卷心菜中过氧化物酶热稳定性的初步研究.docx
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卷心菜中过氧化物酶热稳定性的初步研究
实验一卷心菜中过氧化物酶热稳定性的初步研究
1、实验原理
果蔬中的过氧化物酶（peroxidase）往往具有较高的热稳定性，对果蔬进行热烫处理时，常以过氧化物酶是否失活作为热烫是否充分的标准。
许多研究表明果蔬中的过氧化物酶有热稳定和热不稳定两部分。
这两部分的比例取决于果蔬的品种和热烫处理的温度。
过氧化物酶催化的典型反应为：
H2O2＋AH2→A＋2H2O。
AH2是无色的还原性化合物，如果它经过氧化转变成有色的A，那么反应体系在特定波长下的吸光值就会随反应进行而增加。
因此，可以用分光光度法测定过氧化物酶的活力。
2、试剂和仪器
试剂：
0.05mol/L磷酸盐缓冲液pH7.0，含1.0mol/LNaCl（缓冲液Ⅰ）、0.1mol/L磷酸盐缓冲液pH7.0（缓冲液Ⅱ）、1%邻苯二胺-乙醇溶液、0.3%过氧化氢溶液
仪器：
组织捣碎机、抽滤装置、水浴锅、721分光光度计（含比色皿）、秒表、常规玻璃仪器
3、实验步骤
1、从卷心菜中提取过氧化物酶
125g卷心菜＋125mL缓冲液Ⅰ
↓均质（20000rpm，2min）
匀浆
↓抽滤
液体
↓离心（8000rpm，15min，4℃）
↓¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯↓
残渣滤过液（粗酶液）
2、过氧化物酶热处理
将从卷心菜中萃取得到的过氧化物酶粗酶液置于试管中。
取适量酶液稀释5倍左右，过滤后测定酶活。
另取适量酶液分别置于已编号的试管中，将试管在60℃水浴中保温1min，然后移至85℃水浴锅中，分别处理0.5min、1min、1.5min、2min、3min、5min、7min和10min，然后立即将试管转移至冰浴中，快速冷却至0℃。
再取适量酶液分别置于已编号的试管中，并将试管在60℃水浴中保温1min，然后在100℃下分别处理15s、30s、45s、1min、1.5min、2min和3min，然后在冰浴中快速冷却，测定残余过氧化物酶活力。
3、过氧化物酶活力测定
如果热处理后酶液中产生混浊，应在比色前过滤去除沉淀。
向比色皿中加入2.6mL缓冲液Ⅱ，0.1mL邻苯二胺-乙醇溶液，0.2mL过氧化氢溶液，然后加入0.1mL酶液，并立即搅匀计时，在430nm下测定反应混合物的吸光值随时间的变化。
空白以缓冲液代替酶液。
根据吸光值变化情况调节加酶量，保持酶液和缓冲液体积之和恒定。
4、数据记录与处理
1、粗酶液活力测定数据
时间/S
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
吸光度
0.105
0.187
0.262
0.342
0.427
0.508
0.594
0.682
0.773
0.867
0.966
1.062
用Excel处理数据，得到下图，加酶量0.1mL，稀释倍数为5（1mL原酶液+4mL蒸馏水）。
由图可知：
直线的斜率为0.5198，也就是说每分钟吸光度值上升0.5198。
由于稀释倍数为5倍，加酶量为0.1mL，因此计算得出酶活力为0.5198×50=25.99U/mL。
2、85℃热处理后残余酶活测定数据
热处理时间不同的几组样品在不同稀释倍数及加酶量条件下分别测定了消光值，如下表：
热处理
消光值
时间/s
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
85℃0.5min
0.045
0.088
0.138
0.188
0.240
0.293
0.348
0.405
0.464
0.523
0.585
0.649
85℃1.0min
0.047
0.091
0.136
0.181
0.229
0.278
0.327
0.379
0.432
0.486
0.541
0.599
85℃1.5min
0.015
0.032
0.054
0.075
0.097
0.119
0.141
0.165
0.188
0.211
0.234
0.259
85℃2.0min
0.042
0.078
0.117
0.155
0.193
0.234
0.275
0.317
0.361
0.406
0.452
0.499
85℃3.0min
0.006
0.012
0.018
0.025
0.031
0.038
0.044
0.052
0.059
0.066
0.074
0.082
85℃5.0min
0.004
0.004
0.005
0.006
0.008
0.009
0.011
0.013
0.015
0.017
0.019
0.021
85℃7.0min
0.004
0.003
0.004
0.004
0.004
0.003
0.004
0.004
0.004
0.004
0.004
0.004
85℃10.0min
0.003
0.003
0.003
0.003
0.003
0.003
0.003
0.003
0.003
0.003
0.003
0.003
数据处理如下图：
（85℃，30秒，稀释4倍，加酶量0.1mL）
