分子生物学重点整理.docx
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分子生物学重点整理
第一章绪论
DNA测序谁发明?
1975-1977年,Sanger.Masam.Gilbert发明了DNA序列测定技术.
1细胞学说的奠基人是谁？
德国植物学家Schleiden和德国动物学家Schwann，证明动植物都是由细胞组成。
2英国科学家Griffith证明了什么?
肺炎链球菌感染实验证明了DNA是遗传物质
3Hershy和Chase通过噬菌体侵染细菌实验证明了什么?
分别用15S和32P标记噬菌体蛋白质外壳和核酸，感染未百哦机细菌，观察子代是否有标记。
证实噬菌体DNA侵染细菌的实验流程，证明侵染过程中发挥作用的是DNA不是蛋白质（遗传物质是DNA而非蛋白质）。
41965年Jacob和Monod提出了什么重要理论?
提出并证实了操纵子作为调节细菌细胞代谢的分子机制（与Iwoff分享了诺贝尔生理医学奖），并且首次提出存在一种与染色体脱氧核糖核酸序列互补，能将编码在染色体DNA上的遗传信息带到蛋白质合成场所（细胞质）并翻译产生蛋白质的信使核糖核酸，即mRNA分子。
5Crick和Watson为什么获得了诺贝尔生理学奖?
在1953年提出DNA的反向平行双螺旋模型。
（与通过X射线衍射证实该结构的Wilkins共享诺贝尔生理医学奖。
分子生物学的分科:
功能基因学
蛋白质组学
生物信息学
DNA三种构型的异同及其主要存在方式（填空选择）
右手螺旋A－DNA和B—DNA
左手螺旋有Z－DNA
B－DNA:
DNA的水溶液丰富,A－T丰富
DNA的双链中一条被相应的RNA所取代，就会形成A－DNA。
如，在杂交分子或DNA处于转录状态时。
A-DNA和B-DNA两者的糖环的折叠方式不同.A为C3内式,B为C2内式.AB均为反式构象.不同:
A碱基对倾斜角大,深窄的大沟,宽浅的小沟,螺旋体宽而短.B型适中.Z型细长,大沟平坦,核苷酸顺反相间,螺旋骨架Z字形.B－DNA中的多聚G－C区易形成左手螺旋DNA，即Z－DNA。
其中B－DNA是最常见的DNA构象，而A－DNA和Z－DNA似乎不具有生物活性。
糖苷酸构象:
A反式B反式Z:
C.T反式G顺式
大沟:
A深窄B深宽Z平坦
小沟:
A浅宽B深窄Z深窄
每圈碱基数:
A11B10.4Z12
轴心与碱基对:
A不穿过碱基对B穿过碱基对Z不穿过碱基对
动态变化:
1.B向A转.增加盐浓度（Nacl）可使B型转向A型.当DNA为钠盐时,存在ABC,为锂盐时,存在BC.
2.Z中必须有G,且嘌呤与胞嘧啶减交替排列.
3.B向Z转.DNA的甲基化,使大沟表面暴露的C形成5-甲基胞嘧啶,即可导致B转向Z.
4.B向A转.B型在环境水的活度降低（加水,加入乙醇或盐）时,转向A型.
5.B向Z转.在阳离子较多的环境中,交替的GC区段一般处于B型,而在C被甲基化之后转Z型,甲基化导致B型的亲水区转成Z型的疏水区.
6.B向Z转.某些Z型DNA结合蛋白能作为一种特异识别信号,使B转Z.
DNA模型常见:
双螺旋模型三股螺旋（三链结构）四链结构（了解）—结构单元为鸟嘌呤四联体
双螺旋模型特征
DNA的二级结构：
是指两条多核苷酸链反向平行盘绕所形成的双螺旋结构。
基本特点：
（1）是由两条反向平行的脱氧核苷酸链盘绕所形成的；
（2）DNA分子中的脱氧核糖与磷酸交替连接并排列在外侧，构成基本骨架，碱基排列在内侧；
（3）两条链上的碱基之间通过氢键结合形成碱基对，它们之间的规律是嘌呤与嘌呤配对；嘧啶与嘧啶配对。
当双链核酸的一条链为全嘌呤核苷酸链,另一条链为全嘧啶核苷酸链时,DNA分子能转化为三链结构.
