选择性产生雄性或雌性不育植物的方法专利.docx

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选择性产生雄性或雌性不育植物的方法专利

选择性产生雄性或雌性不育植物的方法

CN1639344A

摘要

本发明公开了一种生产雄性或雌性不育植物的方法，该方法包括步骤：

用多核苷酸转化植物材料，该多核苷酸编码至少一种与非毒害植物的物质反应产生毒害植物物质的酶，再生这种转化的材料为植物，其中不超过雄性或雌性配子形成和/或成熟的时期，向所述植物施用所述非毒害植物的物质，由此，非毒害植物的物质提供了毒害植物的物质的产生，该毒害植物的物质选择性阻止了所述配子的形成或使其没有功能，其中酶优先在雄性或雌性生殖结构中表达，其特征在于：

（i）非毒害植物的物质选自：

对非绿色组织有直接植物毒性的非膦酸酯除草剂的酯衍生物，D－α氨基酸，非蛋白质D－α氨基酸的肽衍生物，芳氧基苯氧丙酸类的S－对映体和芳氧基苯氧丙酸的酯衍生物的S－对映体，和（ii）酶选自：

羧酸酯酶、D－氨基酸氧化酶、D－氨基酸脱氢酶、D－氨基酸消旋酶、2－芳基丙酰－CoA差向异构酶、α－甲酰基－CoA消旋酶、硫酯酶和酰基－CoA合成酶。

权利要求（20）

1.一种生产雄性或雌性不育植物的方法，该方法包括步骤：

用多核苷酸转化植物材料，该多核苷酸编码至少一种与非毒害植物的物质反应产生毒害植物的物质的酶，和将由此转化的材料再生为植物，其中不超过雄性或雌性配子形成和/或成熟的时期，向所述植物施用所述非毒害植物的物质，使得非毒害植物的物质提供毒害植物的物质的产生，该毒害植物的物质选择性地阻止所述配子的形成或使其没有功能，其中所述酶优先在雄性或雌性生殖结构中表达，其特征在于：

（i）非毒害植物的物质选自：

对非绿色组织有直接植物毒性的非膦酸酯类除草剂的酯衍生物，D-α氨基酸，非蛋白质D-α氨基酸的肽衍生物，芳氧基苯氧丙酸类的S-对映体和芳氧基苯氧丙酸类的酯衍生物的S-对映体，和（ii）所述酶选自：

羧酸酯酶、D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脱氢酶、D-氨基酸消旋酶、2-芳基丙酰-CoA差向异构酶、α-甲基酰基-CoA消旋酶、硫酯酶和酰基-CoA合成酶。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述非毒害植物的物质与至少一种另外的物质一起混合施用，所述另外的物质选自：

安全剂、杀配子剂、谷胱甘肽-S-转移酶诱导物、细胞色素P450诱导物、除草剂、肥料、杀线虫剂、增效剂、杀虫剂、杀真菌剂、激素、植物生长调节剂和细胞色素P450抑制剂。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中叶面施用非毒害植物的物质，且该非毒害植物的物质是所述酶的韧皮部可移动的和代谢稳定的可氧化底物，其中该酶提供了做为来源于非毒害植物物质的直接或间接产物的毒害植物的产物。

4.如前述权利要求所述的方法，其中毒害植物的产物是以过氧化物和/或超氧阴离子形式产生的间接产物。

5.如权利要求3或4任一权利要求所述的方法，其中非毒害植物的物质是D-α氨基酸，其选自：

D-丙氨酸、D-缬氨酸、D-甲硫氨酸、D-丝氨酸、D-亮氨酸和D-异亮氨酸，所述的酶是D-氨基酸氧化酶或氧化还原酶，其氧化所述氨基酸为2-酮酸，同时伴随着氧原子还原为过氧化物阴离子。

6.如权利要求3或4任一权利要求所述的方法，其中非毒害植物的物质是D-天冬氨酸或D-谷氨酸，所述酶是D-氨基酸氧化酶或氧化还原酶，其氧化所述的氨基酸为2-酮酸，同时伴随氧还原为过氧化物阴离子。

