发酵操作流程.docx

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发酵操作流程

基因工程菌发酵操作流程

1.检查发酵车间是否达到发酵要求（所以设备处于待用状态）。

2.通知蒸汽车间按时送符合要求蒸汽。

3.种子罐基础培养基的领料及定容配制。

4.种子罐的PH、DO电极的校正安装和补料口堵头更换。

5.种子罐进料，调PH。

6.种子罐基础培养基在位灭菌，同时灭移种管道上段。

7.种子罐冷却后可连接酸、碱、消泡剂补料瓶。

8.种子罐培养基温度、PH（需进一步校准）、罐压、消泡达到发酵条件。

通知菌种室准备菌种转接。

9.无菌操作将种子罐所需MgSO4、Amp转入菌种转换罐。

10.种子罐扩增培养发酵阶段需平稳控制罐压、PH、DO、温度、消泡。

11.大罐基础培养基领料及配制。

12.大罐PH、DO电极校正安装及补料口堵头的更换。

13.大罐进料、定容、调PH；碱罐碱液的配制。

14.大罐基础培养基在位灭菌，同时对移种管道、进料管道、补料管道、碱罐及碱管道上段的灭菌。

15.大罐基础培养基温度降至发酵温度后再次校准PH、DO。

连接补料瓶调节至发酵条件。

16.无菌操作将大罐所需MgSO4、Amp转入菌种转换罐并转入种子罐。

17.利用压力差将种子罐里的种子液移接到大罐。

18.补碱时，将管道上阀门打开。

程序设为自动，控制流量。

19.补料罐补料培养基的领料定容配制。

20.补料罐补料培养基在位灭菌，同时对管道上段灭菌。

21.补料时，将管道上阀门打开。

程序设为自动，设置流量。

22.诱导剂领料，在配料罐中加水配制定容。

23.将诱导剂打入种子罐，灭菌后保持罐压。

24.利用压力差将种子罐里的诱导剂移接到大罐。

25.一段时间后，大罐的PH、DO呈上升形态即为发酵结束，可放罐离心。

芽孢杆菌发酵操作流程

1.检查发酵车间是否达到发酵要求（所以设备处于待用状态）。

2.通知蒸汽车间按时送符合要求蒸汽。

3.种子罐基础培养基的领料及定容配制。

4.种子罐的PH、DO电极的校正安装和补料口堵头更换。

5.种子罐进料，调PH。

6.种子罐基础培养基在位灭菌，同时灭移种管道上段。

7.种子罐冷却后可连接酸、碱、消泡剂补料瓶。

8.种子罐培养基温度、PH（需进一步校准）、罐压、消泡达到发酵条件。

通知菌种室准备菌种转接。

9.无菌操作将种子罐所需MgSO4、Amp转入菌种转换罐。

10.种子罐扩增培养发酵阶段需平稳控制罐压、PH、DO、温度、消泡。

11.大罐基础培养基领料及配制。

12.大罐PH、DO电极校正安装及补料口堵头的更换。

13.大罐进料、定容、调PH；碱罐碱液的配制。

14.大罐基础培养基在位灭菌，同时对移种管道、进料管道、碱罐及碱管道上段的灭菌。

15.大罐基础培养基温度降至发酵温度后再次校准PH、DO。

连接酸、消泡剂补料瓶调节至发酵条件。

16.无菌操作将大罐所需MgSO4、Amp转入菌种转换罐并转入种子罐。

17.利用压力差将种子罐里的种子液移接到大罐。

18.补碱时，将管道上阀门打开。

程序设为自动，控制流量。

19.发酵一定时间后，程序中PH设为手动，停止对PH、DO控制

20.一段时间后，大罐里孢子大量生长后即为发酵结束，可放罐离心。

设备操作规程

一.种子罐灭菌

1.首先排夹套水，关闭所有阀门。

然后先后打开夹套排污阀、夹套进蒸汽阀。

夹套开始进蒸汽对罐体进行预热。

2.微开取样排蒸汽阀、取样进蒸汽阀，对取样管路进行灭菌。

灭菌时间一般10分钟。

取样管路灭菌结束后，先后关闭排蒸汽阀、进蒸汽阀。

3.全开过滤器后端隔离阀，微开过滤器蒸汽排放阀、过滤器进蒸汽阀，对过滤器及管路进行灭菌，每隔一段时间需打开过滤器下端排污阀排放过滤器壳内冷凝水，通过调节进出蒸汽流量的大小将过滤器壳内压力维持在0.11MPa左右。