第三股链可以来自分子间或者分子内.
（1）分子内的DNA三螺旋结构通常是在一条自身回折的寡嘧啶核苷酸与寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟内结合了第三股寡核苷酸链.
第三股链的碱基与原双螺旋Watson-Crick碱基对中的嘌呤碱形成Hoogsteen配对.即T·A*T
T·A*AC·G*GC·G*G+（C质子化）
且第三股链与寡嘌呤核苷酸之间为同向平行.
（2）分子内的DNA三螺旋结构在一定条件下,DNA一条单链能插入另一条DNA双螺旋结构大沟的特定区域,通过氢键形成局部的分子间DNA三螺旋结构.
（3）平行的DNA三螺旋结构指三螺旋结构中的第三条链的序列与第一条链的序列相同,方向也相同.这种结构因为与基因的重组相关,故称R-DNA.
?
同向平行反向平行结构式P15
反向重复序列:
当同一个核酸分子中的一段碱基序列附近紧接着一段它的互补序列时,核酸链有可能自身回折配对产生反平行的双螺旋结构,称发夹.
反向重复序列又称回文序列,指在双链DNA序列中按确定的方向5’—3’阅读双链中每条单链的序列都相同的DNA结构.
在双链DNA中,如果两条互补链分开,每条链上的互补序列都有机会发生碱基配对而形成一个发夹结构（对单链而言）.两个相对的发夹结构形成了一个十字架形结构（对双链而言）.
凡有回文结构的DNA分子,由于同一条链内有互补序列,因此单链DNA或RNA形成发夹结构,双链DNA形成十字架结构.
核小体构成真核生物染色质的基本结构单位,先由四种蛋白H2AH2BH3H4构成八聚体,作为核小体的核心颗粒,再由DNA缠绕在颗粒表面形成核小体.
△RNA的结构与功能
•核酸组成：
A、G、U、C
•单链线型分子，自身形成二级或三级结构。
除tRNA外，几乎都与蛋白质结合。
•根据功能分类：
（1）携带遗传信息分子；
（2）功能分子；
细胞内的RNA分子种类繁多，各个层次的结构不尽相同。
重要功能：
1）参与蛋白质合成；m/t/rRNA
2）具有生物催化剂的功能,参与RNA剪接加工，核酶RNA；
3）参与基因的表达调控；microRNA，snRNA等；
4）与生物体的进化有关；rRNA。
5）逆转录合成DNA
RNA复合物功能:
核糖体，信息体,信号识别颗粒，剪接体，编辑体等。
△RNA结构特点及与DNA的区别
•1）碱基组成不同；RNA分子中有许多稀有碱基；
•2）RNA分子中的戊糖是D－核糖，而DNA不是；
•3）RNA分子中的碱基不严格遵守Chargaff法则；
•4）RNA分子是多聚核苷酸单链；
•5）RNA分子在碱性溶液中敏感，易水解；
•6）RNA分子内只有部分双链区域；
•7）RNA分子是遗传信息的传递体；
•8）某些RNA病毒，是以RNA分子作为遗传信息的载体；
•9）核酶RNA分子具有催化功能；
•10）有些小分子RNA具有基因表达调控功能；
成熟的RNA主要分布在细胞质中.
三大类:
转运RNA—rRNA信使RNA—mRNA核蛋白体RNA—rRNA
细胞核内的RNA--nRNA①核内mRNAtRNA和rRNA的初始转录混合物（hnRNA45SRNA）
②核内小分子RNA—snRNA
·snRNA主要参与hnRNA以及rRNA前体的加工
·mRNAtRNArRNA各自的前体是其基因的初始转录产物.如mRNA的前体是蛋白质编码基因的初始转录产物,统称核不均一RNA—hnRNA
·scRNA是细胞质中的一类RNA;tmRNA是一类普遍存在于各种细菌及细胞器（线粒体叶绿体等）中长度为260-430bp的稳定小分子RNA,兼有tRNA和mRNA的双重功能.
