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高级生物化学实验报告

小鼠GAPDH基因的克隆、表达 与鉴定

学号

学生姓名

指导教师

2016年4月12日

摘要

甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3·phosphatedehydrogenase，GAPDH）是一种分布在细胞质中、在糖酵解过程中起关键作用的酶。

但是近年来，越来越多的研究表明GAPDH是一种多功能蛋白，参与tRNA出核、mRNA稳定性调节、DNA损伤修复、组蛋白转录调控、凋亡及神经退行性疾病发生等。

在细胞质和生物膜上也有重要作用。

本文主要介绍利用基因工程实验技术操作GAPDH基因，采用Trizol法从小鼠肝脏组织中提取总RNA，并运用RT-PCR方法克隆了GAPDH基因，连接到pET28a载体上,并导入感受态的DH5α与BL21菌中筛选鉴定。

选取鉴定正确的转化BL21克隆诱导表达GAPDH蛋白质，用SDS-PAGE和WesternBlot鉴定。

关键词:

甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）；基因表达;载体；RT-PCR。

绪论

甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3·phosphatedehydrogenase，GAPDH）是参与糖酵解的一种关键酶，催化3-磷酸甘油醛转变为l，3．二磷酸甘油醛，同时以NAD+为受氢体生成NADH。

由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。

该酶基因为管家（housekeeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作抽提totalRNA，poly（A）+RNA，Westernblot等实验操作的标准化的内参。

近年来，研究发现GAPDH在细胞质、细胞核及细胞膜上均有定位，其表达量在转录及转录后水平受到调节，mRNA水平和蛋白水平会随着各种刺激而变化。

此外，还发现GAPDH在酵解功能以外还有多种功能，如在tRNA出核、mRNA稳定性、DNA损伤修复、组蛋白表达、TNF．a核酶活性、凋亡及年龄相关神经退行性疾病、微管聚合、小分子物质相互作用、细胞保护、膜融合和膜转运等方面均有调节作用[1]。

刘志华等应用酵母表达技术研究GAPDH功能的研究也发现GAPDH基因还具有抵抗逆境胁迫的功能。

当活细胞处在各种环境压力的条件下，例如高温、高盐、低温等胁迫，其基因表达模式将发生改变，证明该基因具有抗盐、碱和高温胁迫功能，是一种重要的抗逆境胁迫基因[2]。

此次，我们用RT-PCR方法克隆GAPDH基因，并重组到表达载体上进行了初步表达及表达产物的活性测定,为用基因工程菌生产GAPDH奠定基础。

1.材料

1.1试剂、仪器及实验用具

1.1.1仪器台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器，气浴振荡摇床（不需加水），制冰机，超净工作台，微波炉和电磁炉，电泳仪和电泳槽，恒温水浴锅，紫外分光光度计，PCR仪，通风橱，恒温细菌培养箱，凝胶成像仪，高压蒸汽灭菌锅，电泳转移仪，脱色摇床，瞬时离心机。

1.1.2实验用具剪刀,镊子,匀浆器,研钵（去除RNA酶），无RNA酶的eppendrof管，超净工作台，酒精灯，双面微量离心管架，试管架，记号笔,手表，摇菌试管，1.5mL离心管，0.5mL微量离心管，枪头（0～10uL，20～200uL，200～1000uL），100mL三角瓶，试管，1L量杯，1L定容瓶，涂布棒，凝胶成像系统，一次性薄膜手套等,0.2mLPCR微量管，泡沫塑料保温盒，培养皿，琼脂糖凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块, 垂直电泳槽及配套的玻璃板、夹子、密封条、梳子，电泳转移槽及转移夹，海绵块，滤纸，PVDF膜。

1.1.3试剂LB培养基，Kan青霉素储存液，无菌ddwater，100mg/mL（M/V）IPTG，1.0mol/LTrisHCl（pH8.8），0.5mol/LTrisHCl（pH6.8），SDS，Bis，Aps，2×上样缓冲液，TEMED，考马斯亮蓝染色液，5X电泳缓冲液，20%（M/V）IPTG，50XTAE电泳缓冲液，溴化乙锭储存液，10×加样缓冲液，6×加样缓冲液，电泳级琼脂糖粉，TaqDNA聚合酶，10×PCR缓冲液（MgCl2free），25mMMgCl2，dNTP混合液，10mg/mLRNaseA，TE缓冲液，95%和70%乙醇，XhoI,ApaI和BamHI限制性内切酶，10×内切酶缓冲液，0.1mol/LCaCl2溶液，T4DNA连接酶，连接酶缓冲液。