灭菌时间一般10分钟。

过滤器灭菌结束后，同时关闭过滤器后端隔离阀、过滤器进蒸汽阀，关闭阀门时过滤器壳内压力不允许跌到0，然后开启过滤器前端隔离阀通入空气，过滤器壳内压力在0.10MPa左右后，关闭过滤器前端隔离阀，将过滤器段保压。

需注意，因过滤器壳与管路降温时，内部压力也会损失，因此在压力损失后通入空气以便维持其保压压力。

4.在种子罐温度上升期间，要打开启尾气调节阀排放罐内冷空气然后关闭。

当罐内温度升到90℃时，打开取样进蒸汽阀和取样阀，使蒸汽从取样阀进入罐内，并打开进气路进蒸汽阀，先将进气路进蒸汽阀到过滤器蒸汽排放阀间那段管路灭透后，关闭过滤器蒸汽排放阀，打开进气隔膜阀，使蒸汽从空气管路进入罐内。

5.当温度达到设定灭菌温度121℃后，通过调节取样进蒸汽阀、进气路进蒸汽阀、尾气调节阀的开度，使罐压保持在0.11MPa及灭菌温度121℃。

夹套进蒸汽阀可以根据蒸汽情况微开或关闭，夹套排污阀一定要开着。

注意：

尾气调节阀不能全部关闭，以保证蒸汽流通，达到有效灭菌。

6.当罐温达到121℃后，灭菌倒计时开始。

此时可对种子罐接种管、移种补料管（3000L罐）进行灭菌操作。

对于种子罐接种管可全开罐体端隔离阀，微开排放阀对管路进行灭菌，灭菌时间30分钟。

7.当倒计时为0时，程序自动将灭菌开关关闭，灭菌结束。

先关闭取样阀、取样进蒸汽阀，再关闭进气路进蒸汽阀，全开过滤器前后端隔离阀，将空气通入罐内。

（注意：

此操作时需保持过滤器处压力高于罐体压力）调节尾气调节阀，使罐压始终高于大气压。

检查所有进蒸汽阀是否关闭。

注意：

实罐灭菌过程保证罐压始终处于正压状态，否则会染菌。

8.关闭夹套排污阀，打开夹套排水阀、夹套手动进冷水阀，进冷水对罐体进行降温。

待罐温低于100℃后，关闭夹套排水阀、夹套手动进冷水阀，打开自控进水隔离阀、回水阀。

系统进入发酵控制状态：

按工艺要求设置控制参数，打开发酵开关，各单项控制开关，如温度控制开关、转速控制开关等进入发酵正常运行。

二.发酵罐灭菌

1.首先排夹套水，关闭所有阀门。

然后先后打开夹套排污阀、夹套进蒸汽阀。

夹套开始进蒸汽对罐体进行预热。

2.微开取样排蒸汽阀、取样进蒸汽阀，对取样管路进行灭菌。

灭菌时间一般10分钟。

取样管路灭菌结束后，先后关闭排蒸汽阀、进蒸汽阀

3.全开过滤器后端隔离阀，微开过滤器蒸汽排放阀、过滤器进蒸汽阀，对过滤器及管路进行灭菌，每隔一段时间需打开过滤器下端排污阀排放过滤器壳内冷凝水，通过调节进出蒸汽流量的大小将过滤器壳内压力维持在0.11MPa左右。