RNA在细胞中特性与功能
mRNA（5%）在蛋白质合成中起关键作用,作为蛋白质合成的模板.真核细胞mRNA是单顺反子,原核多顺..
tRNA（15%）主要功能是在蛋白质生物合成中特异性地运载氨基酸.
rRNA（80%）在蛋白质生物合成以及mRNA前体的剪接中发挥重要作用.
snRNA主要参与基因初始转录产物加工.
sonRNA
microRNA
非编码mRNA
修饰碱基最多?
tRNA
哪种参与蛋白质合成?
哪种结构最复杂?
rRNA（p27）
哪种携带遗传信息?
氨基酸?
tRNA
哪种参与RNA剪接编辑?
rRNA
△核酸的变性,复性与分子杂交（之间的关系?
）
变性:
双链DNA中配对碱基的氢键不断处于断裂和再生的状态中,特别是稳定性较低富含A-T的区段,氢键的断裂再生更明显.凡事破坏双螺旋结构的作用力（氢键碱基堆积力）的因素都可使DNA双螺旋解链,导致DNA变性.
引起DNA变性的主要因素：
1加温；
②极端的pH值；
pH=12,碱基的酮式变烯醇式
pH=2-3,碱基上的氨基发生质子化
主要影响氢键的形成。
③有机溶剂、尿素、酰胺等；
它们与DNA分子的碱基形成氢键。
使DNA保持单链状态。
复性:
两条彼此分开的变性DNA链在适当条件下重新缔合成为双螺旋结构的过程称为复性.
条件:
①一定的离子强度用以削弱两条链中的磷酸基团之间的排斥力
②较高的温度用以避免随机形成的无规则氢键,但不能太高,否则不能形成有效的氢键.
影响复性速度的因素:
①简单分子真核生物DNA的复杂度很高,在同样条件下寻找到互补链时间较久.复性慢.
2同一种DNA分子浓度越高,互补链碰撞机会越大,复性越快.
3DNA片段大小.较大的线状单链分子,由于扩散受妨碍,减少了发现互补链的机会.一般剪成400bp
4温度的影响不宜过低,一般在Tm-25°
5阳离子浓度阳离子的存在能降低表面带负电荷DNA链之间的排斥力.0.18mol/L
复性实验的标准条件下,复性速度K2约等于5*10五次方[L/（mol·s）]
Tm指:
使DNA双螺旋结构解开一半的链时的温度.
分子杂交
双螺旋结构的各种性质在DNA复性后可得到恢复.利用这一特性可将两个不同来源的互补序列退火形成双链,这个过程为分子杂交.
1溶液杂交:
将不同来源的DNA变性后,在溶液中进行杂交称溶液杂交
2滤膜杂交:
用硝酸纤维素制成的滤膜,可以吸附单链DNA或RNA,将变性DNA或RNA吸附到滤膜上再进行分子杂交,为滤膜杂交.
第四章DNA的复制
n半保留复制DNA在复制过程中碱基之间的氢键断裂，双螺旋解旋并以分开每条单链DNA分子为模板，产生互补的两条链，新合成出两条与亲代DNA分子完全相同，每个子代DNA分子中的一条链来自亲代DNA，另一条链则是新合成的，这种复制方式称为半保留复制。
半不连续复制DNA复制时，因为复制的方向必须是从5’到3’，一条链可以连续复制，而它的反义链复制则是不连续的，会产生冈崎片断，所以称为半不连续复制。
复制子是指基因组DNA中能够独立复制的单位，含有DNA复制的起始区和终止区的一个DNA复制单位。
复制起点的结构特征
复制时，双链DNA要解开成两股链分别进行，所以，这个复制起点呈现叉子的形式，被称为复制叉。
对一个生物体基因组而言，复制起点是固定的，表现为固定的序列，并识别参与复制起始的特殊蛋白质。
（E.coli复制起始的最小功能片段长245bp,包含4个9bp的反向重复序列和3个13bp正向重复序列,称为OriC）
·在oriC区域内含有一系列对称排列的反向重复序列，即回文结构,它富含AT。
与复制酶系统的识别有关。
·在oriC区域内含有两个转录启动子区，这暗示转录可能在DNA复制时起着重要的作用。
1.oriC包含4个9bp反向重复序列TTATTCACA，和3个富含AT的13bp重复序列GATCTNTTNTTTT。
4个9bp反向重复序列是起始蛋白DnaA的结合位点；DnaA的合成与大肠杆菌的生长率相偶联，所以，复制的起始也与大肠杆菌的生长率相偶联。
2.30-40DnaA分子形成复合分子后，使DNA链弯曲，DnaB结合使之解链。
3.oriC也包含有11个GATC.A被甲基化，则复制起点被活化，复制才能开始。
复制叉复制开始时，在复制起点处形成的一个特殊的叉形结构，是复制有关的酶和蛋白质组装成的复合体和DNA新链合成的部位，这个部位称为复制叉。
复制的方式（p80）Ө型复制滚环式复制D-环式复制
DNA复制的酶系
RNA聚合酶引发酶解旋酶解链酶DNA聚合酶链接酶…
DNA聚合酶能催化脱氧核糖核苷三磷酸合成DNA.反应特点:
①以4种dNTP作为底物②反应需模板指导③新链的延伸需引物3’-OH存在④链延伸方向5’-3’⑤产物DNA的极性与模板相对.
