分光光度计使用注意事项剖析.docx

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分光光度计使用注意事项剖析

分光光度计的使用

一．使用及维护

1.安装环境

1.1温度要求：

装在不受阳光直接曝晒的房间；最好装空调，使室温维持在（20±2℃）；仪器附近不应有高温的暖气管或其它电热器具；仪器后面板与墙之间应留一定空间。

1.2湿度要求：

水蒸气在（1350～1450）nm和（1800～1950）nm两个波长区域内有光吸收，会严重干扰测定。

潮湿会导致分光器反射膜层斑剥、脱落等。

故相对湿度最好保持在（40～75）％。

高档紫外－可见－近红外分光光度计要用高纯氮气冲洗。

干燥筒内的变色硅胶应及时更换。

1.3防震、防尘、防腐和防电磁干扰：

2.光源灯

2.1拿灯时不要碰窗口，以免手上的油污经紫外照射后，形成结痕难以去掉.倘若不小心而碰触，应及时用无水乙醇抹擦干净。

2.2灯有寿命，要节约使用.但工作间歇时间短，不要关灯和停机.

2.3在灯虽然能点亮，但不稳定或强度大大减弱而影响测量时，就应更换新灯.

2.4应待灯冷却后，再重新启动.启动后预热15-30min才能读数.

2.5不要用眼睛直视灯，因为紫外辐射会损伤人的眼睛。

3.单色器

3.1单色器是仪器的心脏部分.不要轻易装、拆，也不要去摸触镜面.

3.2平时要保持内部干燥，及时更换干燥剂，以防止色散元件和反射镜受潮而发霉，测定挥发样品必须使用密封吸收池，以免样品蒸气进入单色器，腐蚀反射镜、透镜及色散元件的镜面.

3.3如果选定波长和狭缝宽度是用旋钮，则要按说明书规定的方向转动到欲测的位置，切勿来回转动，以防回衡误差.

4.样品室

4.1样品室是存放吸收池的地方，防止样品的交叉污染，决不可将样品留在样品室中过夜.

4.2吸收池的光学面一定要维护好，不能用刷子刷.否则光学面发毛会增加散射而影响测定准确度.保护吸收池最重要的一条是使用后及时清洗，否则留下液痕，日后再洗，事倍功半.用完的吸收池可放在中性肥皂水中（将十二烷基硫酸钠用蒸馏水配制成透明的稀溶液），或放在8mol／l盐酸加45％乙醇的等量混合液中浸泡，然后用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净，放在无灰尘的地方凉干备用.如果急于使用，可在真空中抽干.但不要用热吹风吹干。

4.3对于盛过蛋白质和核酸的样品池最好不要用市售的烷基磺化型的清洗剂，因为它们有类似蛋白质的吸收光谱，清洗不慎会引入误差，所以此时最好使用非离子型清洗剂（如triton）浸泡.如果吸收池实在太脏，质量好的吸收池可放在洗液中稍加处理，但要随即取出冲洗，不宜浸泡过长的时间。

洗液必须冲洗干净，因为它也有类似蛋白质和核酸的吸收光谱。

4.4为了精确的定量测定，吸收池应事先进行校正.校正的办法是在池中加入欲测浓度的溶液，读出各吸收池的吸光度.以一个池为标准读出其他各池的吸光度.然后在读取样品吸光度后，再予校正.市售常规光径（10mm）的吸收池一般匹配到0.Olmm.为了某种工作的需要（如差示光谱测定）必须寻找匹配池时，可在池中装入高吸收的样品，读数后加以挑选。

一台仪器上的比色皿不得与其它仪器上的比色皿单个调换。

比色皿每次用完后应立即用蒸馏水洗净，用软布或擦镜纸擦干，放于比色皿盒内。

5.倾注溶液时要小心，不要弄湿外壁.如不慎弄湿，可用滤纸轻轻吸干后，再用绸布或擦镜纸擦净（最好用白绸，擦镜纸常有纸毛）。

6.检测器：

检测器室要保持干燥，以保证绝缘良好.在使用光电倍增管时，最重要的一点是通电后避免不必要的曝光。

在仪器的光电倍增管的前面（通常在样品室的上方）常有暗闸（微动开关），这是光电倍增管的保护装置，用来保护其在开启样品室盖时，不受日光照射.否则通电后的光电倍增管，受强光照射，会造成永久性的损坏，或至少因“疲劳"而降低灵敏度。