灭菌时间一般10分钟。

过滤器灭菌结束后，同时关闭过滤器后端隔离阀、过滤器进蒸汽阀，关闭阀门时过滤器壳内压力不允许跌到0，然后开启过滤器前端隔离阀通入空气，过滤器壳内压力在0.10MPa左右后，关闭过滤器前端隔离阀，将过滤器段保压。

需注意，因过滤器壳与管路降温时，内部压力也会损失，因此在压力损失后通入空气以便维持其保压压力。

4.在发酵罐罐温度上升期间，要打开启尾气调节阀排放罐内冷空气然后关闭。

当罐内温度升到90℃时，打开放料进蒸汽阀和放料阀，使蒸汽从放料阀进入罐内，并打开进气路进蒸汽阀，先将进气路进蒸汽阀到过滤器蒸汽排放阀间那段管路灭透后，关闭过滤器蒸汽排放阀，打开进气隔膜阀，使蒸汽从空气管路进入罐内。

5.当温度达到设定灭菌温度121℃后，通过调节放料进蒸汽阀、进气路进蒸汽阀、尾气调节阀的开度，使罐压保持在0.11MPa及灭菌温度121℃。

夹套进蒸汽阀可以根据蒸汽情况微开或关闭，夹套排污阀一定要开着。

注意：

尾气调节阀不能全部关闭，以保证蒸汽流通，达到有效灭菌。

6.当罐温达到121℃后，灭菌倒计时开始。

此时可对发酵罐移种补料管及补碱管道（3000L罐）进行灭菌操作。

打全开移种管道、补料管道及补碱管道阀门，微开移种管道、补料管道及补碱管道的排蒸汽阀门，灭菌30分钟。

7.当倒计时为0时，程序自动将灭菌开关关闭，灭菌结束。

先关闭放料阀、放料进蒸汽阀，再关闭进气路进蒸汽阀，全开过滤器前后端隔离阀，将空气通入罐内。

（注意：

此操作时需保持过滤器处压力高于罐体压力）调节尾气调节阀，使罐压始终高于大气压。

检查所有进蒸汽阀是否关闭。

注意：

实罐灭菌过程保证罐压始终处于正压状态，否则会染菌。

8.关闭夹套排污阀，打开夹套排水阀、夹套手动进冷水阀，进冷水对罐体进行降温。

待罐温低于100℃后，关闭夹套排水阀、夹套手动进冷水阀，打开自控进水隔离阀、回水阀。

系统进入发酵控制状态：

按工艺要求设置控制参数，打开发酵开关，各单项控制开关，如温度控制开关、转速控制开关等进入发酵正常运行。

三.补料罐灭菌

1.首先排夹套水，关闭所有阀门。

然后先后打开夹套排污阀、夹套进蒸汽阀。

夹套开始进蒸汽对罐体进行预热。

2.微开取样排蒸汽阀、取样进蒸汽阀，对取样管路进行灭菌。

灭菌时间一般10分钟。

取样管路灭菌结束后，先后关闭排蒸汽阀、进蒸汽阀。

3.全开过滤器后端隔离阀，微开过滤器蒸汽排放阀、过滤器进蒸汽阀，对过滤器及管路进行灭菌，每隔一段时间需打开过滤器下端排污阀排放过滤器壳内冷凝水，通过调节进出蒸汽流量的大小将过滤器壳内压力维持在0.11MPa左右。

灭菌时间一般10分钟。

过滤器灭菌结束后，同时关闭过滤器后端隔离阀、过滤器进蒸汽阀，关闭阀门时过滤器壳内压力不允许跌到0，然后开启过滤器前端隔离阀通入空气，过滤器壳内压力在0.10MPa左右后，关闭过滤器前端隔离阀，将过滤器段保压。