7.如前述权利要求所述的方法，其中酶是从纤细红酶母（Rhodotorula gracilis）获得的突变D-氨基酸氧化酶，该氧化酶与野生型序列相比，在位置213和/或238包含置换，或者是D-天冬氨酸氧化酶。

8.如前述权利要求所述的方法，其中从红酵母属（Rhodotorula）获得的氧化酶在位置213具有选自Arg，Lys，Ser，Cys，Asn和Ala的氨基酸，和/或在位置238具有选自His，Ser，Cys，Asn和Ala的氨基酸。

9.如权利要求3-8任一权利要求所述的方法，其中所述酶不靶向过氧化物酶体。

10.如权利要求1或2所述的方法，其中所述酶是羧酸酯酶，非毒害植物的物质是咪草酸的酯或氟燕灵的酯。

11.如前述权利要求所述的方法，其中非毒害植物的物质是咪草酸甲酯，氟燕灵甲酯或氟燕灵异丙酯，植物是小麦或本身同样对咪草酸甲酯，氟燕灵甲酯或氟燕灵异丙酯基本上不敏感的植物。

12.如权利要求1或2所述的方法，其中所述酶是D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脱氢酶或D-氨基酸消旋酶，非毒害植物的物质是膦丝菌素的D对映体或双丙氨酰膦的D对映体。

13.如权利要求1或2所述的方法，其中非毒害植物的物质包含在混合物中，该混合物含有毒害植物的物质，其中酶是D-氨基酸氧化酶或氧化还原酶，所述酶能将氨基酸氧化为2-酮酸，同时伴随氧还原为过氧化物阴离子。

14.如前述权利要求所述的方法，其中酶是从纤细红酶母（Rhodotorula gracilis）获得的突变D-氨基酸氧化酶，该氧化酶与野生型序列相比在位置213和/或238包含置换，或者是D-天冬氨酸氧化酶。

15.如前述权利要求所述的方法，其中从红酵母属（Rhodotorula）获得的氧化酶在位置213具有选自Arg，Lys，Ser，Cys，Asn和Ala的氨基酸，和/或在位置238具有选自His，Ser，Cys，Asn和Ala的氨基酸。

16.如权利要求13-15任一权利要求所述的方法，其中混合物包含D和L膦丝菌素，并且植物材料基本上仅在绿色组织中和产生配子的花组织中表达PAT基因，该配子不是那些使得其没有功能的配子。

17.如权利要求1或2所述的方法，其中酶选自：

2-芳基丙酰-CoA差向异构酶、α-甲基酰基-CoA消旋酶、硫酯酶和酰基-CoA合成酶，其中非毒害植物的物质是芳氧基苯氧丙酸类的S-对映体和芳氧基苯氧丙酸酯类的S-对映体。

18.如前述权利要求所述的方法，其中所述的芳氧基苯氧丙酸的S-对映体选自：

S-吡氟禾草灵、S-喹禾灵、S-喔草酯、S-吡氟氯禾灵、S-噁唑禾草灵、S-氟甲草、S-Cyhalofop和S-炔草酯。

19.一种产生对映体纯的D-膦丝菌素（D-PPT）的方法，包括步骤：

（a）提供包含酶的细胞，该酶具有选择性N-酰化PPT的能力；（b）在含有D-L PTT的培养基中生长所述细胞以产生条件培养基；（c）从（b）的条件培养基分离细胞；（d）可选地，在各种pH，用非水性、非混溶的溶剂萃取条件培养基，使得含有PPT的级份与含有水溶性比PPT大的分子的级份分离；（e）可选地，以足以从培养基吸附相当比例除PTT外的阳离子的量和pH，混合质子化形式的阳离子交换树脂和条件培养基或步骤（d）的含有PPT的萃取培养基；（f）以足以结合培养基中大部分PPT的量和pH，混合质子化形式阳离子交换树脂和条件培养基、萃取培养基或来源于步骤（e）的培养基，（g）收集步骤（f）的PPT结合的阳离子离子交换树脂，并且利用有足够pH和离子强度的洗脱介质从该树脂选择性洗脱PPT，条件是所述洗脱介质的pH不至于低到引起由此洗脱的PPT外消旋化。

