细胞支原体污染.docx

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细胞支原体污染

细胞支原体污染一般情况及预防措施

细胞株若受到细菌、真菌、支原体、或是特定病毒等之污染时，会严重的影响实验的结果。

而细菌、真菌等之微生物污染时，较易自培养基等的外观变化察觉。

但是若受到支原体之污染时，细胞之外观较无明显变化，但是其污染会造成细胞之生长速率缓慢、细胞产生病变之型态改变等等变化。

各国细胞库支原体污染的统计表，如下：

国家　  受支原体污染（%）  报告年度

USA－FDA  15  1993（past30years）

USA－ATCC  15-20  1992

Japan－（IFO，RIKEN，JCR

80~30~22  19811987-19931998

Germany－DSM  36  1990-1994

Argentina  65  1987

Israel  32  1986-1993

China  95  1990

造成支原体高污染率的原因为：

1.支原体size0.1~0.8um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45um）

2.支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化

3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式

4.细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染

5.研究或操作人员忽略污染问题

而支原体污染了来源:

1.  已受污染的细胞

2.  操作人员的疏失

3.  已受污染的培养基、血清

4.  操作环境不良、实验器具不洁等

由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注意。

而万一细胞已受支原体污染时，最佳的处理原则为将细胞高压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株。

但是若是坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。

去除支原体污染：

1.抗生素处理：

BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasmaremovalagent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer）

2.Nucleicacidmetabolites：

5-bromouracil，Hoechst33258，bromodeoxyuridine

3.Anti-sera

预防与控制方面可从以下各点加强注意：

G设备方面：

1.  使用已作支原体测试ok之细胞株

2.  于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞

3.  使用不添加抗生素的培养基培养细胞

G检测方面：

定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。

G实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求

有关支原体污染之问题与回答：

o应如何避免细胞污染？

细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。

主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。

严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。

o如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？

直接灭菌后丢弃之。

o支原体（mycoplasma）污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？

不能。

除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。

o支原体污染会对细胞培养有何影响？

支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。

故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。

o侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？

直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。

支原体之检测：

***********直接培养法*************

·  原理：

直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。

·  特点：

是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。

·  缺点：

培养时间长，须3－5星期才能判断。

有些支原体不能在培养基培养出来（例如M.hyorhinis）。

需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。

·  材枓：

dextrose、L-arginineHCl、DifcoPPLObroth（Difco0554-17-1）horseserum、15%yeastextractsolution（autoclaved）、Bactoagar、无菌有盖螺旋试管（autoclaved）、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70%ethanol擦拭内壁。

）

·  培养基制备：

基本配方为DifcoPPLObroth（60%）,马血清（20%）,15%yeastextreatsolution（10%）,10xstocksolution（10%）。

由于培养时间长，可加入penicillin（50u/ml）至10xstocksolution或加入thalliumacetate（1：

2000）至培养基中以防止其它细菌污染。

·  10xstocksolution（1liter）：

称取50gdextrose，10gL-arginineHCl，溶于1liter蒸馏水中。

以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。

分装100ml至瓶中，保存于-70℃。

·  液体培养基（1liter）：

称取21g之DifcoPPLObroth，0.02gphenolred于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。

灭菌121℃，15分钟。

待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15%yeastextractsolution，及100ml解涷之10xstocksolution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。

保存于4℃，期限1个月。

·  固体培养基（1liter）：

称取21g之DifcoPPLObroth，0.02gphenolred，15gBactoagar于600ml蒸馏水中，加热溶解之。

灭菌121℃，15分钟。

放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15%yeastextractsolution及100ml解冻之10xstocksolution，混合均匀后，倒入60x50㎜之无菌培养皿中，5ml/培养皿。

保存于4℃，期限1个月。

步骤：

·  取1ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。

培养一周及二周后，分别取0.1ml液体培养液涂在agarplate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。

·  另取1ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agarplate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。

·  另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasmalaidlawii（ATCC23206）与M.arginini（ATCC23838）。

负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。

结果判读：

·  支原体生长较慢，所以先在液体培养基培养1~2周增殖后，再培养于agarplate上。

需至少培养3星期后，才可断定是否有支原体污染。

所以整个测试需5个星期才知正确结果。

·  典型之支原体菌落类似荷包蛋（fried-egglike），乃是由于支原体往agar下层生长所致，为圆形无色透明菌落，大小约10-55μm。

但是并非所有的支原体皆为似荷包蛋菌落，有些是圆形菌落或是类似粘菌类形态（slime）。

·  若要区分细胞或是气泡造成的类似菌落，可将其自agarplate上切下，重新培养于液体培养基中，培养一星期后再种入agarplate，若是细胞则不会生长。

DNA萤光染色法

·  原理︰利用萤光染剂（bisbenzimide,Hoechst33258）侦测支原体污染。

此染剂会结合到DNA之Adenosine-Thymidine（A-T）rich区域，因为支原体之DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而侦测。

被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之萤光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。

