牛FMDV受体整合素β6亚基LBD的多克隆抗体制备及初步应用.docx

1、牛FMDV受体整合素6亚基LBD的多克隆抗体制备及初步应用牛FMDV受体整合素B 6亚基LBD的多克隆抗体制备及初步应用（作者： 单位： 邮编： ）【摘要】 目的：利用大肠杆菌表达牛FMDV受体整合素B 6亚基的配体结合域（LBD）片段，纯化重组目的蛋白后制备兔多克隆 抗体并对其进行初步应用。方法：以含有牛整合素B 6亚基全长cDNA 的质粒为模板 PCR扩增得到B 6LBD基因片段，与原核表达载体 pGEX 4T1相连，构建原核表达质粒pGEX/ $LBD,测序确认开放 阅读框正确后，转化感受态细胞BL21（DE3）,以IPTG诱导表达重组 牛B6LBD融合蛋白。SDSPAGE和Wester

2、n blot鉴定后提取包涵体， 电泳分离纯化重组融合蛋白，免疫新西兰白兔制备多克隆抗体，以 ELISA、琼脂扩散实验、 免疫组化鉴定该抗体的效价和特异性。结 果：重组牛B6LBD融合蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达 ，重组蛋 白主要以包涵体形式表达，相对分子质量（Mr）约为45000。制备的 兔多克隆抗体效价达1 12800以上，该抗体可与牛舌上皮细胞中的 抗原分子结合，具有很好的特异性。结论：实现了牛FMDV受体整合 素B6亚基LBD的原核表达和抗体制备，为研究受体B 6亚基在牛体内 的分布及其在FMDV感染过程中的作用机制提供了工具。【关键词】牛FMDV受体(36LBD多克隆抗体免疫组化口蹄

3、疫是由口蹄疫病毒(foot a ndmouth disease virus, FMDV ) 引起偶蹄动物(牛、 猪、羊、骆驼等)共患的一种急性、 热性、接触性传染病，世界动物卫生组织(OIE)和中国政府分别将该病列 为A类和一类动物传染病之首。FMDV属小RNA病毒科口蹄疫病毒 属。完整的病毒由衣壳包裹一个分子的 RNA组成，衣壳由4种结构蛋白VP1、VP2、VP3和VP4组成的60个不对称原粒构成，其中 VP1、VP2和VP3位于衣壳表面，而VP4则完全位于衣壳里面。由 VP1 140160位的氨基酸形成的G H环突出于表面，GH环含有高 度保守的RGD基序。整合素(integrin )分子

4、可与含有RGD基序的 蛋白配体结合，这是整合素成为FMDV受体的分子基础1。病毒受 体是病毒宿主范围和组织嗜性的一个决定因素2。目前已发现至少有 a/傑、a/込 a坯 a/p6四种整合素是FMDV的受体3, 4,且 a p6是主要的功能受体5。p6是异源二聚体a v $的一个亚基，单独 存在时并不能介导FMDV感染。(36亚基胞外域中的168个氨基酸参 与构成了配体结合域(ligand Binding domain丄BD ) 6。FMDV 具 有严格的宿主范围，自然条件下其感染对象是猪、 牛、羊及其他家养和野生偶蹄动物7。FMDV受体的发现均是以人源整合素基因进 行受体重建实验的。已有实验表明

5、，与人源整合素相比较，FMDV能 更加有效地利用牛源整合素6,本研究组继制备了兔抗牛a vLBD多 克隆抗体后8,其试验实现了牛3 6LBD的高效表达并制备了兔多克隆抗体1材料和方法1.1材料 含有牛FMDV受体B6亚基基因的重组质粒pGEM B 6由本研究组构建（该基因在 GenBank中的登录号为DQ867017 ）; 限制性内切酶、 T4 DNA连接酶、IPTG、Taq DNA聚合酶、 核 酸marker、DNA片段纯化试剂盒均购自宝生物（大连）工程公司；低 分子量蛋白marker购自中国科学院上海细胞生化所；大肠杆菌菌株 DH5a（克隆宿主）、BL21 （ DE3）（表达宿主）、原核表

