最新版野生三叶青驯化栽培种质筛选及开发利用可行性研究报告.docx
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最新版野生三叶青驯化栽培种质筛选及开发利用可行性研究报告
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余杭区2012年度农业科技创新项目
项目名称：
野生三叶青驯化栽培、种质筛选及开发利用
承担单位：
杭州鸿越生态农业科技有限公司
合作单位：
杭州职业技术学院、浙江大学
申报日期：
2012年7月13日
目录
一、项目申请表
二、项目可行性研究报告
三、承诺书
余杭区2012年度农业科技创新及社会发展项目申报表
申报单位
杭州鸿越生态农业科技有限公司
项目
主持人
邬锡伟
项目名称
野生三叶青的驯化栽培、种质筛选及开发利用
起止年限
联系电话
项目类别
农业科技创新项目
项目拟投入经费
50万元
项目申报单位上年度
销售收入
0万元
技术依托单位
杭州职业技术学院、浙江大学
上缴税收
0万元
技术开发费
0万元
项目主要研究内容及预期经济效益：
三叶青是我国独有的、极其稀少而珍贵的中草药，具有抗病毒、抗炎、镇痛与解热、保肝等作用且毒副作用小，是西药无法代替的植物抗生素；加上抗瘤药用价值发现与应用，临床上已广泛用于抗癌、抗肿瘤及抗艾滋病毒等疾病。
近年来，我国有多个中药厂都在使用三叶青作原料生产中成药，并且其需求量呈大幅度增长趋势。
同时由于环境的改变及毫无节制地狂采滥挖，只挖不种，加上三叶青对生长环境要求苛刻，致使原本就稀有的野生三叶青日渐稀少，濒临灭绝，根本不能满足医药市场需求，更显现它不可多得的珍贵。
本项目的研究旨在为扩大野生三叶青的资源,加速三叶青栽培和开发提供新技术，重点进行该物种的遗传育种和保护生物学研究，并针对三叶青驯化栽培技术、生态复合间混种及不同条件下的活性成分分析和优质种质筛选与高效栽培进行研究与应用示范。
一、主要研究内容
1．三叶青生态栽培技术研究与示范推广
研究三叶青引种驯化栽培、种源繁殖、肥料使用、病虫害防治、采收与加工等标准化栽培技术规程。
根据三叶青主要功能性成分变异规律，对关键技术进行进一步研究，并进行组装配套，研究、制定出适宜我市生产管理规范，从繁殖材料、栽培、收获、初级加工、商品分级与包装、贮藏和运输、人员和设施、文件档案管理、质量保证等方面对三叶青的生产管理技术进行全面具体的规定，并加以推广应用。
2．三叶青种质资源收集及组织培养技术
在我市范围内开展三叶青种质资源的调査工作，摸清三叶青种质资源的分布情况及产业发展概况。
在系统调査研究基础上，在我省主要分布区域收集三叶青种质资源。
经过筛选的种质进行组织培养扩繁，培育优质种苗。
3. 不同栽培条件三叶青有效成分比较研究及栽培体系的建立
开展不同种源、不同栽培方式、不同立地三叶青有效成分对比分析研究，筛选出有效成分含量高、产量高，适应山地及平原栽培的三叶青种苗，并建立三叶青复合间混作高效栽培技术体系。
二、主要技术指标
1、掌握和控制三叶青快速繁殖影响因子技术。
2、筛选出适合三叶青组织培养的培养基，培养小苗的过程中，采用愈伤组织培养及最佳培养基配方的技术，整个过程时间缩短了6个月，组培苗移栽成活率达90%以上。
3、能周年生产三叶青，向人们提供丰富的三叶青药材，满足人民用药需要，同时也为花卉市场提供插花材料和观叶的盆花，丰富花卉市场的种类。
