体外诊断试剂胶乳比浊法学习之欧阳化创编.docx
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体外诊断试剂胶乳比浊法学习之欧阳化创编
胶乳免疫比浊法相关知识
时间：
2021.02.12
创作人：
欧阳化
很多公司开展了荧光胶乳免疫层析做定量分析及胶乳增强免疫比浊分析项目，关注胶乳标记技术的技术人员越来越多。
本人总结了部分胶乳微球标记技术，并加以分类，以便朋友们查阅：
胶乳微球物理吸附：
反应微球带磺酸基、羧基、醛基表面的都是疏水微球，都可以用来设计被动吸附蛋白。
磺酸基微球表面含带有负电荷的磺酸基团，pka大约为2，因此在酸性pH保持稳定。
醛基微球表面也带有磺酸基团，但能和蛋白行程共价键。
羧基微球表面含带负电荷的羧基基团，在pH5.0以上时保持稳定。
带有疏水基团的蛋白的吸附和配位结合，是最简单和直接的标记方法。
这种方法中，微球溶液和含目标蛋白的溶液混合，反应后，未结合的游离蛋白通过清洗步骤除去，从而获得胶体蛋白复合物。
疏水吸附方法只能用于疏水微球（硫酸盐、羧基、醛基表面修饰的微球）。
醛基表面修饰微球是一个特例，其疏水吸附结果取决于后来的共价结合。
虽然物理吸附是不依赖pH的，但反应缓冲液的pH对蛋白的结构有非常大的影响，从而影响蛋白吸附到微球上的反应效率。
一般，在被吸附蛋白等电点附近pH时，物理吸附效率会很高。
反应步骤：
1. 用反应缓冲液系数蛋白到10mg/ml；
2. 用反应缓冲液系数胶乳微球到1%；
3. 将蛋白溶液加入到胶乳微球溶液中，10ml胶乳中加入1ml蛋白溶液。
室温搅拌孵育2hr；
4. 离心或超滤，除去未结合蛋白；
5. 将微球蛋白复合物用储存缓冲液溶解。
注意事项：
1. 最优蛋白标记量影响因素
1） 有效比表面积：
粒径减小时，比表面积/mg微球值得增加；
2） 胶体稳定性：
蛋白对胶乳有稳定和去稳定作用；
3） 免疫反应：
最近标记量由免疫反应需要决定。
2. 胶乳微球中加入蛋白后，快速搅拌混合，利于反应均衡。
反应体积是1ml时，可用移液器吸取蛋白加入微球中，并吹打数次。
如果反应体积较大时，用烧杯，边搅拌边加入蛋白，
3. 储存缓冲液和反应缓冲液不同时，抗体有脱落的可能；
4. 表面活性剂能使得抗体从胶乳中脱落，所以应避免加入。
微球共价结合抗体方法：
一、一步法
1. 准备50mMpH6.0的reactionbuffer，醋酸或MESbuffer更合适
2. 用reactionbuffer溶解抗体，使其浓度为1mg/mL。
3. 用reactionbuffer悬浮微球，使其浓度为1%w/v
4. 边搅拌边将一倍体积的抗体溶液加入到10倍体积的微球悬液中，室温下持续搅拌20分钟
5. 准备浓度为10mg/ml（52umol/mL）的EDC溶液，用前准备，现配现用。
6. 将计算需求量的EDC溶液加入到上述微球悬液中。
（Note6）.
7. 室温下，立即调节pH（Note7）.
8. 移除未结合的蛋白，并将包被微球用storagebuffer重悬。
（Note3and4）
B.两步法
为了避免EDC将相邻微球之间的蛋白偶联导致微球聚集或者蛋白之间交流，两步法偶联抗体更合适。
两步法中，在蛋白加入之前，多余的EDC被移除。
两步法中，蛋白也可以使用更高pH的buffer来溶解，从蛋白的稳定性方面和加速蛋白和活化微球之间的交联速度方便考虑，是非常有利的。
B1简单一步法：
1. 准备50mMpH6.0的活化buffer，醋酸或MESbuffer更合适；用活化buffer悬浮微球，使其浓度为1%w/v
2. 每ml微球悬液加入20mg的EDC，室温孵育20分钟，然后再次加入20mg/mL的EDC，继续室温孵育20分钟。
（Note7）.
3. 离心或超滤，用等体积的包被缓冲液清洗两次微球，最后悬浮在包被缓冲液中。
（Note3）.