20.具有至少98.5％对映体过量的D-PPT。

说明

选择性产生雄性或雌性不育植物的方法

背景技术

农作物植物中的杂种优势对产量提高有显著的影响。

一般地，杂种与非杂种品种比较显示了增加的产量。

杂种通常给予生长因子诸如水和肥料更多的回报单元（return unit）。

杂种常常提供优良的胁迫耐受性、产量和成熟的一致性，也提供了联合以其它方式难以联合的特性或性状的简单育种机会。

通常，植物中的杂种优势对于保证商业性开发足够重要。

商用杂种广泛地用于许多农作物包括玉米、高梁、甜菜、向日葵和芸苔中。

然而，主要是由于缺少经济性杂种种子的生产方法，所以主要还是以近亲交配培育小麦、大麦和水稻。

传统地，杂种种子生产涉及以一定行距种植分开区块的雌性和雄性亲本系，仅收获雌性亲本的种子。

为了确保该种子是杂种，必需通过使得该株系雄性不育来最小化雌性亲本系的自花授粉。

使得雌性亲本株系雄性不育的方法包括机械、化学和遗传方法。

在雌雄同株植物，诸如玉米中，通过去雄雄性花序可以机械地、容易地获得雄性不育。

然而，大多数农作物是雌雄异株，并且在相同的花朵中具有雄性和雌性器官，这使得这种物理去雄不实际。

因此有时利用遗传方法。

出现的遗传雄性不育性状正常地受核基因控制，核基因中通常相对于相应的能育相关的等位基因，不育表型相关的等位基因隐性地表达。

遗传雄性不育出现时正常地与单个隐性基因相关，而为了表达雄性不育，该单个隐性基因必需是纯合的。

为了实际利用这种遗传雄性不育性状，育种者通常开发表型一致的雌性株系，该雌性株系分离为雄性不育和雄性能育植物。

一旦鉴定雄性能育植物，就需要去劣，这是费力的。

因为雄性能育植物是种群维持所必需的，所以不能从种群中排除它们，所以维持亲本株系总是存在问题。

除了依赖于天然雄性不育等位基因的存在，也可以利用分子生物学的方法。

可以基因工程改造植物，使得植物表达例如反义或核酶基因，该反义或核酶基因减少或消除了能生育的花粉形成必需的关键基因的表达。

这种转基因的植物株系是雄性不育的，并且通过利用来源于雄性可育植物的花粉杂交，用于杂种种子的生产。

这种株系的主要问题是通过它们与等基因可育株系杂交，它们在随后世代中只能维持杂合状态。

这在产量是至关重要的杂种种子生产中可能是个问题。

尽管，例如，通过连接除草剂抗性和雄性不育，可以选择性去劣雄性可育植物，但是仍旧必需在最初以超高的密度种植植物。

胞质雄性不育用于商业杂种生产需要稳定的雄性不育胞质和花粉来源。

雄性不育的胞质遗传系统需要3种类型用于杂种生产的株系存在，A株系（胞质雄性不育），B株系（雄性可育维持系）和R株系（具有恢复系基因的雄性可育）。

该系统产生的三方面杂交涉及4种株系的维持和产生，一种近交的A和B株系，其它两种株系的雄性可育近亲交配。

依靠单一来源的雄性不育胞质可能最小化育种灵活性，并且产生对特定疾病具有大规模敏感性的后代。

也可以通过抑制能生育的花粉形成的化学试剂的应用生产杂种种子。

这些化学试剂称为杀配子剂，用于赋予短暂的雄性不育。

但是杀配子剂的费用、注册性和可靠性限制了它们的应用。

传统杂种种子生产系统的缺点是需要分开种植成排或成区块的雄性和雌性亲本株系。

这里，低效率的授粉是农作物物种，诸如小麦中特别棘手的问题，这种物种释放不能随风漂移很远的小量的花粉。

在这种农作物中，多达三分之二的杂种生产田地需要专门用于雄性花粉供体植物，因此杂种种子生产变得不经济。

为了在小麦和其它农作物中获得更经济的种子生产，必需移动雄性和雌性植物使得它们更靠近以进行更有效的花粉转移；通过在同一排中相互间隔几厘米间作雄性和雌性植物，以进行最有效的花粉转移。

