农杆菌介导转化和再生的杨树.docx

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农杆菌介导转化和再生的杨树

农杆菌介导法转基因杨树

摘要：

杨树品种已发展为一种植物转化和再生系统。

叶植，从稳定发芽培养的一个杨树杂交NC-5339（银白杨标本），被共培养用于农杆菌遗传转化关于一个烟草的看护培养。

致瘤的和无防备的农杆菌株隐藏包含一个双元载体，其中包含两个新霉素磷酸转移酶II（NPTII'）和细菌5莽草酸3-磷酸合酶（EPSP）（AROA）嵌合基因融合。

没有开发芽，叶外植体时，双元缴械拉力的根癌农杆菌菌株共培养。

然而，转化的植物，没有野生型的T-DNA获得使用农杆菌​​株原癌基因的二进制。

NPTII'酶的活性检测，Southern印迹法分析和免疫学检测证实了遗传转化成功细菌EPSP合酶Western印迹。

这是首次报道成功收回转化植株森林树，也是第一个记录的插入和重要农艺性状的外源基因的表达成木本植物物种。

关键词：

白杨；转化；农杆菌

前言

基因工程树种的能力将是特别有用的遗传改良，如大型成熟的植物并长期有性世代倍（NelsonandHaissig1984;SederoffandLedig1985）。

森林树种的应用重组DNA技术的一个先决条件是发展的基因转移系统。

方法，例如显微注射（Crosswayetal.1986）和直接DNA摄入（Paszkowskietal.1985;Frommetal.1986）已被用于外源基因引入到草本作物物种，但是，最有效的基因转移的方法，利用自然感染冠瘿病的机制造成的有机体，农杆菌（Bevanetal.1983;Fraleyetal.1983;Herrera-Estralla,1983）.。

根癌农杆菌的自然感染周期期间，细菌的T-DNA整合到宿主植物的染色体，从而导致肿瘤对植物的生产（奇尔顿等人，1980）。

可以删除和替换而不影响根癌农杆菌的T-DNA转移到植物（DeGreve等，1982）的能力，由异源基因的肿瘤诱导基因。

这些修改后的根癌农杆菌菌株的原生质体，悬浮细胞，外植体组织的共培养，可导致转化植物缺乏致癌基因性状的隔离。

因此，我们着手开发一个混合型杨树无性系，银白杨xgrandidentata的（NC-5339）作为载体的农杆菌转化体系。

有许多特征能使杨树NC-5339得到理想的转化研究首先，杨树是一个重要的全球森林树种。

这是一个快速增长的落叶阔叶树，栽培主要用于纸浆生产。

对于短期循环杨树种植园的建立和管理的一个主要限制因素是缺乏一种广谱除草剂，从而有效地控制杂草（Akinymijuetal.1982;HansenandNetzer1985;NelsonandHaissig1986）。

因此，生产的杨树品种抗此类除草剂具有经济吸引力。

介绍草甘膦耐受性的嵌合基因（Comaietal.1985）杨树杂交提供了一个独特的机会对于杂草控制。

野生型菌株，如杨树虫瘿上已分离出27株（基恩等人1970年生）和应变AT181（西亚基等人，1978）。

最近，杨树再次作为宿主的根癌农杆菌展示瘿组织中存在的T-DNA序列（Parsons等人，1986），但是，迄今为止的根癌农杆菌还没有被成功地用作载体将外到杨属植物重要农艺性状的基因。