DNA聚合酶1有哪些活性?
聚合酶活性3’-5’外切核酸酶活性5’-3’外切核酸酶活性,不是DNA复制的主要聚合酶.切除引物、修复
DNA聚合酶II，为多亚基酶,活性比聚合酶I高,无5’-3’外切核酸酶活性,是E.coli主要的修复酶.
DNA聚合酶III全酶（10种亚基），亚基酶,,无5’-3’外切核酸酶活性,是E.coli主要的复制酶.由αεθ构成核心酶,γ复合体由γ,δ,δ’,χ,ψ五种6个亚基组成，主要作用是“夹子”装置器
DNA连接酶只能催化多核苷酸链的延长反应,不能使链间头尾链接.
E.coliDNAPolymeraseI,II,III性质的比较
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
3’5’外切
＋
＋
＋
5’3’外切
＋
－
－
新生链合成
－
－
＋
生物学活性
1
0.05
15
已知结构基因
polA
polB
polC
1、都需要模板指导，以dNTP作为底物，且需要3’－OH的引物链，聚合反应方向为5’3’。
2、都有3’5’外切活性，起核对作用。
3、Ⅰ有Ⅱ、Ⅲ无5’3’外切活性。
4、Ⅰ为单一多肽链，Ⅱ、Ⅲ为亚基酶。
4.2细菌DNA复制的机制
4.2.1大肠杆菌复制的起始
引发体:
参与引物合成的蛋白质复合体称为引发体,主要指DnaG和DnaB这两种蛋白.
参与细菌DNA复制的几个蛋白功能:
DnaA蛋白是起始因子1、与负超螺旋DNA结合在OriC处，形成复合物
2、促使OriC中的3个富含AT的13bp重复序列解链，需要ATP和Hu蛋白的促进作用；
3、引导DnaB-DnaC进入局部解链区。
DnaB的功能有两个1.是解链酶；促进DNA双链的解链；
2.促进DnaG蛋白的结合，活化DnaG，促使其在后随链上合成RNA引物。
DnaC促进DnaB－DnaC复合体的形成，起一个分子伴侣的作用，帮助DnaB进入复制起始位点的作用。
DnaG蛋白是引起发酶作用的DNA结合蛋白.
回环模型（要点?
作用?
解释啥的?
）
•在复制叉处同一个DNA聚合酶III负责协同复制前导链和后随链的合成；
•DNA聚合酶III全酶是一个二聚体；回环模型能够解释在连续复制和不连续复制的延伸过程中，前导链和后随链之间的复制关系以及DNA聚合酶的移动和后随链复制的方向的灰机性.
•当两条链同时复制时，后随链经过复制叉的部位就形成一个回环，以适应双链同时向前进行这种复制模型称为回环模型。
真核生物DNA聚合酶与原核的对应关系
真核细胞的核染色体复制由α和δ共同完成.α相当于III中的滑行钳.
ε相当于I,是修复酶
β也是修复酶
γ线粒体DNA合成酶
4.3.2真核染色体端粒的复制
△端粒酶复制机理:
端粒酶是由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白（RNP）复合体,具有逆转录酶活性,能够利用自身的RNA为模板,以反转录的方式,催化与其互补的DNA链的合成.与细胞的衰老和肿瘤有关.