·  测试步骤用间接步骤，将待测细胞悬浮液或细胞培养液接种于指示细胞培养液中（indicatorcell，例如Verocellor3T6cell），然后培养指示细胞再作萤光染色。

正负反应对照组亦可以接种于indicatorcell内作为对照。

·  待测细胞亦可作直接测试，但需为吸附型细胞，培养后直接作萤光染色。

有些细胞易有萤光背景，而干扰结果判读，则建议使用接种于指示细胞之步骤。

·  特点︰简单、经济与灵敏，广泛使用，可作为例行之侦测步骤。

可以侦测不易培养之支原体，例如M.hyorhinis，较直接培养法快，约一星期即可知道结果。

·  缺点：

有时仍会有萤光背景，影响判读。

材料︰

·  Hanks’balancedsaltsolutionwithoutNaHCO3orphenolred（HBSS,GibcoBRL21250-014﹚、bisbenzimide（HoechstNo.33258,SigmaB-2883）、thimerosol（SigmaT-5125）、0.1Mcitricacid、02Mdisodiumphosphate、glycerol、glacialaceticacid、methanol、strerileH2O、chamberslide（Nunc177380）或chamberslide替代物：

35or60mmsterileplate内放置无菌22x22mm盖玻片﹙浸于酒精内，使用前过火灭菌﹚，一般吸附型细胞均能吸附在盖玻片上。

染色后取出盖玻片，细胞面朝下放在玻片上观察。

·  Indicatorcells:

Vero（Africangreenmonkeykidney,ATCCCCL-81orCCRC60013）or3T6（mousefibroblast,ATCCCCL-96orCCRC60070），细胞须先测试无污染。

αMEMwith10%FBS（mediumforVerocell）

配制试剂:

·  无菌HBSS︰配制Hanks’balancedsaltsolution，以0.22mm无菌过滤膜过滤灭菌。

勿用高压蒸汽灭菌。

·  Hoechst33258stocksolution（100X）︰称取5.0mgbisbenzimide和10.0mgthimersol溶于100ml无菌HBSS，置于棕色瓶中，室温下以电磁搅拌器搅拌30分钟至完全溶解后，以1ml分装至1.5ml小离心管中，贮存于-20℃。

·  Hoechst33258workingreagent︰取1mlHoechst33258stocksolution，加入sterile100mlHBSS中，室温下搅拌45分钟，置于棕色瓶中并以铝箔纸包覆，避免光照，贮存于4℃。

·  mountingsolution︰22.2ml0.1Mcitricacid和27.8ml0.2MNa2HPO4加入于50mlglycerol中混合，以1NNaOH调整pH至5.5（pH很重要），贮存于4℃。

·  固定溶液（fixative）︰冰醋酸与甲醇以1︰3之体积比例混合，使用前才配制。

步骤：

·  培养Vero细胞：

Vero细胞可作长期培养或制作多个冷冻保存管，测试前解冻培养。

测试前一周培养Vero细胞。

·  在接种测试样品前一日，以trypsin-EDTA溶液处理Vero细胞，制成细胞悬浮液，以1~2x10^4cells／ml培养于chamberslide中，每个well加入1ml细胞悬浮液，于37℃,5％CO2培养。

隔日确定生长良好后，即可接种测试样品。

·  接种测试样品：

样品种类：

1ml待测之培养基，1ml待测细胞培养液（可将细胞稍微刮下﹚，0.05~0.1ml冷冻管之细胞悬浮液。

·  将测试样品加入chamberslide内，培养5天后，进行Hoechst33258的萤光染色观察。

·  以AcholeplasmalaidlawiiATCC23206感染Vero细胞作为正反应对照组﹙或是已感染支原体之细胞培养液或冷冻细胞液﹚，负反应对照组为Verocell之新鲜培养基（αMEM+10%FBS）。

DNA萤光染色检测︰

·  取出培养5日之Vero细胞，吸除培养液。

于每个well中加入2ml1:

3混合的冰醋酸/甲醇固定液，静置10min后，吸除固定液。

重复上述之步骤，风干10分钟。

·  于每个well中，加入1mlHoechst33258workingsolution，室温下静置30min。

·  吸掉Hoechst33258染液后，以无菌水洗涤3次，风干后加入1滴的mountingsolution，并以盖玻片覆盖之。

·  以100x-400x萤光显微镜观察。

打开水银光源10min后，以UV激发光束（330～380nm）之滤光镜，观察细胞核外是否有蓝色萤光小点或是丝状点之萤光物产生。

结果判读︰

若有支原体污染，在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点或是丝状点。

其形状一致，与细胞残片染成之不规则点状物不同。

其萤光可维持数星期。

图例（A）为negativeresult:

萤光显微镜下，只观察到Vero细胞的细胞核，测试样品没有支原体的污染。

（为positiveresult:

在Vero细胞核外与细胞表面会出现蓝色萤光小点和丝状点，表示测试样品有支原体的污染。