6、达载体pGEX 4节1、FMDV实验感染牛舌组织均由本室保存；溶菌酶、弗氏佐剂 均为Sigma公司产品；硝酸纤维素（NC）膜、透析袋为Pharmacia 公司产品；HRP标记的山羊抗小鼠IgG和山羊抗兔IgG、DAB显色 试剂盒、GST单克隆抗体（mAb）购自北京中杉金桥生物技术有限 公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。健康新西兰大白兔（3月龄, 雄性，体质量约2.5 kg ）由兰州兽医研究所实验动物场提供。1.2方法1.2.1引物设计 参考Duque等8的文献报道设计引物，上游 引物 P1 为 5（GTGGGATCCCCTCAAAGCTTGGCTCTTAA 3 ;下游 弓 I物 P2 为 5

7、 CGACTCGAGGTCCGCGTCACTCACAAAGA 3 : P1 和P2引物的5 端分别引入了酶切位点BamH I禾Xho I这对引物用于 扩增牛B6 LBD片段，预期大小为504 bp。1.2.2重组质粒的构建 以重组质粒pGEM J $为模板,P1和P2 为扩增引物进行PCR反应。扩增得到的片段经BamH /Xho I双酶切 后与同样酶切处理的pGEX 4T1载体连接，转化大肠杆菌DH5 a,随 机挑取单个菌落小剂量制备质粒，PCR、酶切鉴定重组质粒，将初步 确定为阳性的重组质粒pGEX/ (36LBD委托宝生物(大连)工程公司 测序。123重组蛋白的诱导表达 将测序正确的重组质

8、粒 pGEX/ (3 6LBD转化大肠杆菌BL21(DE3),挑取单菌落接入10 mLLB/Ampr培 养基中，37C振摇培养过夜，次日按1 100将菌液接入LB/Ampr培 养液，37 C振摇培养24 h至A600值达到0.30.5时，力加 IPTG至 终浓度1 mmol/L,继续培养46 h后进行SDSPAGE分析目的蛋 白的诱导表达情况。同时进行 Western blot,将表达的蛋白经SDSjPAGE并膜转移后，用50 g/L脱脂奶粉封闭1 h, 一抗为GST mAb,二抗为HRP标记的山羊抗小鼠IgG,依次加入DAB和H2O2 显色。1.2.4可溶性分析和纯化 取单个克隆阳性表达菌接

9、入 200 mLLB/Ampr培养液中，按上述方法诱导表达，离心收集沉淀。加细菌 裂解液，于冰浴上进行超声破碎，超声时间10 s,间隔时间10 s,功 率400 W,超声次数40次，4 C 15000 r/min离心20 min,分别取上 清和沉淀用于SDS_PAGE分析。沉淀加适量1 X上样缓冲液，重悬后 沸水煮5 min后上样，电泳结束后用预冷的0.1 mol/L KCl浸泡胶至 显示出乳白色的蛋白条带，在相应位置切下目的条带放入透析袋内 ， 将透析袋置于水平电泳洗脱装置内，60V洗脱7 h,然后反转电极向 相反方向洗脱35 min。取出透析带内凝胶,PEG20000包埋浓缩 透析袋内液体

10、至一定体积，取样进行SDSPAGE电泳，鉴定重组蛋 白的纯度和浓度。125多克隆抗体的制备以纯化的牛B 6LBD融合蛋 白免疫雄性新西兰大白兔。免疫前取耳静脉血分离血清 ，作为免疫前 血清对照。初次免疫用500重组蛋白，与等体积的完全弗氏佐剂 充分混匀后于背部皮下多点注射。4周后第1次加强免疫用250 重组蛋白，与等体积的不完全弗氏佐剂混匀后于背部皮下多点注射。 之后隔2周加强免疫1次，并于2次加强免疫后第10天经心脏大量 采血，按常规方法分离制备血清。以重组蛋白包被 96孔板，间接ELISA方法测定抗血清效价。1.2.6多克隆抗体的免疫组化染色从-20 C取出FMDV实验感 染牛舌组织冰冻切