机制:
1）端粒酶的RNA的3’端AAC与DNA的3’端TTG反向互补结合；
2）端粒酶发挥反转录酶的活性，以其RNA为模板合成DNA；
3）当G足够长时，引发酶合成RNA引物；
4）DNA聚合酶用DNA为模板以RNA3’端为引物合成DNA。
5）切除引物在富含G的端粒链上又合成12-16碱基片段。
端粒酶的功能
1.真核生物通过端粒酶形成端粒（Telomere）结构防止染色体末端缩短；
2.端粒酶活性与早老症与肿瘤有关；
第七章RNA转录概述
RNA转录的一般特点:
1）转录具有选择性；
2）RNA链的转录起始和终止于DNA上特定的部位；
3）催化反转录的酶是依赖DNA的RNA聚合酶；
4）被转录的DNA双链中有一条参与转录；
5）转录的起始由DNA分子上的启动子控制；
6）合成RNA的底物是ATP,GTP,CTP和UTP；
7）新合成的RNA是以5’→3’方向延伸。
n单顺反子大多数真核生物的mRNA为单顺反子结构,每种mRNA分子只编码一个蛋白质分子的亚基或只编码由单肽链构成的蛋白质分子.
多顺反子原核生物转录产物为多顺反子.一个mRNA分子含有集中蛋白质的信息,可以编码几种蛋白质.
启动子是RNA聚合酶识别,结合和启动转录的一段DNA序列.
模板链用于转录的链称为模板链或负链,又称反义链.
编码链用于转录的链为模板链,对应的链为非模板链,即正链,又称有义链.因为非模板链与合成的RNA产物链从一个方向阅读时序列完全相同,所以有义链又称编码链.
转录方向一定要清楚RNA聚合酶合成RNA方向5’-3’而RNA聚合酶本身是沿着DNA的模板链（反义）3’-5-滑动新合成的RNA链总是以5’-3’方向延伸,底物5’-NTP总是加到新生的3’-OH.RNA5’-3’的合成反向与模板DNA方向反平行.
原核与真核基因转录的差异
1）只有一种RNA聚合酶参与原核基因的转录，真核生物有3种以上的RNA聚合酶负责不同类型的基因转录。
2）转录产物差别很大，原核生物初始转录产物大多数都是编码序列,而真核生物的初始转录产物有内含子序列,成熟的mRNA只占初始转录产物的一小部分。
3）真核的转录产物需要经过剪接，加工成熟，而原核转录产物几乎不需要加工。
4）原核转录产物为多顺反子，大多数真核生物的mRNA是单顺反子；
5）在原核生物细胞中，转录产物可以直接作为蛋白质合成的模板，转录mRNA与蛋白质的翻译相互偶联。
真核生物细胞的转录是在细胞核进行的成熟后通过核孔进入细胞质在此翻译出蛋白质。
△P139启动子结构原核核心启动子
启动子上游部位（UP元件）
真核
核心启动子:
RNApol能直接识别并结合的启动子
启动子上游部位:
在RNApol结合时需要辅因子协助,这类启动子除了有RNApol结合位点外,还有位于核心启动子上游的辅助子结合位点,称启动子上游部位.