4. 用包被缓冲液溶解抗体到1mg/mL，包被缓冲液pH7~9，浓度为50mM~100mM。
（Note1）
5. 将抗体快速加入的搅拌中的微球悬液中，持续搅拌，室温孵育2~5小时。
（Note2）.
6. 每ml反应溶液中加入2.5ul的乙醇胺，持续搅拌并室温孵育10分钟。
（Note9）.
7. 离心或超滤，用储存缓冲液悬浮，重复两次，移除未结合的抗体和乙醇胺。
（Note3and4）
B2.NHS中间活化酯两步法
在此方法中，在EDAC存在下，NHS通过与微球上的羧基反应形成中间活化酯。
活化酯比EDC更稳定，不易水解。
1. 每ml反应混合物加入以下成分：
?
加入DIW，定容最终体积为1ml；
?
0.1ml10X的MESbuffer，ph6.0~6.5（10X的buffer通常用0.5M）；
?
0.1ml10%的微球（终浓度为1%）；
?
0.23mlNHS水溶液（50mg/mL）;11.5mg
?
一定体积的19.2mg/ml（100mM）的EDAC水溶液；
2. 室温下搅拌反应15~30min；（Note7）
3. 清洗：
MESbuffer或DIW清洗两次；（Note3）；
4. 用DIW冲悬浮微球到浓度为1%；
5. 同时，用包被buffer溶解稀释抗体。
buffer一般为ph7~9，50mM~100mM。
最终的蛋白浓度1mg/mL;
6. 清洗完微球后，立即加入一定体积的抗体溶液。
（Note2）。
（注意：
此处给出的例子，微球浓度和蛋白浓度和buffer分别为0.5%（w/v），0.5mg/mL，25~50mM）;
7. 室温下搅拌孵育2hr；
8. 每ml反应液中加入2.5ml乙醇胺，室温搅拌孵育10~30min；
9. 清洗：
storagebuffer清洗两次。
（Note3/4）
NOTES:
1. reactionbuffer的组成根据蛋白种类的不同而改变，常用buffer有醋酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、MES缓冲液。
蛋白在等电点附近更易于吸附到微球上，因为在等电点附近，蛋白表面会有更多的疏水位点暴露出来。
在这种情况下，抗体也更紧密，因此需要更多的抗体用于标记到微球上。
然而，最终reactionbuffer的选择，需要考虑最终抗体微球复合物的生物活性，因此，几个不同浓度的抗体和不同pH的反应buffer应该进行优化选择。
起始实验，反应buffer的离子强度应该在25~50mM。
2. 蛋白溶液应该在快速的搅拌下，快速加入到微球悬液中。
小体积的话，可以进行斡旋混合。
当大体积时，应该在烧瓶或烧杯里搅拌剧烈些，蛋白溶液快速加入到漩涡中间。
3. 移除未结合的化合物或蛋白，如果颗粒直径大于0.2um，可以通过离心的方法，微球可以重新悬浮，然后搅拌，接着温和的超声分散。
离心力不宜过大，这样会导致微球不易分散。
也可以用超滤或透析来纯化。
当用超滤时，滤膜孔径应该足够大，使得游离的蛋白能自由的通过滤膜。
用于清洗微球的buffer应该和storagebuffer一样。
用于清洗的buffer的任何缓冲液成分及pH的改变，都会引起蛋白的脱落。
4. 微球包被抗体后，加入表面活性剂或者去污活性成分，可能会导致抗体脱落。
如果是共价结合到微球上，共价结合的抗体就不会有脱落现象发生。
封闭蛋白，像BSA，casein或gelatin可以用来封阻任何空余的疏水性位点，防止微球发生非特异性凝集。
但是表面活性剂可以将那些共价结合不牢固的抗体洗脱下来。
5. 此试剂和水反应，因此，溶解后应立刻使用掉。
6. EDC的用量，根据微球表面羧基浓度来计算。
根据计算所需量，每mol的羧基应该再多加2~3mol的EDC。
但是，根据功能性检测结果，还需要进一步的优化。
7. 此步骤，微球的凝集经常能观察到。
因为接下来的步骤中，EDC会将相邻两个微球上的抗体连接起来从而引起微球凝集或者中和微球表面的羧基或者两者情况都发生。
调节pH到6.5或超过6.5，优化共价反应，对微球的分散有帮助。