需注意，因过滤器壳与管路降温时，内部压力也会损失，因此在压力损失后通入空气以便维持其保压压力。

4.在补料罐温度上升期间，要打开启尾气调节阀排放罐内冷空气然后关闭。

当罐内温度升到90℃时，打开取样进蒸汽阀和取样阀，使蒸汽从取样阀进入罐内，并打开进气路进蒸汽阀，先将进气路进蒸汽阀到过滤器蒸汽排放阀间那段管路灭透后，关闭过滤器蒸汽排放阀，打开进气隔膜阀，使蒸汽从空气管路进入罐内。

5.当温度达到设定灭菌温度121℃后，通过调节取样进蒸汽阀、进气路进蒸汽阀、尾气调节阀的开度，使罐压保持在0.11MPa及灭菌温度121℃。

夹套进蒸汽阀可以根据蒸汽情况微开或关闭，夹套排污阀一定要开着。

注意：

尾气调节阀不能全部关闭，以保证蒸汽流通，达到有效灭菌。

6.当罐温达到121℃后，灭菌倒计时开始。

灭菌时间30分钟。

当倒计时为0时，程序自动将灭菌开关关闭，灭菌结束。

先关闭取样阀、取样进蒸汽阀，再关闭进气路进蒸汽阀，全开过滤器前后端隔离阀，将空气通入罐内。

（注意：

此操作时需保持过滤器处压力高于罐体压力）调节尾气调节阀，使罐压始终高于大气压。

检查所有进蒸汽阀是否关闭。

注意：

实罐灭菌过程保证罐压始终处于正压状态，否则会染菌。

7.关闭夹套排污阀，打开夹套排水阀、夹套手动进冷水阀，进冷水对罐体进行降温。

降至一定温度后为发酵罐的补料做准备。

四.碱罐灭菌

1.首先排夹套水，关闭所有阀门。

然后先后打开夹套排污阀、夹套进蒸汽阀。

夹套开始进蒸汽对罐体进行预热。

2.微开取样排蒸汽阀、取样进蒸汽阀，对取样管路进行灭菌。

灭菌时间一般10分钟。

取样管路灭菌结束后，先后关闭排蒸汽阀、进蒸汽阀。

3.全开过滤器后端隔离阀，微开过滤器蒸汽排放阀、过滤器进蒸汽阀，对过滤器及管路进行灭菌，每隔一段时间需打开过滤器下端排污阀排放过滤器壳内冷凝水，通过调节进出蒸汽流量的大小将过滤器壳内压力维持在0.11MPa左右。

灭菌时间一般10分钟。

过滤器灭菌结束后，同时关闭过滤器后端隔离阀、过滤器进蒸汽阀，关闭阀门时过滤器壳内压力不允许跌到0，然后开启过滤器前端隔离阀通入空气，过滤器壳内压力在0.10MPa左右后，关闭过滤器前端隔离阀，将过滤器段保压。

需注意，因过滤器壳与管路降温时，内部压力也会损失，因此在压力损失后通入空气以便维持其保压压力。

4.在碱罐温度上升期间，要打开启尾气调节阀排放罐内冷空气然后关闭。

当罐内温度升到90℃时，打开取样进蒸汽阀和取样阀，使蒸汽从取样阀进入罐内，并打开进气路进蒸汽阀，先将进气路进蒸汽阀到过滤器蒸汽排放阀间那段管路灭透后，关闭过滤器蒸汽排放阀，打开进气隔膜阀，使蒸汽从空气管路进入罐内。