4、大面积地推广三叶青种植，投入产出比可达1︰2～1︰3以上。
5、采用生态栽培技术：
不使用化学合成的肥料、农药、生长调节剂、添加剂、色素等，也不采用基因工程和离子辐射技术，而是遵循三叶青的自然生长规律，培肥、除草、防治病虫害、采收和初加工，形成三叶青药材及其产物安全生产体系。
三、主要经济指标、社会效益及成果
1．制定《三叶青生态栽培技术标准》，建立三叶青试验、示范基地20亩，推广300亩，投产后年增产值2000万元，年增利润400万元，年增税收80万元。
2．确定三叶青有效成分总黄酮提取工艺并建立快速检测技术。
3．揭示三叶青有效成分与栽培条件的变异规律，为确保三叶青品质提供科学依据。
4．开发一批适宜赏药兼用的三叶青生态栽培产品，满足市场需要。
5．发表学术论文2篇，申请专利1项。
通过本项目建设，以公司为龙头，联结广大农户，通过“公司+基地+农户”的模式发展优质三叶青产业，全面利用高新技术和新品种与人工栽培生产新工艺等，劳动生产效率和资源的有效利用明显提高，从而进一步提高三叶青产品的附价值。
主管部门或镇乡、街道意见：
年月日
区科技局意见：
年月日
余杭区2012年度农业科技创新项目可行性研究报告
项目名称：
野生三叶青驯化栽培、种质筛选及开发利用
承担单位：
杭州鸿越生态农业科技有限公司
合作单位：
杭州职业技术学院
浙江大学
申报日期：
2012年7月13日
可行性研究报告提纲
一、项目概况，国内外同类研究情况（包括技术水平）；
二、市场需求、经济、社会、生态效益分析；
三、主要研究内容、技术关键；
四、预期目标（主要技术、经济指标；应用或产业化前景）；
五、已有条件分析（包括原有基础、技术力量的投入、科研手段和研究成果的生产或应用去向）；
六、实施方案（包括技术路线、进度安排）；
七、投资及应用（包括经费来源及用途）；
八、申请单位概况（包括企业规模、技术力量、设备和配套情况、企业资产及负债情况）。
九、项目负责人与主要参加人员简历
一、项目概况，国内外同类研究情况
（一）项目研究的背景及意义
1、项目研究的重要性
从新世纪开始，我国进入了全面建设小康社会加快推进社会主义现代化建设的新的发展阶段。
同时，在社会经济迅速发展的今天，大量野生植物资源的破坏和野蛮的采集，使野生植物种类和数量急剧下降，最终导致生态平衡的破坏，直接威胁着人类的生存与发展。
而研究野生植物的驯化和生态栽培技术是维护生物多样性、维持生态环境平衡、挽救濒于灭绝的植物、保存野生植物种质资源与开发利用的根本保证。
浙江省是经济强省，随着我省经济的迅猛发展，资源短缺，生态环境压力加大，自然资源利用和经济发展之间的协调关系将显得日益重要。
我省明确提出了建设“绿色浙江”的战略目标，这是全面推进我省现代化建设和经济、社会、环境可持续发展的战略选择。
积极建设“绿色浙江”，推行以资源节约型、科技先导型、质量效益型和清洁生产为特征的可持续发展战略，在全国率先建立符合可持续发展要求的良性生态环境系统已成为浙江省各级政府的一项重要战略任务。
研究药用濒危植物的栽培技术能正确处理自然资源利用和经济发展之间的关系，是实现可持续性发展的重要途径。
2、三叶青是我国濒危珍稀中药材，毒副作用少，应用广泛、疗效确切，具有极大的开发利用潜力
近年来，随着人们保健意识的增强，对三叶青药材的需求量日益增大。
三叶青为葡萄科崖爬藤属植物，其块根称为蛇附子，又称三叶扁藤、金丝吊葫芦等，以块根或全草入药，为民间常用的中草药，具有抗病毒、抗炎、镇痛与解热、保肝等作用，且毒副作用小、是西药无法代替的“植物抗生素”，临床上已广泛用于抗癌、抗肿瘤及抗艾滋病毒等疾病。