在这种系统中，仅从（雄性不育）雌性亲本收获种子不实际。

通过在种植混合中利用尽可能低百分数的这种雄性亲本植物和/或通过利用雌性不育的雄性植物可以最小化来源于雄性亲本的非杂种种子的污染。

尽管已经描述了构建显性雌性不育株系的方法（EP 412,006 A1（1990）；Goldman等，（1994）EMBO.J.，13，2976-2984），但是，如同雄性不育株系一样，该株系必需保持为杂合子。

因此，需要杂种种子生产的简单、经济的方法。

特别地，为了有效地生产杂种种子，需要提供可以作为纯合株系容易维持并且可用于有效的杂种种子生产的雄性不育雌性亲本株系和雌性不育雄性亲本株系。

现有技术中所述用于达到该目的的方法包括这样的方法：

其中从雄性和雌性亲本株系生产杂种种子，该雄性和雌性亲本株系的至少一个亲本株系包含优先地在花组织中表达的异源嵌合基因，其根据非毒害植物的物质的外源施用，有条件地使得该株系不育，该非毒害植物的物质可以被异源嵌合基因编码并且优先地在雄性或雌性生殖结构中表达的酶特异地和局部地转化为毒植物素。

非毒害植物的物质可以是除草剂前体。

具有这种有条件不育亲本株系的优点是它使得它们能够做为关于不育性性状的纯合子维持。

只有外源施用非毒害植物的物质时，才破坏了可育性。

在一个这种条件性雄性不育性系统的例子中，编码脱乙酰基酶的基因优先地在雄性花组织的花药毡绒层细胞中表达，在该细胞中，它转化外源施用的除草剂前体N-乙酰L膦丝菌素为毒植物素L膦丝菌素，因此，阻止能生育的花粉形成。

在另一个相似例子中：

（i）细菌细胞色素P450的毡绒层优先表达催化除草剂前体R7402转化为阻止能生育的花粉产生的磺脲毒植物素和（ii）膦酸单酯水解酶的毡绒层优先表达催化甘油草甘磷除草剂前体转化为毒植物素草甘磷，其也阻止能生育的花粉的产生。

WO 98/03838描述了有条件雌性不育性系统的例子，其中能将除草剂前体转化为毒植物素的酶优先在雌性生殖结构中表达。

尽管存在生产有条件不育的雄性和雌性亲本系的这些方法，但是在农作物诸如小麦中，杂种种子的生产远远没有常规化。

本发明涉及，尤其是现有技术中关于有条件雄性不育的雌性亲本系和有条件雌性不育的雄性亲本系产生的改进。

发明内容

本发明涉及作物杂种种子生产方法的改进。

特别地，本发明涉及从雄性和雌性亲本系生产杂种种子的方法，其中该雄性和雌性亲本系的至少一个亲本系是有条件雌性或雄性不育，该有条件雌性或雄性不育取决于对作物是非毒害植物性的物质的外源施用，该物质包括除草剂前体。

本发明还涉及在一定时期和以足够的量施用所述非毒害植物的物质的方法，其中该时期和足够的量能够最小化或阻止有条件不育亲本系中的自花受精。

本发明也涉及也涉及产生有条件雄性或雌性不育植物的方法，该方法包括：

i）用单独或一起编码一种或多种酶的一种或多种嵌合基因转化植物材料，所述酶具有与优选地为除草剂前体形式的非毒害植物的物质反应以产生毒害植物物质的能力。

酶在一个或多个启动子可操作控制下表达，其中在有条件雄性不育植物的情况下，所述启动子引起酶优先在雄性生殖结构中表达，或者在有条件雌性不育植物的情况下，所述启动子引起所述酶优先在雌性生殖结构中表达。