7.硫化铅光电池忌受紫外线照射，否则会降低其灵敏度。

8.仪器用完后应用罩布盖好，以防落入灰尘。

9.仪器应每半年左右或搬动后应检查波长精度等，以确保仪器性能正常。

二．分光光度计的性能检查

1．波长范围

指分光光度计上限波长和下限波长之间的工作范围，在这个范围内的所有波长应具有足够的能量进行工作.这种检测波长极限是与光源、单色器及检测器的光谱响应特性有关的.如波长范围为190-900nm的紫外-可见分光光度计必须具备氘灯和碘钨灯两个光源，而只有碘钨灯的分光光度计的工作范围，在短波侧不能低于340nm.有时在说明书规定的工作波长范围的两端由于缺乏足够的能量，不能正常工作.如在两端表现为100％T或A设定困难，或基线在两端不平直等，就需要检查可能发生的原因，如光源位置需要调整、光源需要更换、样品室窗口有溶液污染、光路需要调试、检测器疲劳等等。

2．波长准确度

波长准确度（有时被误称为波长精度）是指仪器波长指示器上所指示的波长值与仪器给出的实际波长值之间的符合程度，可用二者之差（即波长误差）来衡量其准确性.如某分光光度计的波长准确度为±1.Onm，那么测定253.65nm汞灯辉线的最大能量应落在252.65nm和254.65nm之间.

波长准确度对分光光度测定是有很大影响的，因为任何分光光度定量分析工作都是依靠在一定波长下测量吸光度值（此波长大都选在样品的吸收峰位）来完成的.如波长有误差，则由于峰两旁陡坡处吸光度值随波长的变化极为迅速，会造成明显的吸光度误差.如在定性分析时单纯依靠样品的吸收峰来确定波长，可能会造成错误的判断.在有机物质的结构分析中，需要研究吸收峰波长位置与物质结构的关系.如仪器的波长误差较大，显然会影响结构分析的正确性.波长准确度对于窄带分析是非常重要的，但对于宽吸收带则影响不大.常用的检查方法如下：

2．1.用氘灯（或氢灯）的辉线检查

氘灯（或氢灯）为紫外-可见分光光度计必备的光源，因此用它来标定波长最为方便.氘灯虽然在紫外区发射连续光谐，但在可见区有一条辉线，656.1nm（氢灯有两条：

656.3nm和486.1nm）.

待仪器和氘灯稳定后，选择合适的测定条件：

单光束、纵坐标用能量表示、狭缝尽可能小、响应尽可能快、扫描速度慢、图纸速度快.在上述波长附近扫描，或按说明书规定的波长旋转方向慢慢旋转波长钮，读出结果显示最大能量的波长.如果超出允许波长误差，就需进行校正.

2.2用汞灯的辉线检查

上述用氘灯检查波长只能在少数波长点进行，但对仪器作精密的波长校正，应在整个波长范围的不同区域进行.在紫外-可见区，理想的波长校正基准工具是低压汞灯.

低压汞灯发射不连续光谐（线光谐）.在紫外-可见区有很多辉线可供仪器波长校正.方法与用氘灯检查相同.

作为紫外-可见分光光度计任选附件的汞笔灯是进行波长准确度检查的最合适的工具.汞笔灯体积小，携带方便，便于在分光光度计中安放.

2．3用标准玻璃滤光片检查

对于低档分光光度计（谱带半宽度在10nm左右）只需用标准玻璃滤光片来检查.如钕滤光片，它的最大吸收峰在585nm.只要把滤光片放在样品室中，按操作程序扫描吸收光谱即可.

如果用氧化钬滤光片来检查，则效果会更好.氧化钬滤光片最大吸收波长241.5nm、360.8nm、536.4nm.

2.4用样品溶液的吸收光谱检查

-些样品的吸收光谐，如氯化钬溶液（最大吸收波长为241.1nm、333.4nm、361.5nm）、硫酸钴、硫酸铜、铬酸钾、重铬酸钾溶液都可用作波长校正的参比.但用样品溶液校正不及用光源的谱线校正精确.

仪器引起波长误差的原因大致如下：

工作环境温度变化太大、单色器受震后引起色散元件移位、波长扫描系统机械零件磨损、仪器积尘太多使转动受阻、光谱记录纸受潮伸缩变形等.

3.波长重复性

波长重复性是定性分析的重要因素，由于波长位置不能准确重复，就不能准确判定吸收峰的位置，甚至引起判断错误.

用一个已知样品吸收峰或灯的辉线作标准，在相同条件下多次重复读取峰位.计算每次观察的波长对平均值的偏差，这些偏差的平均值就是此分光光度计的波长重复性.