11、片，复温后置于4 C预冷的丙酮固定10 min, PBS 漂洗3次后，滴加H2O2 甲醇，室温孵育10 min,滴加1 200稀释 的兔抗牛B6LBD融合蛋白多克隆抗体，4 C孵育过夜。PBS洗片后加 入1 100稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG, 37 C孵育1 h, PBS洗片 后进行DAB显色，苏木素复染，返蓝后中性树脂封片，显微镜下观察 并拍照记录结果。2结果2.1重组原核表达质粒的构建 以pGEM_伶为模板PCR扩增 出了牛B6亚基LBD 504 bp的片段，编码168个氨基酸。将该片段克 隆至pGEX 4T J原核表达载体，PCR、酶切结果显示目的片段与预期大小一致，测序结果显示重

12、组质粒pGEX/ (36LBD含有正确的开放 阅读框。2.2重组融合蛋白的诱导表达和纯化 将重组质粒 pGEX/ （36LBD转化大肠杆菌 BL21（DE3）,以IPTG 诱导表达重组3 6LBD蛋 白。SDSPAGE分析表明，重组菌经IPTG诱导后在45000处可看 到一条特异的蛋白条带 ，与预期表达的目的蛋白大小一致 ，未经IPTG诱导的阴性对照在此位置未见该条带。 Western blot分析显示,GST mAb与表达菌体中的重组融合蛋白形成了特异的抗原抗体反应 带。细菌沉淀经超声裂解获得其包涵体，表明重组融合蛋白以包涵体 形式存在于菌体中。包涵体经 sdSpage后切胶电泳洗脱纯化，获

13、 得了高纯度的重组融合蛋白（图1）。图1表达产物的SDSPAGE和 Wester blot检测（略）1:未诱导对照；2-4:分别为IPTG诱导3 h, 4 h, 5 h表达产物; M:蛋白marker; 5:纯化的目的蛋白；6:目的蛋白 Wester blot分析.2.3多克隆抗体的鉴定 以牛36LBD融合蛋白3次免疫新西兰 大白兔制备多克隆抗体。以2 mg/L的重组蛋白包板，间接ELISA法 测定兔抗血清效价在1 ：2800左右。牛舌组织免疫组化实验表明，牛 整合素36亚基仅分布于舌上皮细胞，尤其在棘细胞层表达量较大， 在固有层与肌层无分布（图2）,这与Monaghan等5报道的牛av 3

14、6分布于舌上皮组织的结论相一致。图2牛P6LBD多克隆抗体免疫组化结果（略）A:阴性血清对照（疋00）; B:抗牛36LBD多克隆抗体免疫组化染色（疋00）; C:抗牛36LBD多克隆抗体免疫组化染色（M00）.3讨论整合素广泛分布于生物体的组织细胞中，具有广泛的生物 学活性，在细胞的生长、移行、增殖和分化等许多方面发挥重要作 用。许多病毒能利用整合素分子作为病毒受体或共受体 (co receptor) 进入宿主细胞。整合素是一类由a和B亚基以非共价键结合形成的膜蛋 白家族，该家族包括由18种不同的a亚基和8种B亚基形成的24种a B复合物。在这些复合物中，a s、 av p3 av俗、 a比

15、、av戏、 0(5 B1、 0(8 s、 a bS38种整合素能够识别精氨酸甘氨酸天冬氨酸 (ArgGlyAsp, RGD )序列而与其配体相互作用9,已发现前4种是 FMDV的受体，后4种尤其是avp5和a5S已被许多实验证实并非 FMDV受体10。整合素的a和S链的氨基末端形成的球形部分为细胞 外配体结合域，该结合域在细胞信号转导过程中扮演重要角色，但是, 整合素作为FMDV的受体在病毒感染细胞过程中引发何种信号转导 途径目前尚无证据。Jackson等4发现正常情况下不感染 FMDV的人SW480 细胞在转染了人整合素S 6 cDNA后，即变得对FMDV易感，且这种 介导作用可被抗a vp