三叶青因其药效显著，开发潜力巨大。
霍昕（2008）在三叶青块根乙醚提取物中共分离出21个化合物，检测出18个组分，其中含量较高的是亚油酸、棕榈酸、油酸、二苯胺、亚麻酸甲酯和硬脂酸。
李瑛琦（2003）从块根的乙酸乙酯萃取物中分离到7个化合物。
毛一亮（2008）分离到4个化合物，鉴定为：
β-谷甾醇、山柰酚、槲皮素和山柰酚-3-O-新橙皮糖苷。
LiuD（2002）报道从三叶青中得到一种新的黄酮碳苷。
刘东（1999）从其地上部分的石油醚萃取物中分离到4个化合物：
蒲公英萜酮、蒲公英萜醇、β-谷甾醇和麦角甾醇。
槲皮素可诱导肿瘤细胞凋亡，又可阻止非肿瘤细胞凋亡；其提取物能通过增强单核-巨噬细胞的吞噬功能而发挥抗肿瘤功能。
以三叶青为主要成分的金丝地甲胶囊，可明显抑制LEWIS肺肿瘤细胞、SMMC-7721肝肿瘤细胞、HT-60人淋巴母细胞性白血病细胞、SCG-7901胃肿瘤细胞及HCT-116结肠肿瘤细胞生长。
按《保健食品检验与评价技术规范》（2003版）“食品安全性毒理学评价试验”载：
“三叶青无毒，无致突变性”，其提取物对人肝癌细胞HepG2有较强的抑制作用。
用三叶青研制出的一种创新中药，有抑制和清除乙肝病毒，调整机体免疫、保护肝细胞、阻断肝纤维化等作用。
恶性肿瘤病人口服金芪片（含三叶青），总有效率达78.33%。
以清热解毒为主、健脾行气活血为辅的中肝合剂（含三叶青），配合西药治疗Ⅲ期原发性肝癌，可提高患者生活质量，延长生存期。
鉴于三叶青的良好药用价值，其进一步开发利用具有十分广阔的前景。
另外，三叶青可塑性强，三叶青是四季常绿的藤本植物，叶片细小、繁密、光亮，可根据环境和观赏要求进行多样化栽培和造型。
阴湿的室外环境可铺地栽植，覆盖率很高，藤蔓生长速度快。
作为盆栽，可做成普通挂盆或中小盆在室内摆放，也可培育成特大盆供宾馆、办公大厅装饰，长期摆放。
三叶青庭园栽培表现抗病、少虫害，十分耐寒。
在长江以南地区，即使在室外越冬，也可完全不用任何防寒措施，室内盆栽则可在江北地区广泛应用。
3、三叶青野生资源急剧减少，充分利用优良种质资源，进行人工栽培是保障三叶青资源可持续利用、产业可持续发展的必然途径。
长期以来三叶青药材一直依赖野生资源，资源的利用方式是非再生性采挖，一方面导致野生三叶青资源蕴藏量急剧下降，许多传统产区无药可采，如不及时收集和保存，有可能导致灭绝；另一方面不同的产地野生药材有效成分存在显著的差异，严重影响三叶青的质量。
因此三叶青的驯化栽培是保障三叶青产业持续发展的必然途径。
三叶青主要生长在荫蔽度较高的山谷、灌丛林间等腐殖质较高的地方，在阳光直射的地方偶有生长，但生长不良，其生长环境要求相对严格。
不同种质其生物学特性有较大的差异，特别是其药用部位块茎变异幅度更大，有圆形、椭圆形、长椭圆形、葫芦形、纺锤形或团块状等。
三叶青的群落结构复杂，伴生植物丰富，近年来野生资源遭受人为破坏十分严重，在我省的分布地已经很狭窄，资源蕴藏急剧减少，据统计其药材总蕴藏量仅有约24441.20kg，已远远不能满足市场需求，价格居高不下，近几年上涨幅度大，且有进一步攀升之趋势。
因此在加强三叶青野生资源种质保护的同时进行三叶青驯化栽培、育种、野生抚育等方面的研究，在广大农村地区进行推广种植，有利于三叶青资源的持续利用。