第三，杨树是一个属森林树木的成员，其经受得起体外操纵。

杨树的苗培养可以保持在体外和用于无性繁殖，从而提供了一种无菌的细菌的共培养实验中的外植体材料的来源。

此外，大量的繁殖体可以迅速获得用于实验或商业目的（1978视Christie;麦科恩1985）。

在本文中，我们描述了胡杨NC-5339植物外源基因系统的转移和表达。

农杆菌的遗传转化使用二元的致瘤菌株突变aroA基因，编码5-烯醇丙酮酰莽草酸3-磷酸合酶（EPSP）较不敏感的除草剂草甘膦，背引入到杨树NC-5339植株。

aroA基因的稳定整合和表达由Southern和Western印记分析证实。

这是首次报道的同时改造再生的森林树种。

材料与方法

植物培养及再生。

苗培养建立在一个杨树杂交克隆，银白杨x大齿杨（NC-5339），麦科恩（1985）所描述的。

Murashige和Skoog培养基中蔗糖（30克/升），和植物琼脂（0.6％）（血清）中的最小的有机物，用于初始培养和随后的次生培养。

培养基用氢氧化钾溶液将pH值调节至5.6，高压灭菌培养基20分钟在121°C.红色苯胺染料（芝加哥），GA7培养容器，含有50毫升培养基，用于维持苗的培养。

这种培养基也被用于白杨生根培养。

苗的培养是除去叶片和顶芽，并把切下的茎水平铺到新的培养基上来维持嫩腋芽每四个星期出现。

 所有培养物生长在受控环境室在25°C_+2°C，采用冷白荧光灯50微摩每米每2秒（50gEm2S）在16h光照天为一个周期。

从叶片外植体芽再生培养基（如上所述）维护培养通过添加BA（1.0毫克/升）和玉米素（ZEA）（1.0毫克/升）。

高压灭菌后，冷却至50℃，羧苄青霉素（500毫克/升）（抑菌物质）和卡那霉素（60毫克/升），（选择性抗生素），除菌过滤器，根据需要向培养基中加入。

然后将该培养液分配到100×15毫米的培养皿中（35-40毫升，每盘）。

菌株。

根癌农杆菌菌株LBA4404中是一种非致癌衍生物ACH5的T-DNA已被删除（赫克玛等人，1983）。

该菌株携带一个完整的VIR区域，并可以调解引入任何T-DNA存在于植物的细菌进入。

Ç58是一个致癌的，胭脂碱生产的应变农杆菌的遗传转化（汉密尔顿和1971年秋季）。

双载体引入pPMG85/587株LBA4404和C58。

此质粒携带的变形的T-DNA中，有三个嵌合基因（图1）。

这些基因编码新霉素磷酸转移酶（NPTⅡ'）的抗性对抗生素卡那霉素（Bevan等人，1983;Fraley等人，1983;Herrera的埃斯特雷亚等，1983），两个并拼接到羧乙基精氨酸合成酶启动子（ocs-NPTⅡ'）（Barker等人，1983）或甘露碱合成酶启动子（mas-NPTⅡ'）（Barker等人，1983）。

第三个基因赋予耐受除草剂草甘膦（Comai等，1983），并已接合的甘露碱合成酶启动子（主重组质粒中的aroA）。

农杆菌维持在AB固体基本培养基（Watson等，1975），补充的情况下，卡那霉素100毫克/1株含有pPMG85/587。

文化被重新划线每十五天。

共培养从新鲜的划线板的单个菌落接种到5毫升MG/L液体培养基（奇尔顿等，1974），在25×150mm的培养管中，培养过夜。

当时过夜培养稀释至合适的浓度（C58/85分之587和C58;2×10秒菌落形成单位/毫升;应变LBA4404/587/85：

5-10×L0小号个菌落形成单位/毫升）的培养物在550nm处的吸光度的菌株测量细菌浓度。

转化的杨树NC-5339，通过以下方式获得在烟草悬浮培养细胞的存在下（Horschet人，1985）的根癌农杆菌共培养的叶片段。

烟草进纸器板，制备前2天，通过移液陪替氏培养皿（100×25毫米），含有50毫升的Murashige最小的有机物介质（KC生物），补充了2,4-D（0.1到0.5毫升的烟草悬浮培养中使用毫克/升）激动素（1.0毫克/升）的盐酸硫胺素（0.9毫克/升），酸式磷酸钾（200毫克/升），Difco细菌琼脂（0.8％）。

