牛FMDV受体整合素β6亚基LBD的多克隆抗体制备及初步应用.docx

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牛FMDV受体整合素β6亚基LBD的多克隆抗体制备及初步应用

牛FMDV受体整合素B6亚基LBD的多

克隆抗体制备及初步应用

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【摘要】目的：

利用大肠杆菌表达牛FMDV受体整合素B6亚基的配体结合域（LBD）片段，纯化重组目的蛋白后制备兔多克隆抗体并对其进行初步应用。

方法：

以含有牛整合素B6亚基全长cDNA的质粒为模板PCR扩增得到B6LBD基因片段，与原核表达载体pGEX4T]1相连，构建原核表达质粒pGEX/$LBD,测序确认开放阅读框正确后，转化感受态细胞BL21（DE3）,以IPTG诱导表达重组牛B6LBD融合蛋白。

SDS]PAGE和Westernblot鉴定后提取包涵体，电泳分离纯化重组融合蛋白，免疫新西兰白兔制备多克隆抗体，以ELISA、琼脂扩散实验、免疫组化鉴定该抗体的效价和特异性。

结果：

重组牛B6LBD融合蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达，重组蛋白主要以包涵体形式表达，相对分子质量（Mr）约为45000。

制备的兔多克隆抗体效价达112800以上，该抗体可与牛舌上皮细胞中的抗原分子结合，具有很好的特异性。

结论：

实现了牛FMDV受体整合素B6亚基LBD的原核表达和抗体制备，为研究受体B6亚基在牛体内的分布及其在FMDV感染过程中的作用机制提供了工具。

【关键词】牛FMDV受体（36LBD多克隆抗体免疫组化

口蹄疫是由口蹄疫病毒（footandmouthdiseasevirus,FMDV）引起偶蹄动物（牛、猪、羊、骆驼等）共患的一种急性、热性、

接触性传染病，世界动物卫生组织（OIE）和中国政府分别将该病列为A类和一类动物传染病之首。

FMDV属小RNA病毒科口蹄疫病毒属。

完整的病毒由衣壳包裹一个分子的RNA组成，衣壳由4种结构

蛋白VP1、VP2、VP3和VP4组成的60个不对称原粒构成，其中VP1、VP2和VP3位于衣壳表面，而VP4则完全位于衣壳里面。

由VP1140〜160位的氨基酸形成的GH环突出于表面，GH环含有高度保守的RGD基序。

整合素（integrin）分子可与含有RGD基序的蛋白配体结合，这是整合素成为FMDV受体的分子基础［1］。

病毒受体是病毒宿主范围和组织嗜性的一个决定因素［2］。

目前已发现至少有a/傑、a/込a坯a/p6四种整合素是FMDV的受体［3,4］,且ap6是主要的功能受体［5］。

p6是异源二聚体av$的一个亚基，单独存在时并不能介导FMDV感染。

（36亚基胞外域中的168个氨基酸参与构成了配体结合域（ligand［Bindingdomain丄BD）［6］。

FMDV具有严格的宿主范围，自然条件下其感染对象是猪、牛、羊及其他家

养和野生偶蹄动物［7］。

FMDV受体的发现均是以人源整合素基因进行受体重建实验的。

已有实验表明，与人源整合素相比较，FMDV能更加有效地利用牛源整合素［6］,本研究组继制备了兔抗牛avLBD多克隆抗体后［8］,其试验实现了牛36LBD的高效表达并制备了兔多克

隆抗体

1材料和方法

1.1材料含有牛FMDV受体B6亚基基因的重组质粒pGEM]B6由本研究组构建（该基因在GenBank中的登录号为DQ867017）;限制性内切酶、T4DNA连接酶、IPTG、TaqDNA聚合酶、核酸marker、DNA片段纯化试剂盒均购自宝生物（大连）工程公司；低分子量蛋白marker购自中国科学院上海细胞生化所；大肠杆菌菌株DH5a（克隆宿主）、BL21（DE3）（表达宿主）、原核表达载体pGEX4节1、FMDV实验感染牛舌组织均由本室保存；溶菌酶、弗氏佐剂均为Sigma公司产品；硝酸纤维素（NC）膜、透析袋为Pharmacia公司产品；HRP标记的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG、DAB显色试剂盒、GST单克隆抗体（mAb）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。