本项目的研究旨在为扩大野生三叶青的资源，加速三叶青栽培和开发提供新技术；本研究还为开展该物种遗传育种和保护生物学等方面的研究提供了良好的试验基础，具有广泛的应用前景；利用快繁技术繁殖三叶青，可以提高土地利用率开辟了新的途经，对农业结构调整和贫困山区的经济发展具有重要的现实意义和长远的历史意义；还可以保持自然界生物多样性向人们提供丰富的三叶青种质资源，解决三叶青药材来源匮乏的问题，满足人民用药需要，可实现可持续性发展。
而且也可以改进市场三叶青的供应和提高三叶青药材的品质，以及为相应品种的深度系列开发提供研究基础。
此外，对探讨药用观赏植物的人工驯化栽培、盆栽培养和快速繁殖均有一定的创新价值，故研究三叶青的生态栽培和快速繁殖等方面技术研究有重大的经济和科研价值。
二、国内外研究现状和发展趋势
目前国内外对三叶青的研究主要集中在化学成分、药理以及生药鉴定等方面，钟晓明等通过研究三叶青提取物（包括总黄酮、总氨基酸及多糖成分）对CCl4致急性肝损伤小鼠的保护作用，发现其能够明显降低肝损伤小鼠ALT（谷丙转氨酶）、AST（谷草转氨酶）的增高，减轻肝细胞变性，炎症浸润及坏死等病变；降低肝中MDA（丙二醛）生成量。
伍昭龙等同时开展了三叶青水煎液对CCl4致大鼠急性肝损伤的保护作用研究，研究结果表明，该中药除能降低肝损伤大鼠血清ALT、AST及MDA水平外，还能降低ALP（碱性磷酸酶）水平；而SOD水平明显升高。
基于钟晓明等研究基础，黄真和毛庆秋深入研究了三叶青总氨基酸对CCl4诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用，研究结果显示，其能够明显降低急性肝损伤小鼠ALT和AST活性升高，同时还能降低肝脏指数及肝中MDA生成量，提高肝中SOD活性，减轻肝细胞变性、炎症浸润及坏死等病变。
杨雄志采用小鼠尾静脉注射BCG和LPS方法成功造出免疫性肝损伤模型，该模型小鼠血清转氨酶和LDH（乳酸脱氢酶）显著升高，肝匀浆MDA的含量也显著升高，但SOD水平明显降低；对照病理模型组，杨雄志发现不同剂量的三叶青提取液给药组小鼠血清ASTALTLDH的水平降低肝损伤不同程度减轻，研究结果表明，三叶青提取液对BCG和LPS诱导的小鼠免疫性肝损伤具有良好的防护作用。
恶性肿瘤的治疗目前在医学界尚无理想的药物和方法，且此类疾病药物耐受性明显增高，但同时中医中药及有关营养支持疗法为治疗恶性肿瘤开辟了新途径。
据1998年报道三叶青的乙酸乙酯溶部分主要成分为6’-0－苯甲酰基胡萝卜甙（6’－O－benzoyldau－costerol）具有一定的肿瘤抑制和抗病毒作用；丁钢强等2005年研究发现，三叶青提取物中乙酸乙酯溶部分对人肝癌细胞HepG2活性具有较强的抑制作用正丁醇部分也有一定的作用，有力支持和验证了以上研究结果。
研究同时发现，三叶青提取物对正常原代培养的大鼠肝细胞活性没有明显的影响，对LDH活力影响也较对HepG2要小，提示三叶青的各部分提取物对正常细胞影响较肿瘤细胞要小，在此基础上魏克民等2007年深入进行了三叶青抗恶性肿瘤机制的实验研究，结果表明，三叶青提取物对人肝癌细胞HepG2活性具有较强抑制作用，研究结果再次证实三叶青提取物中乙酸乙酯溶部分的确具有很好的肿瘤细胞毒作用；魏克民等还发现，三叶青提取物对小鼠HepG2细胞的端粒酶基因表达有抑制作用，并有增强小鼠细胞免疫和体液免疫功能的作用，而对正常原代培养的大鼠肝细胞活性没有明显影响。
