木薯渣水解液中木糖和葡萄糖的含量测定方法.docx

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木薯渣水解液中木糖和葡萄糖的含量测定方法

普通本科毕业设计（论文）说明书

课题名称木薯渣水解液中木糖和葡萄糖的含量测定方法

的研究—HPLC-ELSD法

摘要

建立高效液相色谱—蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD）测定木薯渣水解液中木糖、葡萄糖含量的方法。

木薯渣水解液经预处理后，用NH2柱（4.6mm×250mm，5μm）分离，以乙腈-水体系（80/20,V/V）为流动相，使用蒸发光散射检测器进行检测。

测定木糖、葡萄糖含量的线性范围分别为0.100~1.70mg/mL、0.100~2.00mg/mL，在此范围内木糖、葡萄糖的含量与峰面积都有很好的线性关系。

用该方法测得样品中木糖、葡萄糖含量的RSD值分别为0.983%~4.67%、1.94%~4.47%；木糖、葡萄糖的加标回收率分别为94.1%~107%、92.2%~108%。

建立了测定木薯渣水解液中木糖、葡萄糖含量的高效液相色谱—蒸发光散射检测法。

该方法具有准确度高、可靠、重现性好且操作过程简单等优点，为木薯渣水解液中糖含量的测定提供了一种准确、灵敏、快速的分析方法。

关键词：

高效液相色谱；蒸发光散射检测器；木薯渣水解液；木糖；葡萄糖；含量测定

Abstract

Amethodwasdevelopedtodeterminethecontentofxyloseandglucoseincassavadregshydrolysatebythehighperformanceliquidchromatography（HPLC）-evaporativelight-scatteringassay（ELSD）.Afterpretreatment,thecassavahydrolyzedwasseparatedbyNH2column（4.6mm×250mm,5microns）andacetonitrilewatersystem（80/20,V/V）asmobilephase,evaporativelight-scatteringasdetector.Withinthescopeof0.100~1.70mg/mL,0.100~2.00mg/mL,therearegoodlinearrelationshipbetweenthecontentandthepeakareaofXyloseandglucose.Bythemethod,theRSDare0.983%~4.67%（Xylose）and1.94%~4.47%（glucose）,therecoveryrateare94.1~107%（Xylose）and92.2~108%（glucose）. TheHPLC-ELSDtodeterminethecontentofxyloseandglucoseincassavadregshydrolysatewasestablished.Thismethodhavetheadvantagesofhighaccuracy,reliable,reproducibilityandsimpleoperationprocess.Anaccurate,sensitiveandquickanalysismethodwasprovidedtodeterminethesugarcontentinthecassavaresiduehydrolysate.

Keyword:

highperformanceliquidchromatography;evaporativelightscatteringdetector;

cassavadregshydrolysate;xylose;glucose;sucrose.

目录

摘要I

AbstractII

1前言1

1.1木薯渣、木糖、葡萄糖的概况1

1.1.1木薯渣的概况1

1.1.2木糖的概况1

1.1.3葡萄糖的概况2

1.2糖含量的测定方法2

1.2.1高效液相色谱法2

1.2.2MBTH法2

1.2.3高效毛细管电泳法3

1.2.4离子交换色谱法3

1.2.5旋光法3

1.3蒸发光散射检测器简介4

1.3.1ELSD的工作原理4

1.3.2ELSD的主要结构5

1.3.3影响检测因素5

1.3.4发展趋势6

1.4高效液相色谱法简介6

1.4.1HPLC工作原理6

1.4.2HPLC的应用范围6

1.4.3定性分析方法7

1.4.4定量分析方法7

1.5方法的验证9

1.5.1方法的精密度9

1.5.2方法的准确度9

1.6课题的来源、研究意义与研究内容10

1.6.1课题的来源10

1.6.2研究意义10

1.6.3研究内容10

2实验部分12

2.1实验材料12

2.1.1实验仪器与试剂12

2.1.1.1实验仪器12

2.1.1.2实验试剂12

2.1.1.3实验原料13

2.2溶液的配制13

2.2.1标准品溶液的配制13

2.2.2供试品溶液的制备13

2.3实验方法13

2.3.1高效液相色谱条件13

2.3.2定性分析方法14

2.3.2.1木糖、葡萄糖标准品HPLC色谱峰的确定14

2.3.2.2木薯渣水解液中木糖、葡萄糖HPLC色谱峰的确定14

2.3.3定量分析方法14

2.3.3.1线性范围的确定与标准工作曲线的绘制14

2.3.3.2木薯渣水解液中木糖、葡萄糖含量的测定14

2.3.4HPLC测木糖、葡萄糖含量的方法的验证14

2.3.4.1精密度实验（重复性实验）14

2.3.4.2准确度实验（加标回收率实验）15

3结果与讨论16

3.1液相色谱分离木糖和葡萄糖分析条件的确定16

3.1.1流动相流速及配比的选择16

3.1.2柱温的选择18

3.1.3ELSD漂移管温度的选择18

3.1.4ELSD载气流速的选择19

3.2样品的预处理19

3.3水解液的分析20

3.4方法的线性关系及检测范围20

3.5方法的精密度与准确度实验23

3.5.1精密度实验23

3.5.2准确度实验23

3.6水解液的测定24

结论28

展望29

致谢29

参考文献30

1前言

1.1木薯渣、木糖、葡萄糖的概况

1.1.1木薯渣的概况

木薯是热带地区大范围种植的块茎类作物，被广泛种植于我国海南、广西、广东、福建、云南、江西和台湾等省区，已经成为了我国第六大热带非粮食农作物，年产量约达到1000万吨，其中，木薯种植面积最广和产量最高的是广西省，约占全国年产量的1/2以上。