第2天，无菌滤纸的培养皿（Whatman公司3毫米）被放置在顶部的烟草细胞。

预洗涤滤纸圆片在蒸馏水中，高压灭菌在烟草悬浮介质中（如上所述），但无琼脂的。

烟草细胞悬浮液用于馈线板块维持每周转移10毫升的细胞——凝聚剂锡安到100毫升新鲜液体培养基。

使用的介质为维护烟草细胞悬浮液（描述上图）是相同的培养基，为了在馈线板上划线防治琼脂的遗漏。

烟草器板制备后，杨树叶子获得从无菌苗培养，切成段（~2cm2），培养基中培养24小时，在光线不足的条件下，在25°C（10家创业板2SL）。

叶片段，然后放置到1-5毫升MG/L液体培养基中培养：

农杆菌菌株C58/587/85，C58或应变LBA4404/587/85稀释到适当的浓度。

30分钟后，叶段涂抹删除

多余的悬浮液用到划线培养48-96小时的细菌。

叶片随后被转移到再生培养基中含有羧苄青霉素（500毫克/升）和卡那霉素（60碎布/1或0的破布/升）中，如上所述。

芽被切除时，他们约1-2厘米长，从叶腋传播芽如上所述。

杨树nc-5339叶的外植体芽再生率被确定通过得到许多外植体再生芽和通过计算来自其中每个外植体芽发育的数量。

这个收集的数据来自两个独立的实验其中每个处理至少有三个平板（每个平板就个外植体）。

平均的外植体再生芽和每个外植体再生芽的平均数来计算。

平均每个板的百分比值是由一个反正弦进行的。

对于每个平均数，其标准偏差和标准误差都要计算（1982年Sincich）。

进行一个一个尾随关于总体平均数的t检验确定控制（不是共培养）和共同栽培的外植体的再生率是否有著差异（1982年Sincic）。

分子量分析。

新霉素磷酸转移酶II（NPTⅡ'）赋予抗卡纳霉素可以直接选择转基因植物组织。

活性酶II'叶片和嫩枝转化和对照植物的测定采用的Reiss等人的方法。

1981年，通过加入最后清洗。

蛋白酶K，p-81离子交换纸冲洗三次解决（1.0Ixg/毫升）在90°C减少非特异性结合的32po4磷酸化蛋白。

要确定是否野生型的T-DNA在拉力C58表示，胭脂碱进行检测叶片样本和B型芽。

胭脂氨酸测定进行了描述和Schilperoort（1978）。

Western印迹分析。

Western印迹分析细菌的EPSP合酶的由aroA基因所编码Comai等描述的。

（1985）,除了最初的准备组织提取物。

叶组织（0.5克），用0.2克在液氮中研磨聚乙烯吡咯烷酮polyclar的AT和悬浮在2.0毫升的0.1M柠檬酸钠缓冲液，pH5.6，含有10mM150毫米氯化钠，EDTA，0.05％NONIDETP-40，25毫克/毫升血清白蛋白，10mM的二硫苏糖醇，10mM的硫脲，10〜的tM亮抑酶肽。

DNA分离和southern的分析。

从1g叶片或芽组织通过以下方式DNA提取。

组织在液氮中冷冻，用研钵粉碎杵和一个BrinkmannPolytron匀浆具有7个10秒的脉冲在10毫升的核隔离缓冲液（的10mM三异丙基乙磺酰，pH值9.5，4mM的亚精胺，1mM的精胺，10mM的EDTA，80mM的KCl，0.5M蔗糖，10mM的β-巯基乙醇，0.5％的TritonX-100）在0°C过滤。

这个混合物被过滤（Calbiochem，Behring）细胞核通过离心（5分钟，3000×g），细胞核分离缓冲液重新悬浮于5ml（5分钟，在300×g）离心并重新悬浮在1.5ml相同的缓冲液中。

1.5毫升的裂解缓冲液（0.1M的三异丙基乙磺酰，加入pH值为9.5，40mM的EDTA，2％肌氨酰，蛋白酶K的12个单位），慢慢混合，使得细胞核在65℃下在此溶液中温育三十分钟一小时。