在原核基因中启动子不被转录,核心启动子和启动子上游部位（UP原件）两者共同构成原核启动子
细菌启动子的结构:
转录起始点-10序列-35序列在-10序列与-35序列之间较严格的距离
-10区序列（DNA解旋的重要部位）
•–10区是在–10位左右的6bp的核苷酸序列，被称为；-10区或（Pribnowbox）或TATABox;
•共同的保守序列是TATAAT;
•在大肠杆菌中的其他启动子中，头两个碱基（TA）和最后一个T是高度保守的；
•这个6个核苷酸的保守序列被6～9（5～8）bp从转录起始位点+1的地方所分开，这个距离对基因的转录水平是非常重要的；
-35区序列（识别区域,sigma因子识别的重要部位）
•在–35位左右处存在一个6bp的保守序列，称为–35区或SextamaBox；
•共同的保守序列是TTGACA
•在大肠杆菌中的其他启动子中，头三个碱基（TTG）是高度保守的；
•在所有的启动子中，有约90%是被15～20（16-19）bp从–10区分隔开来；间距为17bp转录效率最高
•该区有主要是与RNA聚合酶σfactor相互作用，增强识别DNA和相互作用；
-35~-10核心启动子（corepromoter）
RNApol.结合位点
-60~-40启动子上游元件（upelement）
CAP–cAMP结合位点
CAP：
环化AMP受体蛋白CAP：
降解物激活蛋白
-35区突变，影响RNA聚合酶与启动子的结合速度，但不影响转录起点处的解链。
-10区突变，不影响RNA聚合酶与启动子的结合速度，但影响双链的解链速度。
大肠杆菌RNA聚合酶这是一个DNA模板指导的RNA聚合酶。
主要组成成分:
RNA聚合酶核心酶亚基或因子
大肠杆菌RNA聚合酶:
α亚基
1.在核心酶中两个a亚基是相同的；
2.a亚基是由rpoA基因编码；
3.对于RNA聚合酶核心蛋白的组装是必需的；
4.在启动子识别上可能起着重要的作用；
大肠杆菌RNA聚合酶:
β亚基
1.β亚基由rpoB基因编码；
2.RNA聚合酶的催化中心；
Rifampicin（利福平）：
与β亚基结合可以抑制转录的起始，rpoB基因突变导致对利福平的抗性；
Streptolydigins（利迪链菌素）：
抗性突变也定位于rpoB基因，它抑制转录延伸，但不抑制起始；
3.β亚基可能含有两个结构域负责转录的起始和延伸；
大肠杆菌RNA聚合酶:
β’亚基
1.b亚基由rpoC基因编码；
2.与两个Zn2+离子结合参与RNA聚合酶的催化功能；
•Heparin（肝素）：
在体外与β’亚基结合并抑制转录；
•Heparin与DNA竞争结合RNA聚合酶；
3.β’亚基可能是负责与DNA模板的结合；
大肠杆菌RNA聚合酶:
σ亚基（起始亚基）
1.在启动子的识别上σ因子至关重要，对于非特异性DNA位点核心酶的亲和力会降低（104），而对于相应的启动子亲和力会增加；
2.当起始后（RNAchainis8-9nt），σ因子会从RNA聚合酶中释放出来；
3.在细胞中σ因子的需要量比RNA聚合酶其他亚基的需要量少；
核心酶加σ因子变全酶
α亚基的功能：
α亚基是在C端结构域的参与下才与启动子的UP区结合，使相互作用加强，进行高水平转录。
P145
核心酶β和β´亚基的功能：
共同构成RNAPol的催化亚基。
β´亚基结合DNA模板；β亚基催化3’-5’磷酸二酯键的合成。
核心酶的结构：
嗜热水生菌核心聚合酶像一只半张的“蟹钳”一侧由β亚基组成，另一侧由β´亚基组成，两个α亚基位于节点，ω亚基位于底部，覆盖β´亚基C端。
两个“蟹钳”中间有27Å的通道，DNA模板位于其中。
RNA聚合酶全酶的结构.σ亚基与核心酶的β和β´亚基之间有较大的接触面。
终止子两类:
①非依赖rho因子（ρ因子）终止子，无需特异的蛋白质就能终止转录，又叫强终止子、内原性终止子
2依赖rho因子的终止子，需要在rho因子存在时才发挥终止作用。
①非依赖rho因子的终止子
②依赖rho因子的终止子
7.4真核生物RNA聚合酶3类
△7.5真核生物转录的启动子p159
1.类型I基因的启动子
RNAPolI识别的启动子：
控制rRNA前体基因的转录，转录产物经过加工后成为各种成熟的rRNA。
增强子元件：
是在DNA上可以增强一些真核基因启动子利用效率的一个顺式作用序列,他能以不同的方向、和相对启动子来说不同的位置起作用。
类型I和III基因转录因子p169
第八章RNA转录后的剪接与加工
选择性剪接：
指真核生物的mRNA在不同的分化细胞，不同的发育阶段甚至是不同的生理状态下，由于剪接
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