（85℃，60秒，稀释3倍，加酶量0.1mL）
（85℃，90秒，稀释2倍，加酶量0.1mL）
（85℃，120秒，稀释1倍，加酶量0.1mL）
（85℃，180秒，稀释1倍，加酶量0.1mL）
（85℃，300秒，稀释1倍，加酶量0.1mL）
（85℃，420秒，稀释1倍，加酶量0.1mL）
（85℃，600秒，稀释1倍，加酶量0.1mL）
3、100℃热处理后残余酶活测定
热处理时间不同的几组样品在不同加酶量条件下分别测定了消光值，如下表：
热处理
消光值
时间/s
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
100℃0.25min
0.082
0.144
0.208
0.275
0.343
0.414
0.487
0.564
0.643
0.724
0.809
0.897
100℃0.5min
0.135
0.176
0.223
0.283
0.341
0.404
0.469
0.536
0.605
0.675
0.748
0.825
100℃0.75min
0.004
0.008
0.012
0.017
0.021
0.024
0.029
0.033
0.038
0.043
0.047
0.052
100℃1.0min
0.005
0.008
0.011
0.014
0.017
0.021
0.025
0.028
0.031
0.034
0.038
0.042
100℃1.5min
0.088
0.093
0.096
0.100
0.107
0.109
0.114
0.117
0.122
0.127
0.131
0.135
100℃2.0min
0.087
0.091
0.091
0.092
0.093
0.094
0.095
0.099
0.096
0.098
0.098
0.099
100℃3.0min
0.098
0.098
0.097
0.098
0.098
0.098
0.099
0.099
0.099
0.099
0.100
0.100
数据处理如下面一系列图：
（100℃，15秒，稀释4倍，加酶量0.1mL）
（100℃，30秒，稀释3倍，加酶量0.1mL）
（100℃，45秒，稀释2倍，加酶量0.1mL）
（100℃，60秒，稀释1倍，加酶量0.1mL）
（100℃，90秒，稀释1倍，加酶量0.1mL）
（100℃，120秒，稀释1倍，加酶量0.1mL）
（100℃，180秒，稀释1倍，加酶量0.1mL）
4、酶活计算
Excel处理数据所的斜率
热处理条件
酶液稀释倍数
加酶量/mL
酶活/[U/mL]
相对残余活力（%）
相对残余活力对数
0.5198
无
5
0.1
25.99
100.0
2.000
0.3303
85℃热处理0.5´
4
0.1
13.212
50.835
1.706
0.3005
85℃热处理1´
3
0.1
9.015
34.686
1.482
0.1341
85℃热处理1.5´
2
0.1
2.682
10.319
1.0136
0.2488
85℃热处理2´
未
0.1
0.2488
0.957
-0.0191
0.0413
85℃热处理3´
未
0.1
0.0413
0.1589
-0.7989
0.0098
85℃热处理5´
未
0.1
0.0098
0.0377
-1.4237
0.0002
85℃热处理7´
未
0.1
0.0002
0.0000077
-5.114
0.0000
85℃热处理10´
未
0.1
0.0000
0
-
0.4435
100℃热处理0.25´
4
0.1
17.74
68.257
1.834
0.3810
100℃热处理0.5´
3
0.1
11.43
43.978
1.643
0.0261
100℃热处理0.75´
2
0.1
0.522
2.0085
0.3029
0.0201
100℃热处理1´
未
0.1
0.0201
0.0773
-1.1118
0.0256
100℃热处理1.5´
未
0.1
0.0256
0.0985
-1.0066
0.0069
100℃热处理2´
未
0.1
0.0069
0.0265
-1.577
0.0013
100℃热处理3´
未
0.1
0.0013
0.00005002
-4.3009
5、相对残余活力—热处理时间曲线和相对残余活力对数—热处理时间曲线
在相对残余活力—热处理时间曲线中，最初的直线部分代表酶的热不稳定部分失活，中间曲线部分可以认为是过渡区域，而最后的直线部分表示耐热部分的失活，拟合最后平缓部分并延长（取最后三个点）可以得出它与纵坐标的交点，由此可以估算出耐热部分活力占酶的总活力的比例。
曲线如下图：
由图中可知，85℃热处理时，卷心菜中过氧化物酶耐热部分所占比例约为-0.0397，而100℃热处理时，其比例仅占-0.0508.
5、讨论
1、根据文献报道，卷心菜中过氧化物酶的最适pH接近中性。
2、过氧化物酶经热处理失活，当温度下降时失活的酶能部分再生，此种再生现象在室温条件下（25℃~35℃）表现得较为明显，当温度接近0℃时酶的再生受到抑制。
3、在一些植物中的过氧化物酶的热失活遵循一级动力学。
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