临床上令人振奋的是魏克民等用三叶青、黄芪、人参皂苷配制而成的金芪片治疗恶性肿瘤120例，完全缓解52例，部分缓解42例、稳定18例、进展8例，缓解及部分缓解共94例，总有效率78．33％；姜初明和龚黎燕采用清热解毒为主，健脾行气活血为辅的中肝合剂，含三叶青配合西药治疗Ⅲ期原发性肝癌，提高了Ⅲ期原发性肝癌患者生活质量，延长了其生存时间。
同时发现，国内外对三叶青的生物学和栽培繁殖特性上研究的比较少，目前只有沈宗根、戴雅娟、吕洪飞等人研究了不同遮荫处理对三叶青光合作用，叶绿素荧光以及叶绿素含量的影响，对于三叶青人工繁殖和生态栽培技术的研究却很少报道，国内学者只研究了用三叶青进行人工繁殖技术，但成活率低，产量不高，尚未见其三叶青种质筛选方面的报道。
由于三叶青具有很高的药用和观赏价值，药材市场三叶青需求量很大，而人工繁殖又很少，人们开始大量采集野生三叶青，导致野生三叶青资源锐减。
笔者在其它园林植物人工繁殖的基础上，以三叶青为试材,对三叶青的引种和快速繁殖进行研究，利用茎叶进行容器苗的快速繁育，使三叶青的工厂化生产成为可能，从而解决三叶青药材来源匮乏的问题，满足人民用药需要，并能带来可观的经济效益，同时还可以保护野生三叶青的资源。
二十世纪80年代以来广大科学工作者一直从事三叶青块根（三叶青）的化学成分、药理以及生药鉴定等方面的研究。
本世纪初也有学者开始研究了三叶青生长发育与光照强度、温度、激素、pH值的关系和三叶青的人工繁殖技术。
总之，对三叶青的化学成分、药理作用的研究已经很多，未来对三叶青的研究发展趋势主要是对其块根形态发育以及三叶青的种质筛选及高效生态技术等方面进行研究。
综观国内外的药用植物栽培动态可以看出，三叶青发展正呈现出这样几个基本趋势：
三叶青生产消费总量在持续上升；三叶青产业化、科学化程度迅速提高；三叶青育种工作加强、质量不断提高；在重视经济效益的同时，兼顾社会效益和生态效益；注重研究三叶青的生物学特性，加强三叶青种植、推广的适应性与针对性；形成集团企业，集三叶青研究、种植、推广、加工、销售等等。
因此，针对三叶青驯化栽培技术研究、标准化栽培技术制定和推广，开展三叶青有效成分的分析、三叶青种源收集、优良种质筛选及高效栽培研究是非常必要的。
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[16]DingGangqiang,YuMing,GongWeiwei,etal1Nutrition-relateddiseaseanddeathinZhejiang
二、市场需求、经济、社会、生态效益分析
（一）市场需求分析
三叶青是一种用途广泛的中草药，含黄酮类如槲皮素及三萜类化合物、蒲公英萜醇等重要有效化学成分，在临床上已广泛用于抗癌及抗艾滋病毒、治疗血液病与心脑血管疾病、肝炎、脑膜炎、急性支气管炎、肺炎、肠炎及咽喉炎、小儿外感高热等疾病。
以三叶青为主要原料成功研发的中成药金芪片、金丝地甲胶囊是具有中国特色的新一代防治恶性肿瘤药物，特别是三叶青的抗癌疗效被发现和应用后，三叶青的价格飞速上涨，在市场上供不应求，由下表可知，2006年平均价格只有85元/kｇ到2010年上涨到250元/kｇ，是2006年价格的2.9倍，外对三叶青的研究方兴未艾，研究不断深入，其药用价值不断被开发和利用，且野生资源日渐枯竭，栽培资源需要周期长，其价格必然会继续攀升。
年份
平均价格元/kg-1
增长率/%
2006
85
-
2007
120
41
2008
150
25
2009
180
17
2010
250
28
（二）经济、社会、生态效益分析