木薯块根是工业上主要的生产淀粉和乙醇原料之一，其副产物为木薯渣。

木薯内部的薄壁组织和外部褐色的皮主要组成木薯渣，约占到木薯块茎总质量的11%~15%。

随着乙醇和淀粉需求量的增加，越来越多的木薯渣没有得到及时的利用而被丢弃。

木薯渣中所含的废水会破坏植被和土壤，引发传染病，而且木薯渣在腐烂的过程中会产生有毒气体[1]，污染大气，危害人类及动物的健康。

木薯渣含有大量的粗纤维及少量蛋白质和淀粉，以及多种微量元素等，可以用作饲料资源进行开发和利用。

但由于木薯渣中含有氰苷类等有毒物质，而且木薯渣中粗纤维较高，适口性较差，使其在动物日粮中的应用受到了限制[2]。

木薯渣中的粗纤维中含有大量的半纤维素、木质素和纤维素，半纤维素和纤维素可以水解为低聚糖和单糖，包括木糖、葡萄糖、阿拉伯糖等，从而用来发酵生产燃料乙醇。

1.1.2木糖的概况

木糖，分子式：

C5H10O5，分子量为150.13。

其是一种五碳糖，白色结晶体，熔点为145℃~150℃，甜度是蔗糖的40%，极易溶于水，也易溶于毗吮、热乙醇，但不溶于乙醚。

旋光为右旋性[a]D20=+18.2°~+19.4°，有很强的变旋光性。

由于人体内没有存在消化木糖的相关酶系，所以直接无法利用木糖。

其分子结构如图1-1：

图1-1木糖的分子结构

木糖是木聚糖的一个组分，木糖主要是各种植物半纤维素的水解，全球每年可生产几十万吨木糖。

在动物肝素和糖蛋白等中也发现木糖的存在，其连接某些糖蛋白中的糖链与苏氨酸（或丝氨酸）。

在自然界至今暂还没有发现木糖以游离状态存在的研究[3]。

根据木糖的性质发现其有如下用途[4]：

木糖可以通过加氢进行还原反应生产木糖醇，其有更多的用途；木糖还可以用作无热量甜味剂，其基本可以代替葡萄糖，适用于糖尿病及肥胖患者；且还可用作高档酱油色，木糖与氨基酸混合可作为一些逼真的天然肉料香料；在化学化工、轻工业等方面木糖也有一定的用途，由于其相比一些还原性糖的抗氧化性是比较好的，可以用作抗氧化剂。

1.1.3葡萄糖的概况

葡萄糖，化学式C6H12O6，均属D构型，是最广泛分布于自然界中且最重要的一种单糖。

葡萄糖为白色晶体，有甜味、吸湿性。

由于葡萄糖的水溶液旋光向右，所以也称其为“右旋糖”。

在生物学中，葡萄糖占有很高的位置，是生命活动过程中不开缺少一种物质的，因为它是活细胞活动的主要能量的来源之一，在人体内容易被吸收用来作为人体活动的主要能量供给者。

在工业上，以其制造维生素C，并已大量投产[5]。

1.2糖含量的测定方法

糖含量的测定方法主要有高效液相色谱法[6-7]、MBTH法[8]、高效毛细管电泳法[9-10]、离子交换色谱法[12-13]、旋光法[14-15]等方法。

这里对这些方法进行些简单地介绍。

1.2.1高效液相色谱法

色谱法[6-7]最早是在二十世纪初由俄国植物学家茨维特（Tswett）发现，他当时在华沙自然科学学会发表了关于应用吸附原理分离色素的一种新方法，并第一个认识到这种层析现象的在分离、分析方面有巨大的使用价值，色谱法由此而得名。

色谱法作为一种分离方法，它是利用物质在流动相和固定相之间的中分配系数或吸附的微小差异达到分离的目的。

当流动相和固定相发生相对运动的时候，被检测的物质在流动相和固定相之间连续并多次进行洗脱与吸附，这样使本来很微小的差异被逐渐放大，以达到分离、分析以及测定待测物含量的目的。

高效液相色谱法（HPLC）具有很高的灵敏度，很强的选择性，分析结果准确。

现在其被广泛应用到肽类化合物、内酯类化合物、大分子物、药品、表面活性剂、还原剂、灭虫剂、除莠剂的分析等物质的分析，是分析学科、环境化学和生物化学研究者必不可少的分析工具。

样品经过简单的处理后,用NH2柱进行分离,可以快速地测定样品中的糖,具有方法简便、灵敏度高、结果可靠、测定速度快等优点。

1.2.2MBTH法

MBTH[8]是3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物，它测糖含量的基本思路为：

MBTH先与还原糖反应生成嗪，然后再与嗪反应生成青蓝色的化合物（其中过量的MBTH被Fe3+氧化成阳离子），还原糖的含量和反应液的颜色深浅在一定范围内为正相关的关系。

首先配制3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐水合物即MBTH，并与样品标准液混合后，用紫外分光光度计测出吸光度（在最大吸收波长的条件下）并绘制标准工作曲线；然后按照上述方法测出待测样品的吸光度，用标准曲线方程算出待测样品的浓度。

MBTH法具有检测成本较低、操作过程简单、灵敏度高、结果准确性高等特点，这几年已被