DEPC水，75%乙醇（DEPC处理的水配制），异丙醇,乙醇,氯仿，TakaraPrimeScriptTM1ststrandcDNAsynthesisKit试剂盒（TAKARACodeNo.6110A），TakaraPCRTaq高保真酶（含缓冲液，dNTP混合液），DL2000DNAmarker，DNA回收试剂盒（TAKARAminibestDNAFragmentpurificationkitver.4.0）,5%脱脂奶粉。

1.2菌种E.coliDH5α，E.coliBL21。

由基因工程实验室提供。

1.3  质粒 ：

表达载体：

pET-28a ，载体大小：

5369bp，载体抗性：

Kan。

1.4   常用溶液的配制 

1.4.1  LB 培养基：

胰化蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，5gNaCl 加水至950ml，搅拌完全溶解，用1mol/L调节pH至7.0，加 dd water定容至1000mL ，高压灭菌。

使用时可加入Kan青霉素。

1.4.2  50×TAE电泳缓冲液（pH约8.5）：

Tris碱242g,57.1ml冰乙酸，37.2g  

Na2EDTA·2H2O，dd water 定容至1L。

使用时稀释成1×。

1.4.3 琼脂糖凝胶：

称取0.25g琼脂糖粉，放入三角瓶，加入25ml 1×TAE 电泳缓冲液

（注意原液是50×，按照1:

49的比例稀释），用保鲜膜盖住，放入微波炉里烧开（30 s），取出观察，若无颗粒则置于桌面上冷却至不烫手即可灌胶，若仍然有颗粒状物，需要再继续加热，直至无颗粒后冷却灌胶。

1.4.4   pH8.8溶液：

36.6g Tris碱,1mol/LHCl48mL ,TEMED0.46mL。

先将Tris溶于少量水中，然后加入HCl，再加入TEMED，加蒸馏水定容至100mL。

高温高压灭菌后 ，4℃保存。

1.4.5    pH6.8溶液：

5.89g Tris碱,1mol/LHCl48mL ,TEMED0.46mL。

先将Tris溶于少量水中，然后加入HCl，再加入TEMED，加蒸馏水定容至100mL。

高温高压灭菌后 ，4℃保存。

1.4.6  分离胶液：

丙烯酰胺23g，单叉双丙烯酰胺0.735g，加水至100ml,先溶解单叉双丙烯酰胺，再加入丙烯酰胺。

定容后需滤去不溶物 ，4℃棕色瓶避光保存。

1.4.7  浓缩胶液：

丙烯酰胺10g，单叉双丙烯酰胺2.5g，加水至100ml,先溶解单叉双丙烯酰胺，再加入丙烯酰胺。

定容后需滤去不溶物 ，4℃棕色瓶避光保存。

1.4.8  过硫酸铵溶液：

0.3g过硫酸铵溶于水中至100ml,4℃保存，一周内使用完。

1.4.9上样缓冲液：

0.5mol/L Tris HCl pH6.8 2mL，甘油 2mL，20% SDS 2mL，0.1%

溴酚蓝0.5mL，β-2-巯基乙醇1.0mL，dd water 2.5mL，室温存放。

1.4.10电泳缓冲液：

Tris 7.5g ，甘氨酸36g，SDS2.5g，加ddwater 至500mL。

使用

时稀释5倍。

1.4.11 考马斯亮蓝染色液：

考马斯亮蓝 R250 0.25g ，甲酸227ml，冰醋酸46mL ，水227mL ，溶解后过滤备用。

1.4.12LA平板培养基：

LB 培养基中含 1.5%（1.5g/100ml）琼脂，高压灭菌后加入

Kan青霉素至80μg/mL，每个培养皿中约 20mL 倒制平板。

1.4.13100mmol/LCaCl2,用双蒸水配置，高压灭菌，4℃保存。

1.4.14溶液I：

50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTApH8.0，25mmol/LTris-HClpH8.0，高压灭菌15min，4℃保存。