1、经济效益分析
本项目采用生态高效栽培，包括容器盆栽及间套种技术，试验期间三叶青每亩可获得净收益20万元，150亩三叶青实现净收益3000万元。
三叶青是多年生常绿植物，一次种植科连续收获，随着栽培技术的提高，今后单位面积产量还可逐年递增。
因为三叶青高投入、高风险、高科技，所以利润很高，效益非常明显。
如果考虑其深加工的潜力，经济效益更加可观。
该项目的实施可增加产量60%左右，150亩每年可增加净收益1800万元。
下图是试验区三叶青栽培模式：
图1三叶青高效栽培方式研究
图2三叶青套种技术研究
图3经过筛选的三叶青栽培形成的发达的块根
2、社会效益分析
（1）本项目的实施，能使我市三叶表生产率先实现集约化、标准化，从而改变了目前三叶青种植业品质低下、技术含量低的传统模式，促进我市乃至浙江省中药材产业的可持续发展。
（2）本项目建成至少可解决50至60人的劳动就业，同时直接带动发展其他就业人员140人以上，并通过提供种子种苗、技术培训、产品订合同办证收购等方式带动周边中药材生产基（3）通过本项目建设，以公司为龙头，联结广大农户，通过“公司+基地+农户”的模式发展优质三叶青产业，全面利用高新技术和新品种与人工栽培生产新工艺等，劳动生产效率和资源的有效利用明显提高，从而进一步提高三叶青产品的附价值。
3、生态效益分析
项目实施后，可开发山区部分荒地复耕，提高土地的综合利用。
从耕地资源的角度看，耕地是一种极为宝贵的、不可再生的资源，这对于缓和及解决日益严重的耕地问题，有着深远的意义。
从种质资源保护的角度看，公司充分研究利用当地的中药材资源，保护了野生三叶青资源，有助于维护当地生态平衡。
三、项目主要研究开发内容、技术关键
（一）进行优良品种质筛选及品种选育。
开展种源与无性系选择，并筛选可大力推广的高品质优良三叶青。
项目采用野生种子，筛选原原种，采集种子和外植体进行人工仿野生条件下的栽培。
（二）对三叶青的人工组织培养技术、小苗培养技术、改进大田栽培技术等方面进行深入探索研究。
1、人工组培育苗
筛选用2—3个培养基与原来采用的培养基比较、观察后，选定最佳培养基进行愈伤组织培养、扩繁。
目标要求：
组培过程即由原种外植体进行组培——愈伤分裂。
培养小苗的过程中，愈伤分裂速度加快，幼苗根系发达，分叶清爽，整个过程时间缩短7个月。
2、小苗扩繁后，通过驯化炼苗达到壮苗出圃的过程中，通过假植基质的选用、改进种植方法、严格控制肥水管理的同时，采用“脱离净化条件下的自然光炼苗”的技术方法。
既便于管理，出苗率由原来的70%—80%提高到90%以上，同时又能节约30%的电能，节省了成本。
在2011年试验中已得到验证。
（三）壮苗培育、生态复合间混栽培安全高效生产技术。
栽后促早发、减少僵苗、死苗，采用种植基质改良，调整基质配比，进行营养土容器栽培。
大棚排灌畅通，安装喷灌、雾喷设备，夏天防晒防高温，降温安全度夏。
冬天盖膜防冻，确保安全过冬。
春秋通过保护地栽培法延长三叶青生长最适温度的时间。
成品苗成活率由原来的40%—50%提高到90%。
（四）通过一定的栽培环境和技术控制，保证三叶青中黄酮类有效成分的含量，达到甚至超过野生三叶青的含量水平，在保证其品质的前提下提高单位面积产量，尤其大棚栽培产量，实现批量生产，并达到有机食品生产标准要求。
四、预期目标（要达到的主要技术经济指标；自主
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