
转换末端的方法有两种：
补平和削平。
●如果消化后产生5’突出，DNA聚合酶利用短链的3’－OH为引物，以单链为模板合成新链，将末端补平。
●单链特异性核酸酶，如S1核酸酶和绿豆芽核酸酶等对DNA的5’端或3’端进行消化，将突出的单链削平。
二、其它工具酶
1．连接酶：
封闭双链DNA上相邻核苷酸之间单链缺口的酶，称作连接酶。
连接酶作用的最适温度为37℃，但是碱基之间的氢键的结合能较低，在高温下易断开，将粘末端的退火速率和解离速率平衡时的温度（16℃）定为连接反应的最适温度。
平末端连接时的温度稍微偏高一些。
2．聚合酶：
1）依赖于RNA的DNA聚合酶（又称为反转录酶）：
禽成髓细胞病毒（AMV）、鼠白血病毒（Mo-MLV）反转录酶基因，两种反转录酶均无3’→5’外切酶活性。
该酶的作用是将mRNA反转录成cDNA，cDNA可以插入到原核和真核载体中，实现克隆基因的表达。
2）依赖于DNA的DNA聚合酶：
具有3种活性：
即5’→3’DNA聚合酶活性、5’→3’和3’→5’外切酶活性。
还具有RNA酶H的活性。
3．碱性磷酸酶：
催化除去DNA、RNA、rNTP和dNTP的5’-磷酸的反应；
4．末端转移酶：
是一种非寻常的DNA聚合酶，在二价阳离子存在下，催化dNTP加到DNA分子的3’-羟基，为DNA片段末端加尾提供方便
5．T4噬菌体多核苷酸激酶：
催化ATP的γ-磷酸基转移到DNA或RNA的5’末端
6．S1核酸酶：
降解单链RNA或DNA，产生5’-磷酸的单核苷酸后寡核苷酸。
第三节基因工程载体
载体：
●质粒
●噬菌体
●动植物的病毒
整合的结果是外源DNA参入到宿主的基因组中，并将作为基因组的一部分稳定遗传。
DNA片段不是复制子，为了它们能够复制，必须将其放在复制子上，这种复制子便成为目的基因的载体。
质粒是独立的复制子，噬菌体是独立的复制子，动植物病毒也是独立的复制子，它们都可以作为目的基因的载体。
一、质粒载体
质粒是细胞染色体以外的能稳定遗传的复制子，它的复制独立于染色体，但又是同步的，具有保持恒定拷贝数的机制。
能处于同一个细胞中的质粒为相容性，不能处于同一个细胞中的质粒为不相容性。
质粒的拷贝数指质粒DNA的数量相对于染色体DNA数量的倍数。
选择质粒作为基因工程载体是出于一下几点考虑；
●质粒DNA是一个独立的复制子（replicon），从而达到增殖靶基因的目的；
●质粒能赋予宿主特定的表形，可用作筛选标记；
●具有多种内切酶的单切点或者“多克隆位点”（multiplecloningsite），有利于外援片段的插入；
●质粒相对分子量小，拷贝数高。
pBR322－第一个人工构建的理想载体
以pBR322为基础又构建出一系列载体，像pBR322系列、pUC系列等。
构建这些载是基于如下的一些考虑：
1.促进蛋白质表达的载体；
2.鉴定调节信号的载体；
3.直接选择重组体的载体；
4.增加限制酶酶切位点的载体；
5.增加稳定性的载体；
6.改变拷贝数的载体；
7.为了DNA序列分析的载体；
8.分泌型载体；
9.促进蛋白质纯化的载体；
10.穿梭载体等等。
二、噬菌体载体
噬菌体是一类细菌病毒的总称。
成熟的噬菌体颗粒还包括蛋白质外壳，为重组DNA的体外包装提供了有利条件。
1.λ噬菌体
λ噬菌体的DNA具有两种状态，线状DNA具有感染性，而环状是营养体状态。
在DNA分子两端个有12nt的5’单链突出，彼此序列互补，叫做cos位点，它是包装时的切割信号。
依据λ噬菌体DNA的结构，以它为载体可以分为两类：
插入型载体和取代型载体。
插入型载体：
是指在DNA的非必需区插入外援片段，像λgt10、λgt11等属于这一类，插入型载体携带的外源DNA片段不能多于2kb
取代型载体：
是指外援片段取代了λDNA非必需区，像λWES、λB’等属于这一类。
取代型载体可携带直到20kb的外源DNA片段。
2.cosmid载体
cosmid载体是带有cos位点的质粒载体。
3.phasmid载体
含有λ噬菌体att位点（插入位点）的质粒。
第四节DNA克隆
“克隆”一词的含义是无性繁殖系，从同一受精卵分裂而来的单卵双生子属于同一克隆。
在生物学上，要克隆一个生物，就意味着从一个生物群体中的单一个体获得遗传同一性的一个生物群体。
在分子生物学中，欲克隆一个DNA分子，就意味着从单一DNA分子获得一群遗传同一性的DNA分子，像这样产生的DNA分子也成克隆。
一、基因克隆的全过程
任何DNA克隆的全过程包括五个基本过程：
1.获得目的DNA的片段；
2.将目的片段连接到载体上；
3.将人工重组的DNA引导进入受体细胞；
4.检出目的转化子；
5.将目的转换子进行表达分析。
二、克隆载体
为了复制，必需将DNA片段连接到另一个复制子上，像质粒、噬菌体DNA，这些DNA都称之为克隆载体。
三、克隆DNA进入克隆载体
第一步是将待克隆的DNA和载体DNA用兼容的限制酶分别消化（注意，使用的限制酶通常在载体上只有一个切点）；
第二步是将消化的两种DNA混合，并加入DNA连接酶，当载体的两个末端与一个外源片段的两个末端分别连接，形成重组体DNA。
四、克隆技巧将这样两类DNA片段混合以后连接，有效连接的关键是载体的两个末端与片段的两个末端的有效碰撞。
分子克隆基本策略
一、目的基因的PCR：
1．引物的设计：
首先，从Genbank中找到要克隆的基因序列，如要克隆某基因的全长序列，就要找到相应的编码碱基，如：
ATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCTGCGGACGACCCTTCTCGGGGTCGCTTGGGACTCTCTCGTCCCCTTCTCCGTCTGCCGTTCCGACCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCACCAAATATTGCCCAAGGTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTCTCAGCAATGTCAACGACCGACCTTGAGGCATACTTCAAAGACTGTTTGTTTAAAGACTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGGTCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGCGCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCGACTACAAGGACGACGACGACTTCTGA
图1粗阴影部分为基因编码序列；ATG为启始密码子；TAG为终止密码子；单下划线为上游引物互补序列；双下划线为下游引物互补序列
根据编码基因两端的碱基序列设计引物如下：
P1（forward）：
5’-CAGAATTCATGGCTGCTAGGCTGTGC-3’；
P2（reverse）：
5’-ATCTCGAGAGAAGTCGTCGTCGTCC-3’
图2HBxPCR引物序列。
ATG和为启始密码子。
阴影部分为互补序列。
蓝色部分为引入的EcoRI酶切位点，绿色部分为引入的XhoI酶切位点
2.模板的选择
●含有目的片段的质粒DNA，
●表达目的基因的组织或细胞中所提取的mRNA（cDNA），
●目的基因的PCR产物，
3.PCR反应
1）PCR反应体系：
试剂
加入量（ul）
灭菌双蒸水
36.75
10×PCRBuffer
dNTP
5
4
ForwardPrimer（25uM）
1
ReversePrimer（25uM）
1
模板pCMV-X
FinalVolume
2
50
2）PCR反应程序：
94℃5分钟；
94℃30秒，60℃30秒，72℃45秒，30个循环；
72℃10分钟，4℃∞
3）电泳检测PCR结果：
图PCR产物电泳
LineM:
DNAMarker,DL2000
Line1:
PCRwithP1andP2asprimers
Line2:
negativecontrolwithouttemplate
Line3:
negativecontrolwithoutprimers
PCR结束后，将PCR产物经回收后，需经过EcoRI和XhoI的双酶切，才可以切出粘末端片断，用于与载体的连接
4.PCR产物与载体的连接
4.1载体的选择
T载体
本实验选用pET30a载体，pET-30a是一种常用原核表达载体，载体上具有6组氨酸标签，并含有T7启动子，可以在原核系统中表达外源基因，并且可以利用HisTag加以纯化。
图4pET30-a载体图谱。
4.2载体与目的片段的连接：
将载体进行EcoRI和XhoI的双酶切并回收后，将外源片断（T载体经过酶切的目的产物）与载体连接，体系如下：
试剂
加入量（ul）
10×LigationBuffer
2
50%PEG4000
2
纯化后的载体片断
3
纯化后的外源片断
12
T4DNALigase
1
总体积
20
16℃连接过夜
5.连接产物的转化与鉴定
5.1连接产物的转化：
连接产物转入新鲜制备的DH5α感受态细胞，涂布于LB平板（含25µg/ml卡那霉素），过夜培养。
5．2重组子的筛选及鉴定
随机挑选单克隆，提质粒，如上述方法进行EcoRI和XhoI的双酶切。
6.测序
选取可切下目的片断大小（约500bp）的克隆，送至公司进行测序。
CTTCATGGCTGCTAGGCTGTGCTGCCAACTGGATCCTGCGCGGGACGTCCTTTGTTTACGTCCCGTCGGCGCTGAATCCTGCGGACGACCCTTCTCGGGGTCGCTTGGGACTCTCTCGTCCCCTTCTCCGTCTGCCGTTCCGACCGACCACGGGGCGCACCTCTCTTTACGCGGACTCCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTGCCGGACCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCCCACCAAATATTGCCCAAGGTCTTACATAAGAGGACTCTTGGACTCTCAGCAATGTCAACGACCGACCTTGAGGCATACTTCAAAGACTGTTTGTTTAAAGACTGGGAGGAGTTGGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGGTCTTTGTACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGCGCACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTCTGCCGACTACAA
Fig.17SequenceofHBxgeneclonedinpCMV-Xplasmid.
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