1.4.15溶液II：

0.2mol/LNaOH，1％SDS，临用前配置。

1.4.16溶液III：

每100ml的溶液III中含60ml5mol/L乙酸钾，11.5ml冰乙酸，28.5mlH2O。

2.方法

2.1Trizol法提取小鼠总RNA

2.1.1.匀浆处理：

将组织在玻璃匀浆器中磨碎，每50～100mg组织加入1mlTRIzol，用匀浆器进行匀浆处理。

样品体积不应超过TRIzol体积10℅。

2.1.2.将匀浆样品在室温放置5分钟。

2.1.3.每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

2.1.4.2-8℃10000×g离心5分钟。

样品分为三层：

底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。

RNA主要在水相中。

2.1.5.把水相转移到新管中。

用异丙醇沉淀水相中的RNA。

每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

2.1.6.2～8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。

移去上清。

2.1.7.用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。

每使用1mlTRIzol至少加1ml75℅乙醇。

2～8℃8600转离心5分钟，弃上清。

2.1.8.室温放置干燥RNA沉淀，大约晾5～10分钟即可。

加入25μl无RNase的水（DEPC处理的水），用枪头吸打几次，放置10分钟使RNA溶解。

-20℃保存。

注意事项：

①RNA易降解，取新鲜组织。

②1mLTrizol适合于1×107的细胞或50-100mg组织样品。

③灭活RNase：

1）DEPC处理；

2）玻璃器皿须经180-250℃干烤；

3）加入RNase抑制剂；

4）戴一次性手套和口罩，勤换手套；

5）无Rnase的一次性专用消耗品。

2.2RT-PCR扩增GAPDH

2.2.1.按下表配制反应液：

2.2.2.65℃保温5min后，冰上迅速冷却。

2.2.3.按下表配制20μl反应液：

2.2.4.缓慢混匀。

2.2.5.按下列条件进行反转录反应：

30℃10min.（使用Random6mers时）

42℃（50℃）30~60min.

2.2.6.95℃保温5min

使酶失活，冰上迅速冷却。

2.2.7以逆转录的cDNA为模板，用目的引物进行PCR。

扩增体系为：

PCR总体积25ul

cDNA模板3ul

引物上1ul

引物下1ul

酶混合液12.5ul

H2O7.5ul

PCR条件为：

95℃预变性5分钟

95℃变性30秒

60℃退火40秒

72℃延伸50秒

30个循环

72℃8分钟

2.3回收RT-PCR扩增的GAPDH产物

2.3.1.向PCR反应液（或其它酶促反应液）中加入3倍量的BufferDC（至少加入100μl），然后均匀混合。

2.3.2.将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。

2.3.3.将上述操作1.的溶液转移至SpinColumn中，室温12,000rpm，离心1分钟，弃滤液。

如将滤液再加入SpinColumn中离心一次，可以提高DNA的回收率。

2.3.4.将700μl的BufferWB加入SpinColumn中，室温12,000rpm，离心30秒钟，弃滤液。

2.3.5.重复操作步骤4。

2.3.6.将SpinColumn安置于CollectionTube上，室温12,000rpm离心1分钟。

2.3.7.将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入25~30μl的灭菌水或ElutionBuffer，室温静置1分钟。

2.3.8.室温12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。

注意事项：

①请确认BufferWB中已经加入了指定体积的100%乙醇。

②将灭菌水或ElutionBuffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。

2.4双酶切质粒pET-28a和GAPDH产物，回收酶切产物

2.4.1.分别在2个1.5ml离心管中加入以下试剂，充分混匀后，瞬时离心，37度保温1-2小时。

载体（ul）

基因（ul）

ddH2O

13

13

10×buffer

2ul

2ul

DNA

3ul

3ul

BamHI

1

1

XhoI

1

1

Total

20

20

2.4.2.向其它酶促反应液中加入100μlBufferDC，混匀。

2.4.3.将试剂盒中的SpinColumn安置于CollectionTube上。

2.4.4.将上述操作1.的溶液转移至SpinColumn中，室温12,000rpm，离心1分钟，弃滤液。

如将滤液再加入SpinColumn中离心一次，可以提高DNA的回收率。

2.4.5将700μl的BufferWB加入SpinColumn中，室温12,000rpm，离心30秒钟，弃滤液。

2.4.6重复操作步骤5。

2.4.7将SpinColumn安置于CollectionTube上，室温12,000rpm离心1分钟。

2.4.8将SpinColumn安置于新的1.5ml的离心管上，在SpinColumn膜的中央处加入25~30μl的灭菌水或ElutionBuffer，室温静置1分钟。

2.4.9室温12,000rpm离心1分钟洗脱DNA。

注意事项：

①请确认BufferWB中已经加入了指定体积的100%乙醇。

②将灭菌水或ElutionBuffer加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。

2.5琼脂糖凝胶电泳检测回收产物

2.6连接反应：

构建重组质粒

在1.5ml离心管中加入以下试剂，混匀（轻弹或反复用枪吹吸），16℃过夜。

ddH2O

12ul

10×buffer

2ul

X-DNA

4ul

pET（vector）

2ul

T4DNAligase

1ul

2.7DH5α和BL21感受态的制备

2.7.1感受态的制备:

取1.4ml菌液，4000rpm，离心5分钟。

2.7.2弃上清液后，加入0.5ml冰冷的CaCl2混匀,4000rpm，离心5分钟。

2.7.3弃上清液后，加入0.5ml冰冷的CaCl2混匀,冰浴，30分钟，4000rpm,离心5分钟。

2.7.4弃上清液后，加入100ul冰冷的CaCl2混匀，可立即使用，4℃短期保存；加15%-30%甘油，-70℃长期保存。

2.8转化（分别转化DH5α与BL21）

2.8.1将恒温水浴的温度调节到42℃。

2.8.2取10uL连接好的质粒与50-100uL感受态细菌DH5a混匀，在冰上放置30min。

2.8.3于42℃水浴中90S进行热休克，然后在冰中放置2min，加入0.5-1mlLB培养基（不含Kan青霉素），37℃振荡培养60min。

2.8.4将上述菌液，5000rpm,离心3分钟，弃上清，重选沉淀，用涂布棒均匀的涂布在LB、Kan+LB的固体培养基上，37℃恒温培养过夜。

2.8.5取50ul感受态细菌，用涂布棒均匀的涂布在Kan+LB的固体培养基上，37℃恒温培养过夜。

2.8.6BL21转化过程同DH5α

2.8.7观察平板上菌落生长状态，挑取Kan+LB的固体培养基上单菌落，加入加好Kan的LB培养基，37℃摇床中，进行摇菌扩培。

2.9用碱裂解法从转化的DH5α中提取质粒

原理：

SDS和NaOH使蛋白质和染色体DNA变性；醋酸盐使变性蛋白、染色体DNA及SDS沉淀，质粒DNA存在于上清中；乙醇可使质粒DNA沉淀，酚、氯仿去除残留的蛋白质。

2.9.1取菌液1.4ml，6000rpm离心3分钟，弃上清（为充分弃去上清，可用枪吸取）。

2.9.2加入250ul溶液I，剧烈振荡，置于冰上5min。

2.9.3加250ul溶液II，盖紧EP管口，轻柔颠倒离心管5次，以混匀混合物，确保离心管的整个内表面与溶液II接触，不要涡旋，置于冰浴中。

2.9.4加入350µl预冷溶液III，盖紧EP管口，反复颠倒数次，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上5分钟。

2.9.512000rpm离心10min，用枪吸400ul上清液于另一新EP管，加1ml无水乙醇，混匀，置于冰上5-10分钟。

2.9.612000rpm离心10min，弃去上清，加入1ml70%乙醇。

2.9.712000rpm离心5min，弃去上清，1200rpm瞬时离心，用枪吸去残余液体，将开口的EP管置于室温使乙醇挥发，直至EP管中内没有可见的液体存在（5～10分钟）。

2.9.8用20ulTE溶解，加1µl的RNase37℃温育5~10分钟。

2.10琼脂糖电泳酶切鉴定

2.10.1在1.5ml离心管中加入以下试剂，充分混匀后，瞬时离心，37度保温1-2小时。

克隆

#1

#2

处理

单

双

双

ddH2O

14

13

13

10×buffer

2

2

2

质粒

3

3

3

BamHI

/

1

1

ApaI

1

/

/

XhoI

/

1

1

Total

20

20

20

2.10.2琼脂糖凝胶电泳鉴定

2.11转化的BL21诱导表达GAPDH

2.11.1将正确的质粒对应的菌液转移2ml至30ml的LB培养基（Kan+）中，37℃，震荡培养2小时。

2.11.2加入IPTG0.1-1mM，于0h取1.5ml菌液至1.5ml离心管,于1h取0.8ml菌液至1.5ml离心管，于2h取0.5ml菌液至1.5ml离心管。

2.12SDS-PAGE和WesternBlot鉴定GAPDH蛋白

2.12.1SDS-PAGE样品制备:

将上述三个离心管中菌液4000rpm离心5分钟,弃去上清，加50ulH2O重悬沉淀，加入50ul2×SDS样品缓冲液，混匀后至沸水浴中煮3-5分钟，4℃或-20℃保存。

2.12.2配胶：

制备分离胶（12％）制备浓缩胶（5%）

2.12.3SDS-PAGE

2.12.4.转膜：

选用PVDF膜。

甲醇浸泡一下,放转膜缓冲液,使用标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为380mA，转膜时间为90分钟。