16、6的mAb所抑制，从而证实了 a v俗是FMDV的 受体。6亚基仅形成一种异二聚体即a v S5,人的子宫、膀胱、呼 吸道和唾液腺等不同部位的上皮细胞都发现有a v$表达。牛在感染 FMDV后，刘36在病毒靶器官的上皮细胞表面持续性表达，却检测不到av (33的表达，这表明av (36可能在FMDV感染的初始阶段起重要 作用5。最新研究表明，a $整合素不仅对FMDV吸附起作用，而 且在病毒的脱壳、复制等过程中也发挥着重要作用10。我们在克 隆到FMDV受体牛36亚基基因的基础上，选择以其配体结合域为研 究切入点，实现了该结合域的高效表达并制备了兔多克隆抗体。本研 究中选用的表达载体为pGEX

17、 4T1,在该载体多克隆位点的NH2末 端带有Mr为26000的谷胱甘肽转移酶(GST)标签，该标签有助于小 Mr蛋白的高效表达。对于一种蛋白质说来，抗体是研究其功能最有 力的工具之一。目前，市面上没有商品化的抗牛3 6蛋白的抗体可以利 用，这限制了人们对牛3 6蛋白作为FMDV受体的相关研究。我们制 备的兔抗牛3 6LBD蛋白多克隆抗体将有助于深入研究牛3 6亚基在FMDV感染宿主细胞过程中的作用。另外，FMDV具有明显的组织嗜 性，动物发病时多见舌面、 唇部、蹄部等的病变，导致这种表型的致病机理至今鲜有报道 ，兔抗牛3 6LBD的多克隆抗体将为研究FMDV受体整合素3 6亚基的组织分布及其

18、病毒致病机制提供依据。【参考文献】1Jackson T, King AM, Stuart DI, et al. Structure and receptor bin di ngJ. Virus Res, 2003, 91(1): 33-46.2Schneider Schaulies J. Cellular receptors for viruses:links to tropism and pathogenesisJ. J Gen Virol, 2000, 81(6):1413-1429.3Jackson T, Mould AP, Sheppard D, et al. Integrin a 3

19、1 is a receptor for foot_and_mouth disease virusJ. J Virol, 2002, 76(3): 935-941.4Jackson T, Clark S, Berryman S, et al. Integrin a 38functions as a receptor for foot andmouth disease virus: role of the 3cha in cytodomai n in in tegri n .mediated in fecti on J. J Virol, 2004, 78(9): 4533-4540.5Monag

20、han P, Gold S, Simpson J, et al. The av 36 integrin receptor for footandmouth disease virus is expressed constitutively on the epithelial cells targeted in cattleJ. J Gen Virol, 2005, 86(10): 2769-2780.6Duque H, Baxt B. Footjandmouth disease virus receptors:comparison of bovine a integrin utilizatio

21、n by type A and O virusesJ. J Virol, 2003, 77(4): 2500-2511.7Thomson GR, Vosloo W, Bastos AD. Foot and mouthdisease in wildlifeJ. Virus Res, 2003, 91(1): 65-80.8独军政，高闪电，常惠芸，等.牛口蹄疫病毒受体通用 亚基aV配体结合域的原核表达和多克隆抗体的制备 J.细胞与分子 免疫学杂志，2007, 23(10): 975-977.9Hynes RO. I ntegri ns: bidirecti on al, allosteric sig nali ng machinesJ. Cell, 2002, 110(6): 673-687.10Berryman S ,Clark S, Monaghan P, et al. Early events in integrin av 36mediated cell entry of footandmouth disease virusJ. J Virol, 2005, 79(13): 8519-8534.