植物材料再生为有条件雄性或雌性不育的形态学正常的可育植物。

本发明也包括有条件雄性不育植物联合有条件雌性不育植物以更有效生产杂种种子的用途，一些除草剂前体做为非毒害植物的物质的用途，和嵌合基因更有效地生产杂种种子的用途，用于本发明的嵌合基因和酶。

本发明也提供了有条件雄性不育，有条件雌性不育植物，这些植物的种子和通过该方法生产的杂种种子。

在本发明优选的实施方式中，生产杂种种子的方法应用的农作物植物是玉米、稻、高梁、小麦、黍、燕麦、芸苔（canola）和大麦。

根据本发明，提供了生产雄性或雌性不育植物的方法，该方法包括步骤：

用编码至少一种酶的多核苷酸转化植物材料，该酶与非毒害植物的物质反应以产生毒害植物的物质，并且将由此转化的材料再生为植物，其中不超过雄或雌配子形成和/或成熟的时间，给植物施用所述非毒害植物的物质，这样非毒害植物的物质提供了毒害植物物质的产生，该毒害植物物质选择性阻止所述配子形成，或者以其它方式使得所述配子没有功能，其中该酶优先在雄性或雌性生殖结构中表达，其特征在于：

（i）非毒害植物的物质选自：

对非绿色组织是直接毒害植物性的非膦酸酯除草剂（non-phophonate herbicides）的酯衍生物，D-α氨基酸，非蛋白质D-α氨基酸的肽衍生物，芳氧基苯氧丙酸类的S-对映体和芳氧基苯氧丙酸类的酯衍生物的S-对映体，和（ii）酶选自：

羧酸酯酶、D-氨基酸氧化酶、D-氨基酸脱氢酶、D-氨基酸消旋酶、2-芳基丙酰-CoA差向异构酶、α-甲基酰基-CoA消旋酶、硫酯酶和酰基-CoA合成酶。

因为期望的目的是最大化杂种种子产量和因此最小化任何农作物的损害，所以在优选的实施方式中，非毒害植物的物质是除草剂前体，该除草剂前体选自对农作物相对非毒害植物的化合物。

为了能够具有抗花组织的作用，也期望除草剂前体是在“非绿色”组织中有效的毒植物素的前体。

因此，在本发明优选的实施方式中，除草剂前体选自是毒植物素前体的那些除草剂前体，该毒植物素对非绿色组织具有直接植物毒性，而不是在光合作用或在光合作用色素产生中具有主要作用位点的那些。