健康新西兰大白兔（3月龄,雄性，体质量约2.5kg）由兰州兽医研究所实验动物场提供。

1.2方法

1.2.1引物设计参考Duque等[8]的文献报道设计引物，上游引物P1为5（GTGGGATCCCCTCAAAGCTTGGCTCTTAA]3;下游弓I物P2为5[CGACTCGAGGTCCGCGTCACTCACAAAGA[3:

P1和P2引物的5'端分别引入了酶切位点BamHI禾XhoI这对引物用于扩增牛B6LBD片段，预期大小为504bp。

1.2.2重组质粒的构建以重组质粒pGEMJ$为模板,P1和P2为扩增引物进行PCR反应。

扩增得到的片段经BamH/XhoI双酶切后与同样酶切处理的pGEX4T[1载体连接，转化大肠杆菌DH5a,随机挑取单个菌落小剂量制备质粒，PCR、酶切鉴定重组质粒，将初步确定为阳性的重组质粒pGEX/（36LBD委托宝生物（大连）工程公司测序。

123重组蛋白的诱导表达将测序正确的重组质粒pGEX/（36LBD转化大肠杆菌BL21（DE3）,挑取单菌落接入10mLLB/Ampr培养基中，37C振摇培养过夜，次日按1100将菌液接入LB/Ampr培养液，37C振摇培养2〜4h至A600值达到0.3〜0.5时，力加IPTG至终浓度1mmol/L,继续培养4〜6h后进行SDS]PAGE分析目的蛋白的诱导表达情况。

同时进行Westernblot,将表达的蛋白经

SDSjPAGE并膜转移后，用50g/L脱脂奶粉封闭1h,一抗为GSTmAb,二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG,依次加入DAB和H2O2显色。

1.2.4可溶性分析和纯化取单个克隆阳性表达菌接入200mLLB/Ampr培养液中，按上述方法诱导表达，离心收集沉淀。

加细菌裂解液，于冰浴上进行超声破碎，超声时间10s,间隔时间10s,功率400W,超声次数40次，4°C15000r/min离心20min,分别取上清和沉淀用于SDS_PAGE分析。

沉淀加适量1X上样缓冲液，重悬后沸水煮5min后上样，电泳结束后用预冷的0.1mol/LKCl浸泡胶至显示出乳白色的蛋白条带，在相应位置切下目的条带放入透析袋内，将透析袋置于水平电泳洗脱装置内，60V洗脱7h,然后反转电极向相反方向洗脱3〜5min。

取出透析带内凝胶,PEG]20000包埋浓缩透析袋内液体至一定体积，取样进行SDS]PAGE电泳，鉴定重组蛋白的纯度和浓度。

125多克隆抗体的制备以纯化的牛B6LBD融合蛋白免疫雄性新西兰大白兔。

免疫前取耳静脉血分离血清，作为免疫前血清对照。

初次免疫用500⑷重组蛋白，与等体积的完全弗氏佐剂充分混匀后于背部皮下多点注射。

4周后第1次加强免疫用250⑷重组蛋白，与等体积的不完全弗氏佐剂混匀后于背部皮下多点注射。

之后隔2周加强免疫1次，并于2次加强免疫后第10天经心脏大量采血，按常规方法分离制备血清。

以重组蛋白包被96孔板，间接

ELISA方法测定抗血清效价。

1.2.6多克隆抗体的免疫组化染色从-20C取出FMDV实验感染牛舌组织冰冻切片，复温后置于4C预冷的丙酮固定10min,PBS漂洗3次后，滴加H2O2[甲醇，室温孵育10min,滴加1200稀释的兔抗牛B6LBD融合蛋白多克隆抗体，4C孵育过夜。

PBS洗片后加入1100稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG,37C孵育1h,PBS洗片后进行DAB显色，苏木素复染，返蓝后中性树脂封片，显微镜下观察并拍照记录结果。

2结果

2.1重组原核表达质粒的构建以pGEM_伶为模板PCR扩增出了牛B6亚基LBD504bp的片段，编码168个氨基酸。

将该片段克隆至pGEX4TJ原核表达载体，PCR、酶切结果显示目的片段与预

期大小一致，测序结果显示重组质粒pGEX/（36LBD含有正确的开放阅读框。

2.2重组融合蛋白的诱导表达和纯化将重组质粒pGEX/（3

6LBD转化大肠杆菌BL21（DE3）,以IPTG诱导表达重组36LBD蛋白。

SDS]PAGE分析表明，重组菌经IPTG诱导后在45000处可看到一条特异的蛋白条带，与预期表达的目的蛋白大小一致，未经

IPTG诱导的阴性对照在此位置未见该条带。

Westernblot分析显示,

GSTmAb与表达菌体中的重组融合蛋白形成了特异的抗原抗体反应带。

细菌沉淀经超声裂解获得其包涵体，表明重组融合蛋白以包涵体形式存在于菌体中。

包涵体经sdSpage后切胶电泳洗脱纯化，获得了高纯度的重组融合蛋白（图1）。

图1表达产物的SDS[PAGE和Westerblot检测（略）

1:

未诱导对照；2-4:

分别为IPTG诱导3h,4h,5h表达产物;M:

蛋白marker;5:

纯化的目的蛋白；6:

目的蛋白Westerblot分析.

2.3多克隆抗体的鉴定以牛36LBD融合蛋白3次免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。

以2mg/L的重组蛋白包板，间接ELISA法测定兔抗血清效价在1：

2800左右。

牛舌组织免疫组化实验表明，牛整合素36亚基仅分布于舌上皮细胞，尤其在棘细胞层表达量较大，在固有层与肌层无分布（图2）,这与Monaghan等[5]报道的牛av36分布于舌上皮组织的结论相一致。

图2牛P6LBD多克隆抗体免疫组化结果（略）

A:

阴性血清对照（疋00）;B:

抗牛36LBD多克隆抗体免疫组化

染色（疋00）;C:

抗牛36LBD多克隆抗体免疫组化染色（M00）.

3讨论

整合素广泛分布于生物体的组织细胞中，具有广泛的生物学活性，在细胞的生长、移行、增殖和分化等许多方面发挥重要作用。

许多病毒能利用整合素分子作为病毒受体或共受体（co］receptor）进入宿主细胞。

整合素是一类由a和B亚基以非共价键结合形成的膜蛋白家族，该家族包括由18种不同的a亚基和8种B亚基形成的24种aB复合物。

在这些复合物中，as、avp3>av俗、a比、av戏、0（5B1、0（8s、abS38种整合素能够识别精氨酸［甘氨酸］天冬氨酸（ArgGlyAsp,RGD）序列而与其配体相互作用［9］,已发现前4种是FMDV的受体，后4种尤其是avp5和a5S已被许多实验证实并非FMDV受体［10］。

整合素的a和S链的氨基末端形成的球形部分为细胞外配体结合域，该结合域在细胞信号转导过程中扮演重要角色，但是,整合素作为FMDV的受体在病毒感染细胞过程中引发何种信号转导途径目前尚无证据。

Jackson等［4］发现正常情况下不感染FMDV的人SW480细胞在转染了人整合素S6cDNA后，即变得对FMDV易感，且这种介导作用可被抗avp6的mAb所抑制，从而证实了av俗是FMDV的受体。

^6亚基仅形成一种异二聚体即avS5,人的子宫、膀胱、呼吸道和唾液腺等不同部位的上皮细胞都发现有av$表达。

牛在感染FMDV后，刘36在病毒靶器官的上皮细胞表面持续性表达，却检测

不到av（33的表达，这表明av（36可能在FMDV感染的初始阶段起重要作用[5]。

最新研究表明，a$整合素不仅对FMDV吸附起作用，而且在病毒的脱壳、复制等过程中也发挥着重要作用[10]。

我们在克隆到FMDV受体牛36亚基基因的基础上，选择以其配体结合域为研究切入点，实现了该结合域的高效表达并制备了兔多克隆抗体。

本研究中选用的表达载体为pGEX4T]1,在该载体多克隆位点的NH2[末端带有Mr为26000的谷胱甘肽转移酶（GST）标签，该标签有助于小Mr蛋白的高效表达。

对于一种蛋白质说来，抗体是研究其功能最有力的工具之一。

目前，市面上没有商品化的抗牛36蛋白的抗体可以利用，这限制了人们对牛36蛋白作为FMDV受体的相关研究。

我们制备的兔抗牛36LBD蛋白多克隆抗体将有助于深入研究牛36亚基在

FMDV感染宿主细胞过程中的作用。

另外，FMDV具有明显的组织嗜性，动物发病时多见舌面、唇部、蹄部等的病变，导致这种表型的

致病机理至今鲜有报道，兔抗牛36LBD的多克隆抗体将为研究

FMDV受体整合素36亚基的组织分布及其病毒致病机制提供依据。

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