引起波长重复性下降的原因与引起波长误差的原因相似，当然电子系统工作不稳定也是原因之-。

4.谱带半宽度

谱带半宽度又称有效带宽，这里是指离开单色器的出射狭缝的辐射光谱的峰高的一半处的谱带宽度.光源辉线或锐的吸收光谱都可用于分光光度计谱带半宽度的检查.

谱带半宽度这个性能指标直接影响样品测量的准确度.使用2nm谱带半宽度的检测效果显然要比20nm好得多.如使用微量池，必须使用谱带半宽度小的分光光度计，否则从出射狭缝来的光斑会超过样品池的宽度，而给测定带来误差.

分光光度计谱带半宽度不符合性能指标常常是由于单色器中狭缝系统或狭缝伺服系统的故障，应请专业人员协助修理。

5.杂散光

杂散光是指由检测器接收到的任何由仪器单色器分离的光谱范围以外的辐射.

杂散光可以分成两种形式，一种是杂散光波长与测定波长相同.它是由于测定波长因种种原因偏离正常光路，在不通过样品的情况下，直接射到检测器上.引起这种杂散光的原因是由于光学、机械零件（包括吸收池或样品本身）的反射和散射所引起的.这种杂散光可以通过一个不透明的样品来检查.当发现放在样品池中的不透明样品的透光度不为零时，说明仪器中有上述杂散光存在.但必须注意不要与光度刻尺的零位误差混淆.

第二种杂散光是指测定波长以外的偏离正常光路到达检测器的光线，通常由光学系统中的缺陷所引起，如不必要的反射面、光束孔径不匹配、灰尘的散射、光学元件表面被擦伤、不均匀色散等都会降低光线的单色性，使杂散光增加.仪器光学系统设计不良、零件加工不良、位置错移等也是造成杂散光的原因.通常指的是第二种杂散光.

杂散光的影响使测量结果偏离比尔定律.当杂散光被样品吸收时，偏离是正的，即观察值大于真实值.当杂散光不被吸收时，偏离是负的、观察值小于真实值.杂散光对吸光度的影响是在吸光度愈大时愈明显.如1％的杂散光强度可以使吸光度从1.000降到O.9629，但可使吸光度从3降到1.963.

由于杂散光强度在边缘波段比较大，因此在波长小于220nm进行光谱扫描时，必须小心有无“假吸收峰"出现.原来样品随波长变短而吸收增大，可是由于杂散光在短波时急剧增大，因而使原来逐渐增大的吸光度反而变小，就会出现不应有的“假吸收峰".

当被测定的波长的能量降低时，杂散光比例就相应增加.对仪器输出的边缘波长来说，单色器的透光度、光源强度和检测器的灵敏度都是比较低的，这时杂散光影响就更为明显.所以在紫外-可见分光光度计中应该先检查200-220nm、340nm处的杂散光.

简便的杂散光测试方法是测定在规定波长下几乎完全不透明的溶液或滤光片的透光度.选择一种材料，它对于边缘波长的光能是完全吸收的，而对中间波长的透光度却相当高.测定这种材料在边缘波长的透光度，直接就反映了杂散光的强度.这种材料称为长、短波截止材料.截止材料的截止性能应尽可能尖锐，溶液截止的尖锐程度比固体好.

在测定杂散光时，注意不要把试样室的漏光与仪器的杂散光相混淆.由于漏光而引起的杂光将会随着狭缝宽度的增加而迅速下降.而仪器本身的杂散光并不会因为狭缝的开闭而产生明显的变化.

6.分辨率

分辨率是指仪器对于紧密相邻的峰可分辨的最小波长间隔，是衡量分光光度计性能的重要指标之一.单色器输出的单色光的光谱纯度、强度及检测器的光谱灵敏度等是影响仪器分辨率的主要因素.

分辨率的实际测试方法有许多种，这些方法的原理都是观察可分辨的最小波长间隔，在不同波长范围使用的材料及方法皆不同.造成分辨率下降的原因可能有如下-些。

测定条件选择不当（狭缝宽度太宽、记录速度太快、响应速度太慢等）、光学系统失调（光源、反射镜、检测器移位）、电子系统故障等等.发现仪器分辨率下降应仔细检查，进行调整.如调整单色器，一定要请专业人员，千万不可随意乱动.

7.光度准确度

光度准确度是指仪器在吸收峰值上读出的透光度（或吸光度）与已知真实透光度之间的偏差.该偏差越小，说明光度准确度越好.