当时此消化染色制备（的10mMTris，1mMEDTA）中，用TE-饱和轻轻萃取评价苯酚（pH7.5）中，然后用TE饱和的酚氯仿（1：

1，pH7.5）中。

将水相的调整0.3M与NH4醋酸和沉淀两次两倍体积的乙醇​​。

该DNA，然后再悬浮在10mM的Tris液（pH8.0），10mM的NaCl溶液，并保存在4℃。

随后，国家环保总局用EcoRI消化分离的DNA评价通过凝胶电泳，印迹到硝酸纤维素杂交单独一个AROA探头，NPTII'探针和胭脂碱探头。

程序限制二拥塞，凝胶电泳，南航中转和混合动力化，如Maniatis等人所述。

1982）。

该探头NPTII“和aroA基因合成通过在体外转录质粒pCGN464pCGN1008。

这些质粒包括NPTII“基因aroA基因分别克隆PSP64，SP-6-转录载体（麦尔登等，1984）。

建议由生产商推荐的合成和混合化之后（Promega公司的生物技术公司，麦迪逊，威斯康星州）。

该的T-DNA的pTiC58一个的32P标记探针片段的HindⅢ-23，（Depicker等，1980）进行胭脂碱合成酶基因。

结果

再生植株

再生杨树NC-5339叶外植体获得MS培养基补充1.0mg/lBA和1mg/l玉米素。

芽发育在切断边缘叶外植体后20-30天。

平均1-3芽发育，由35%的叶外植体而来（表1）。

芽的数量增加与外植体的大小和切割面的数量有关。

基于显微观测在发育期间,芽似乎源自偶然的分生组织而不是体细胞胚胎。

花青素生产现场观察发育培养,仅在芽萌发之前。

植物转化

超过30%的外植体农杆菌转化C58/587/85芽的育发在分化培养基上34周内含有卡那霉素60mg/l（表1）。

平均四卡那霉素抗性发育每个芽的外植体。

对照组织的增长卡那霉素是完全抑制的，在60mg/l（图2）。

明显差异数量的外植体再生芽在非选择性的培养基观察在农杆菌遗传转化共培养（菌株C58和C58/587/85）和对照（不是共培养）外植体在5%和2.5%水平之间。

不仅更多外植体再生芽种植在共培养后（表1）,但对于C58/587/85芽再生共培养外植体（表1,图。

2）是对照外植体的四倍。

一致的平均数的差异从观察外植体共培养的再生芽外植体C58与对照外植体；然而，这些差异只是意义上10%的水平。

没有差异的再生率之间提到叶外植体共培养LBA4404/587/85和对照叶外植体（数据未显示）。

在两个实验中使用60外植体处理每个植物，卡那霉素抗性芽在外植体共培养与二进制中从没有回复，LBA4404/587/85。

表1：

共培养和控制杨树NC-5339的叶片外植体的生长在再生培养基或不使用选择性抗生素卡那霉素的培养基

杨树茎的外植体再生

0mg/1的卡那霉素60mg/1的卡那霉素

茎的标准每个茎标准茎的标准每个茎标准

再生平误差的外植误差再生平误差的外植误差

均值体平均数均值体平均数

控制36.0a8.32.9a0.5900

（非共培养）

C5855.2b4.94.1e0.4600

C58/587/8559.3e5.711.97f1.3232.02.14.40.90

使用一个一个尾随t检测的手段进行俩俩之间的比较对人口意味着

a在5％的水平上明显不同于C58

b在C58/587/85没有明显不同

c控制在2.5％的水平上有显着的不同

dC58在10%的水平上有显著的不同

eC58/587/85在5％的水平上有明显不同

f控制在5%的水平上有显著的不同

图2：

共培养和和非共培养的杨树NC-5339的叶片外植体在卡那霉素的存在和不存在之间的芽再生率的差异

每个植物的处理，卡那霉素抗性芽在外植体共培养与二进制中从没有回复，LBA4404/587/85。

芽的生长在含有卡那霉素的以芽的形态学为基础被分成A和B两类，这种B类型芽的表型明显不同于未转换的胡杨NC-5339的芽。

与未转化的对照组相比，在传统的生长方式中B类型的芽茎增后，大大的降低了茎每个区域的叶片的表面积（图3）。

另外，当B类型的芽被切除转到生根培养基上时，以茎和B类型茎为基础的大量愈伤组织形成，但是没有根生成。

相比之下，A类型的芽在外表上不能辨别为转换的控制芽和根系发达的芽在两周内切除时，接种到生根培养基上。

胭脂氨酸合成酶和NPTII'酶是在预先挑选出来的含卡那霉素的20B型和40A型的芽的培养基上测定出来的，胭脂氨酸合成酶的活跃性是在所有的B类型芽中发现的，而不是在A类型或未转化的芽中（图4）。

NPTII'酶活力在两个相同的芽表型上也进行了检测（图5）。

20B类型芽的18和40A类型芽的38的测定表现出了NPTII'酶活力而未转化的杨树样品没有测定出来。

图3.转换的杨树NC-5339植物和芽来自于带有一个A累致癌应变的外植体共培养。

两种不同类型芽的形态学发展：

A型芽，外表上不能辨别亲本植株，不含有野生型的T-DNA，B型芽，一个快速增长的形式，包含野生型T-DNA.