如果反应结束后微球凝集现象仍然发生，用新鲜的buffer清洗除去多余的EDC和游离的蛋白，一般会使得凝集颗粒再分散。
如果在最终的产品中凝集依然发生，尝试稀释微球，一开始可以稀释到原来的50%浓度。
如果稀释后凝集依然发生，可以尝试在所有reactionbuffer中加入Tween20或TergitolNP9等非离子型表面活性剂。
这些表面活性剂不会干扰颗粒的活性或共价结合，但是需要注意的是，要确保在这种去污剂存在下微球共价结合的抗体的稳定。
9.加入乙醇胺，可以和加入蛋白反应后多余的羧基位基团反应。
胶乳标记过程中常见问题：
1）问题：
蛋白无法吸附到微球上。
解决方法：
加入更多的蛋白；去除微球中的表面活性剂，释放其占据的蛋白结合位点；引入中间物，将微球与蛋白相连；改变缓冲液。
2）问题：
标记时加入了大量的蛋白，但是仍然无活性。
解决方法：
改变蛋白加入量，从而改变蛋白与微球结合的空间构象；使用表位稀释物，占据微球上的部分蛋白结合位点，防止蛋白靠的太近。
3）问题：
清洗去除未吸附蛋白后，微球聚集。
解决方法：
增加蛋白标记量或封闭剂的用量，防止有空余位点；
4）问题：
标记后开始活性很好，储存一段时间后，活性降低。
解决方法：
降低储存温度到2~8度；降低储存液中的封闭剂浓度，防止抗体被替换；确认储存液中无能与抗体竞争的杂质，防止长时间取代抗体。
5）PS微球与蛋白（抗体）交联后，当时没发现有凝集，但隔夜后发现有凝集
是偶联效率低的原因。
当体系蛋白不足或是其它原因，使微球表面在交联后还空出许多反应基团时，由于这些基团又可以与相连微球上的蛋白反应，结果是把球又拉在一起了，所以有聚集。
可以加一些blockeragents解决,常见的是BSA，另外，也可提高微球的交联率。
但为什么是过一段时间后才出现凝集呢，这是因为微球偶联上蛋白后，相互之间由于携带同种电荷的关系，比较稳定（所以能以胶体样存在），只有当偶尔相互碰撞，遇上彼此的反应基团时才能结合。
6）抗体偶联至羧基PS球，即时检测效果很好，但置于37度2天后，抗体活性似乎下降很大。
可能共价结合未成功，如果是这样，那么最主要的原因是EDAC质量差或过期了。
EDAC长期放在空气中会吸潮，水汽会降低EDAC活性。
另一个可能原因是凝集。
观察胶乳是否有凝集产生。
还有，交联蛋白前有没有清洗？
我们提供的胶乳缓冲液中含有表面活性剂，可能干扰抗体的结合。
如果未发生凝集，而且用前已经清洗，那么我们建议换新的EDAC。
7）EDC活化羧基乳胶微球后，加蛋白（抗体）即时有沉淀出现，是什么原因？
很多因素可以导致蛋白加入后，微球聚集成块。
通常，蛋白偶联前的聚集与缓冲液（电解质）有关。
可能是羧基没有活化好。
EDC质量出现问题了，请换质量好的再尝试。
如果没有好的EDC，可以适当调低活化缓冲液的pH值。
对非修饰微球，那么可以从以下方面着手解决：
绝大多的微球制备过程中，加有脂肪酸乳化剂。
在聚合时，它起乳化作用，在聚合后，它起稳定剂作用，使微球以胶体样分布。
在碱性pH下，微球表面的COOH，脂肪酸分子上的COOH以及聚苯乙烯多聚链末端的硫酸根（SO42-）使微球表面带负电荷，亲水性增强，从而能形成稳定的胶体。
由缓冲液导致的聚集可以通过加蛋白，阴离子乳化剂，非离子乳化剂（如TritonX-100和Tween-20）。
下列方法供参考：
a）加入蛋白前，加少量的乳化剂。
具体量可以自己摸索掌握，太多的乳化剂可能会占据微球表面，影响蛋白偶联
b）少数研究人员选择用含少量蛋白的缓冲液冲洗微球（可以降低体系中的离子强度）
c）适当降低缓冲液的浓度，但不能使蛋白变性。
d）稀释微球，使微球间距离加大，减少相互结合的机会
e）如果有可能，加大偶联蛋白的浓度
f）偶联时，将微球加入蛋白液中，而不是将蛋白加入微球中
g）偶联时，振荡加快反应
总之，其原则是在微球与蛋白偶联前，减少其在高离子强度下与其它微球接触的机会。
在偶联结束后，由于微球表面接有的蛋白，会非常稳定。
时间：
2021.02.12
创作人：
欧阳化
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