2.12.5.封闭（Blocking）：

转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的TBST中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。

加入5%脱脂牛奶，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。

对于一些背景较高的抗体，可以在4℃封闭过夜。

2.12.6.一抗孵育：

按照1:

100-10000比例用5%脱脂牛奶稀释一抗。

立即加入稀释好的一抗，室温摇床上缓慢摇动孵育一小时。

如果一抗孵育一小时效果不佳，可以在4℃缓慢摇动孵育过夜。

（回收一抗，一周内可反复使用。

4℃保存）加入TBST，在摇床上缓慢摇动洗涤10分钟，洗3次。

如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

2.12.7.二抗孵育：

按照1:

1000-5000比例用5%脱脂牛奶稀释辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗。

立即加入稀释好的二抗，室温孵育一小时。

（可以回收二抗下次再用）加入TBST，在摇床上缓慢摇动洗涤10分钟。

共洗涤3次。

如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

2.12.8.蛋白检测：

使用ECLWestern荧光检测试剂检测蛋白条带。

3实验结果与分析

3.1琼脂糖凝胶电泳检测回收产物

3.1.1经过电泳检测，质粒pET-28a双酶切片段正确，而本班均未能检测到GAPDH双酶切产物即目的基因扩增产物。

所以用其他班的目的基因扩增产物进行后续实验。

3.1.2分析：

实验失败原因可能是①酶失活或在反应体系中未加入酶。

②模板中含有杂质。

干扰模板与酶接触，应抽提及纯化DNA后再行扩增。

③变性温度是否准确，温度过高则酶在前几个循环就迅速失活，过低则模板变性不彻底。

④反应体系中污染了蛋白酶和核酸酶。

⑥引物：

是否正确或设计问题或储存不当而失活。

⑦其它：

试剂使用前是否充分混匀、是否因储存不当或过久而失效。

3.2DH5α和BL21的转化和检测

3. 2.1   用已经扩增好的PCR 产物（GAPDH）与pET-28a载体连接，载体上有Kan抗性基因。

并将连接好的质粒导入DH5α和BL21感受态菌中，进行诱导鉴定。

将转化的DH5α和BL21感受态菌，摇菌培养后涂平板。

涂到LB（Kan+）的固体培养基中，过夜培养，进行Kan抗性检测。

图1：

转化的DH5α和BL21感受态菌的Kan抗性检测

3.2.2   分析：

由于未转化的感受态菌无Kan抗性，所以在有Kan的LB培养基中应不能生长，在无Kan的培养基中，感受态菌都能生长。

而导入质粒的感受态菌具有Kan抗性，可在有Kan的LB培养基中生长。

实验结果正确，只是有Kan的LB培养基中，导入质粒的感受态菌生长菌落有但很少，有的只在培养基的边缘有少许菌落。

可能原因：

①涂板时涂布棒未冷却就涂板，使感受态菌死亡。

②涂板时未能涂均匀，都聚集在培养皿边缘。

③导入感受态菌时，导入量很小，能够抗Kan的菌很少。

3.3重组质粒提取电泳鉴定

3.3.1本实验将表达载体质粒pET-28a（+）、大小为5369bp，与PCR产物即目的基因GAPDH、大小为1000bp，两者通过Xhoɪ和BamHɪ进行双酶切后连接。

本组实验:

单：

用ApaI酶切质粒，插入GAPDH:

三条带，三条带大小500bp1500bp4400bp；未插入GAPDH:

一条带。

双:

Xhoɪ和BamHɪ进行双酶切，两条条带，一条为质粒大

?

1500bp

4400bp

1000bp

小，一条为目的基因。

质粒：

未酶切的质粒有两个条带，在5000bp左右位置的质粒为闭环，因其所受的阻力小于经酶切后的质粒，故其条带较酶切质粒跑得快；在10000-7500bp之间为开环，机械损伤导致开环所受的阻力大于经酶切的质粒，故其条带较酶切质粒跑得慢。

图2重组质粒提取电泳鉴定

3.3.2分析：

经琼脂糖凝胶电泳显示，结果基本符合，本组由于电泳时间过长，Marker的最短条带250bp,跑出了凝胶，导致单酶切最短条带也无法观测，可能也跑出凝胶。

所以跑电泳时应该实时观察Marker进度，防止跑出凝胶，影响实验。

此外，单酶切最后的一个条带，可能是由于提取的质粒不纯或部分未插入目的基因，导致质粒单酶切开环后的出现的条