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图4.胭脂氨酸试验继续在杨树NC-5339芽（A型和B型）的来源于带有A的外植体共培养的100毫克叶组织转化，C58/587/85.样品在酸化甲醇和离心机分离中提取。

将上清液倒在滤纸3毫米处和进行高压分流电泳。

这个胭脂氨酸的存在是由电泳图谱的着色条带和紫外光下观察证明的。

在完全控制下，泳道6，跑得更快的点是胭脂氨酸，泳道1-5，是A型叶片样品，7-10，是B型叶片样品；泳道11，胭脂氨酸阴性对照。

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图5.NPTII'酶活力德检测在杨树NC-5339植株和芽中的转换，泳道1，叶的浸出物来自于一个杨树NC-5339的植株；泳道2，叶的浸出物来自于一个正番茄的控制；泳道3-10,的叶的浸出物来自于A型芽

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图6.细菌EPSP合酶的检测在转化杨树NC-5339植株中通过蛋白印迹杂交进行的分析，泳道1，叶片浸出物来自于转化番茄植物A农杆菌

菌株LBA4404pPMG587/85;泳道2，叶片浸出物来自于未转化的杨树NC-5339植株；泳道3和4，叶片浸出物来自于转化的杨树NC-5339植株；泳道5，250毫克纯化的EPSP合酶蛋白添加到未转换的杨树

NC-5339叶提取物；泳道6，250毫克纯化的EPSP合酶蛋白无叶提取物

Western印记分析

假定转化进行Western印迹分析以检测是否存在的细菌EPSP合酶，如图6所示，泳道3和4，多肽同反EPSP合酶和预期的分子量起反应存在于转换杨树NC-5339植株中。

这个多肽在未转化的植株中没有发现，这个细菌EPSP蛋白合酶数量的发现在不同的转化植株中发现。

（图6，泳道3和4.）番茄树叶（图6，泳道1.）包含相同的常染色体阴性遗传白化病融合物，似乎每克叶片组织的鲜重比杨树NC-5339产生微少的EPSP合酶蛋白质（图6，泳道3.）。

这是可能的，然而，蛋白的恢复效率在物种中是不同的，因此常染色体隐性遗传病蛋白观察的数量也许不会反应在体外的水平。

Southern印记分析

来自于白杨的脱氧核糖核酸的分离在德拉波塔等的协议中首次尝试，这个协议对其他的植物种是起作用的，然而，它产生的白杨DNA严重的污染了凝胶材料，或许多糖对于限制核酸内切酶的消化和电泳是不适合的。

这个协议用材料和方法去克服这个问题，它包含核酸纯化，接着是蛋白纯化和有机溶剂的抽提。

用这种方式我们获得了容易消化和电泳的高质量DNA（20-40ug/gm的鲜重），这个DNA获得的大小在5-20KB范围内有10%-20%不是符合要求的，它是适合于Southern印记杂交。

大约有5ug的DNA是被核酸内切酶EcoRI，经0.7%的琼脂糖凝胶电泳和模糊不清的硝化纤维消化，这个污渍点是为了寻找NPTII'和aroA中的RNA,一个缺口是为了pTiC58的T-DNA的寻找。

质粒pPMG85/587用EcoRI酶进行消化产生了1Kb的片段运载NPTII'基因。

这个片段的大小在所有的公认转化植株和未转化植株中被发现（图7）。

同样地，预料的包含aroA的9.7kb的片段被转进转化植株中表达了aroA-EPSP合酶活性（图.8）。

两个转化的植株39-3和39-115被蛋白印记杂交aroA否定，不包含9.7kb片段。

A段的pPMG58/587跨越MAS-AROA和MAS-NPTII'及已被删除的重组同源NPTII'-OCS-3'之间地区的pPMG85//587（看图.1）。

如果这发生了，然而，我们期望能找到一个4kb的EcoRI片段，（图.1,C和B为标准）混合到pUC中，如此一个片没有发现（数据没有表明）39-3和39-115两者都不包含任何的DNA同源于pUC。