最小化杂种种子生产的花费也是期望的目的。

因此，在优先的实施方式中，除草剂前体选自化学物质，该化学物质用在农作物中已经得到或正在受到适合的管理机关批准。

术语：

定义这里所用“基因”指包含几个可操作地连接的DNA片段的任何DNA序列，所述DNA片段是诸如启动子和5’调节区，编码区和包含聚腺苷酸化位点的非翻译3’区。

“嵌合”当指基因或DNA序列时，用于指在自然界中，编码序列不与基因中DNA的启动子或至少一个其它调节区相关的事实。

这里所用“嵌合基因”指一种基因，其中在自然界中，其编码序列不与基因中DNA的启动子或至少一个其它调节区相关。

这里所用的“表达盒子”指可转移的DNA区，包含侧翼有一个或多个限制或其它位点的嵌合基因，所述位点有利于从一个DNA基因座精确地切除并且插入另一个DNA基因座。

本发明上下文中“非毒害植物的物质”是对本发明方法应用的任何特定农作物的植物、细胞或组织相对非毒害植物的物质。

非毒害植物的物质不需要在所有植物的所有植物组织中都是非毒害植物的。

非毒害植物的物质包括除草剂前体物质，该除草剂前体是对植物组织没有明显直接毒性作用的物质，但是它是活性毒植物素的前体。

在敏感植物物种中，通过植物中将这种除草剂前体转化为毒植物素的内源酶作用，这种除草剂前体间接地做为除草剂。

在本发明上下文中“毒植物素”是本发明方法应用的特定农作物的植物、植物组织和植物细胞具有毒性的物质。

这种毒植物素不需要对所有植物物种的所有植物组织都是植物毒性的。

“雌性生殖结构”意指雌配子和那些专门用于雌配子产生、成熟和生育力的植物部分。

通常地，该定义包括包含心皮或雌蕊群（“雌蕊”）的植物部分。

植物的心皮包括但不限于柱头、花柱、子房和柱头、花柱、子房包含的细胞或组织。

“雄性生殖结构”意指雄配子和专门用于雄配子产生、成熟和生育力的植物部分。

该定义包括包含，例如小孢子、雄蕊、绒毡层、花药和花粉的植物部分。

这里所用的“雌性不育植物”是当有功能或能生育的花粉给其授粉时，不能支持能生育的种子形成的植物。

这种雌性不育性可以是育种选择或转基因存在的结果。

“有条件雌性不育植物”指在正常生长条件下是雌性可育，而在特定条件下可以变成雌性不育的植物。

在本发明上下文中，所述条件包括除草剂前体或其它非毒害植物的物质的外源施用。

在发明上下文中，这种“雌性不育植物”或“有条件雌性不育植物”保留了雄性可育并且能够产生能生育的花粉。

这里所用“雄性不育植物”是不能支持能生育的花粉形成的植物。

这种雄性不育性可以是育种选择或转基因存在的结果。

“有条件雄性不育植物”指在正常生长条件下是雄性可育，而在特定条件下可以变成雄性不育的植物。

例如所述条件可以包括物理去雄或特定化学杀配子剂的施用。

在本发明上下文中，所述条件特别地包括除草剂前体或其它非毒害植物的物质的外源施用。

在本发明上下文中，这种“雄性不育植物”或“有条件雄性不育植物”保留了雌性可育并且当有功能或能生育的花粉给其授粉时，其能够产生能生育的种子。

这里所用的“启动子区”是包含至少功能性启动子和可选地一些或所有它的相关上游调节序列和/或相关下游序列的DNA区，该上游调节序列包含增强子序列，该下游序列包含启动子内源性基因的一些或所有5’非翻译区。

这里所用“间作”指在大田中种植植物或种子的方法，该方法确保雄性可育植物对雄性不育或有条件雄性不育植物的充分异花授粉。

通过种植前，以不同的混合比例（80/20；90；10；等）随机混合雌性和雄性亲本种子，或者通过以特定的田地模式种植，由此使得不同种子交替可以达到该目的。

当需要分开收获不同植物时，优选以交替区块或排种植。

这里所用的“羧酸酯酶”仅仅包含正确分类为EC 3.1.n的酶。

在本发明方法中，所述非毒害植物的物质可以与至少一种其它物质一起以混合物形式施用，所述物质选自氨基酸、安全剂、杀配子剂、谷胱甘肽-S-转移酶诱导物、细胞色素P450诱导物、肥料、除草剂、杀线虫剂、增效剂、杀虫剂、杀真菌剂、激素、植物生长调节剂和细胞色素P450抑制剂。

在特定实施方式中，所述非毒害植物的物质可以与胡椒基丁醚或马拉硫磷以混合物形式施用。

在特定实施方式中，所述非毒害植物的物质可以与相同的毒害植物物质以混合物形式施用，其中所述非毒害植物的物质是毒害植物物质的前体。

本发明方法中所用的酶可以是羧酸酯酶，非毒害植物的物质可以是咪草酸（imazamethabenz）或氟燕灵（flamprop）的酯。

在具体涉及小麦的本发明特别优先的形式中，非毒害植物的物质是除草剂前体，该除草剂前体选自：

咪草酸甲酯（imazamethabenz methyl），氟燕灵甲酯（flamprop methyl）或氟燕灵异丙酯（flamprop isopropyl）。

所述酶可以是D-氨基酸氧化酶，D-氨基酸脱氢酶或D-氨基酸消旋酶，此时非毒害植物的物质可以是D氨基酸，特别地，它可以是膦丝菌素的D对映体，双丙氨酰膦的D对映体，或者选自D-丙氨酸、D丝氨酸、D异亮氨酸、D甲硫氨酸、D亮氨酸或D缬氨酸。