这表明，在这些植物的转化中导致从一个不完整的在右边框T-DNA的转移开始和在aroA基因前结束。

如果这种假设是错误的，那些植株不应该包含左侧边框，额外探针杂交的条带可见两个AROA和NPTII'印迹，这些条带很难解释它们的大小不适合那些预期的pPMG85/587染色体图谱。

在4.6kb的aroA印记条带可能由于假想的杂交育种被发现和控制。

Hind23片段位于pTiC58T-DNA的右侧末端，通过用HindIII酶消化质粒pHind23获得，分离从3.5kb的Hind23插入载体带（pUC18中）琼脂糖凝胶电泳和Hind23的凝胶（Maniatis等人，1983），使用缺口翻译Hind23作为探针，与C58的T-DNA一致的的信号在A-10和A-33被发现，但不是在任何其他杨树样本中（数据未示出）。

Hind23杂交的大型EcoRI片段（>30KB）在A-10和a〜15kb片段在A-33。

异质性预期片段在这种情况下，作为EcoRI片段跨越了正确的T-DNA边界。

总之，Southern印记分析假定的杨树转化证实了NPTII'检测，AROA-EPSP合酶Westernblot分析，胭脂碱分析和表型分类。

相当大的变化在T-DNA的拷贝数进行了观察。

由于该杨树基因组的大小是不知道，我们不能准确估计拷贝数范围。

初步比较浓度标准的（数据未示出）建议39-31个副本，100份A-10，假设1PG单倍体基因组的大小。

图7.A，B.Southernblot在转化杨树中分析NPTII'基因。

泳道1，大肠杆菌噬菌HindIII位置;2泳道，控制杨树，3和4的A-11和A-33转化杨树的畸胎瘤线的类型;5和6，75-/2和75-15是正常的重组质粒中的aroA-阳性，线7和8，39-3和39-1/5都是正常的aroA阴性。

杂交印迹暴露20小时（r）和B4小时（r）。

等量的DNA（5〜TG）被载入每个泳道，除第4泳道2.5GG加载。

来自于pUC4K的混合抗性基因（图1）杂交不混合NPTII的探针

图8.转化的杨树aroA基因的Southern印迹分析。

1泳道，大肠杆菌噬菌体HindIII的位置;2，控制杨树，3和4的A-11和A-33转化杨树的畸胎瘤线的类型;5和6，75-12和75-15;正常aroA-阳性;线7和8，39-3和39-115都正常的aroA-阴性线

讨论

突变的EPSP合成酶基因,耐除草剂草甘膦,和两个可选择的NPTII'的基因已经在杨树中被转移和表达。

这是第一个研究报告重获转基因植物的森林树种,插入和表达式的一木本作物在农业上有用的基因,和成功利用农杆菌​​外植体共培养系统为木本物种。

目前,我们是克隆所生产的转化杨属植物AROA蛋白的高低来决定耐草甘膦基因。

我们所描述的转化系统是外植体共培养系统，它结合了三个重要特点：

采用在体外杨树芽的培养，使用特定的致癌基因的菌株农杆菌介导和使用的培养基中诱导芽的发育杨树NC–5339叶外植体。

芽的培养提供了一个幼体，无菌和可重复性源外植体组织和源组织比其他来源已表现出卓越的生长和再生潜潜力（史密斯和麦科恩1983）。

我们还发现，使用一种基于C58二进制致癌农杆菌株介导的DNA转移到杨树，而且也增强叶片外植体芽增殖率。

由于二进制致癌农杆菌株C58/85/587和未变性的菌株C58的增强率芽再生是可能的，无论是原癌基因与野生型的T-DNA或反式玉米素（TZS）基因运输的VIR地区内（雷吉尔和1982年莫里斯）局部的激素环境，提高再生植株的激素结合生成再生培养基。

增强再生率，可能是NEC埃森检测率重新转化事件以来，通常减少细菌共同培养后的一代。

致癌应变的影响，可能是一个物种观察到了相反结果的特定的一个，因为到番茄叶共培养具有相同的菌株（C