这里所用“D-氨基酸氧化酶”意指能氧化D-氨基酸以产生2酮酸的任何酶，并且包括对天冬氨酸特异的酶，称为“D-天冬氨酸氧化酶”。

做为替代技术方案，本发明方法中所用的酶选自：

2-芳基丙酰-CoA差向异构酶、α-甲基酰基-CoA消旋酶、硫酯酶和酰基-CoA合成酶，那么非毒害植物的物质可以是芳氧基苯氧丙酸的S-对映体和芳氧基苯氧丙酸酯的S-对映体。

编码酶的嵌合基因可以选自包含DNA编码序列的基因，其中该酶具有单独或与其它物质联合与非毒害植物的物质反应产生毒害植物物质的能力，该DNA编码序列编码一种或多种下面的酶：

（1）能催化水解反应的羧酸酯酶：

（2）能催化水解反应的羧酸酯酶：

和/或

（3）能催化氧化反应的D-氨基酸氧化酶：

和在一些实施方式中，特别地是反应

（4）能催化氧化反应的D-氨基酸脱氢酶：

D-氨基酸脱氢酶可以是膜相关酶，该膜相关酶通过电子受体将电子与结合膜的电子传递链偶联，通过该电子传递链，最终的电子受体可以是，例如NAD+或O2。

（5）能催化相互转化的氨基酸消旋酶：

D-膦丝菌素<>L-膦丝菌素（6）能催化下面一种或多种反应的2-芳基丙酰-CoA差向异构酶或α-甲基酰基-CoA消旋酶：

S-吡氟禾草灵-CoA→R-吡氟禾草灵-CoA和/或S-喹禾灵-CoA→R-喹禾灵-CoA和/或S-喔草酯-CoA→R-喔草酯-CoA和/或S-吡氟氯禾灵-CoA→R-吡氟氯禾灵-CoA和/或S-噁唑禾草灵-CoA→R-噁唑禾草灵-CoA和/或S-氯甲草-CoA→R-氯甲草-CoA和/或S-Cyhalofop-CoA→R-Cyhalofop-CoA和/或S-炔草酯-CoA→R-炔草酯-CoA（7）能催化水解反应的硫酯酶：

和/或和/或和/或和/或和/或和/或和/或

（8）能催化下列反应的酰基-CoA合成酶：

和/或和/或和/或和/或和/或和/或和/或和/或所述羧酸酯酶可以选自羧酸酯酶B（EC 3.1.1.1）类型酶，特别是来源于节杆菌属（Arthrobacter sp），芽孢杆菌属（Bacillus sp），猪肝脏，酵母属（Saccharomyces sp）或集胞藻属（Synechocystis sp）的羧酸酯酶。

优选的这种酶可以选自具有Swissprot记录号Q01470，P37967，Q29550（来源于60-1703的成熟肽序列），P40363或SEQID No.2（本申请）的蛋白质，并且编码羧酸酯酶的DNA序列可以选自包含在EMBL记录号M94965，BS06089，SSCE，Z34288和SEQID No.1（本申请）中的DNA序列。

适于本发明使用的其它羧酸酯酶和DNA编码序列从植物和微生物中选择，在基本培养基中，所述植物和微生物被发现对咪草酸甲酯的生长抑制显示了和对咪草酸的生长抑制相似的敏感性。

利用适合的DNA探针鉴定这种生物体DNA文库的候选酯酶基因，并且通过亚克隆分离该候选酯酶基因。

做为可替代的方案，通过筛选咪草酸甲酯敏感表型的转化体，从适合的咪草酸甲酯不敏感宿主生物体中的表达文库鉴定和筛选编码适合