5.当温度达到设定灭菌温度121℃后，通过调节取样进蒸汽阀、进气路进蒸汽阀、尾气调节阀的开度，使罐压保持在0.11MPa及灭菌温度121℃。

夹套进蒸汽阀可以根据蒸汽情况微开或关闭，夹套排污阀一定要开着。

注意：

尾气调节阀不能全部关闭，以保证蒸汽流通，达到有效灭菌。

6.关闭夹套排污阀，打开夹套排水阀、夹套手动进冷水阀，进冷水对罐体进行降温。

降至一定温度后为发酵罐的补碱做准备。

五.配料罐操作规程

1.在配料之前应确保配料罐里面干净，并关闭配料罐底阀和排污阀门。

2.加料进配料罐后，打开罐顶的水阀进水溶料，然后定容。

最后打开配料罐搅拌机充分搅拌培养基。

3.打开底阀，启动料泵，然后根据要求打开大料管道阀门为发酵罐打基础培养基。

基础培养基打完后停料泵，关闭配料罐底阀和打料管道阀门。

4.清洗配料罐。

六.储罐操作规程

1.在打发酵液过来之前要保证储罐干净，关闭储罐底阀和排污阀门。

2.打开发酵罐的放料阀门、打开发酵罐至储罐管道阀门，利用发酵罐与储罐的压力差将发酵液输送至储罐。

3.打开储罐至离心机之间阀门，利用储罐与离心机间高度差将发酵液输送至离心机离心。

4.发酵液离心完成后储罐要清洗。

七.PH电极校正、安装与保养

1.在主菜单中点击电极校正按钮，选择要校正的PH电极，点击校正，则进入相应的校正界面。

打开PH校正开关。

（总开关必须处于关闭状态）设置一号标准液和二号标准液的值，不必考虑大小顺序。

第一步：

设置一号标准液和二号标准液的值，不必考虑大小顺序。

第二步：

将PH电极放入一号标准液里，观察屏幕右上角的反馈电压的数据，当数值基本稳定后，点击一号采集电压后面的开关进行电压采集。

第三步：

将PH电极取出，用蒸馏水洗净擦干后放入二号标准液里，观察屏幕右上角的反馈数据，当数值基本稳定后，点击二号采集电压后面的开关进行电压采集。

第四步：

点击计算后的开关，则PH电极离线校正完毕。

2.PH电极的在线校正：

待实罐灭菌完毕，各控制参数都控制到设定值，接种前后（一般大罐宜在接种后马上进行），还需进行一次在线校正（直接在发酵界面调出在线校正界面）。

方法如下：

第一步：

对罐内培养液取样；

第二步：

用台式酸度计测定培养液的PH值；

第三步：

将台式酸度计测得的PH值输入到实测PH值后，点击确定按钮。

至此，PH电极校正完毕。

3.PH电极平时不使用，可以浸泡在3mol/L的kcl溶液或饱和kcl溶液中，严格禁止将电极浸泡在蒸馏水，去离子水或自来水等离子含量极少的液体中。

如果PH电极长期干放而暴露在空气中，在重新使用之前，请先将电极浸泡在3mol/L的kcl溶液或饱和kcl溶液中2-3天，使电极恢复活性，如果有条件，请先将电极浸泡在9895电极再生液中1分钟左右，再用蒸馏水洗干净，然后浸泡在3mol/L的kcl或饱和kcl溶液中至少1天才能使用。

如果PH电极被无机物质污染可以用0.1mol/L的Hcl或NaOH溶液清洗数分钟，然后再用蒸馏水洗干净。

如果PH电极被有机物质污染，可以用酒精或丙酮清洗，然后再用蒸馏水洗干净。

PH电极上端和电缆线相连接处的接头是高阻抗部件，禁止用水等液体浸泡或蒸汽等潮湿空气侵蚀，可以用新电极所带的红色小螺帽盖住，电极电缆的接头也属于高阻抗部件，严禁用水等液体浸泡或蒸汽等潮湿空气侵蚀，一定要存放在干燥处。

八.DO电极校正、安装与保养

1.在主菜单中点击电极校正按钮，选择要校正的DO电极，点击校正，则进入相应的校正界面。

打开DO校正开关。

（总开关必须处于关闭状态）设置一号标准液和二号标准液的值，不必考虑大小顺序。

第一步：

设置一号标准液和二号标准液的值，一个为0值，另一个为100。

其中0值对应的是饱和亚硫酸钠标定值，100值对应为DO电极在空气中标定值。

第二步：

将DO电极放入一号标准液里，观察屏幕右上角的反馈电压的数据，当数值基本稳定后，点击一号采集电压后面的开关进行电压采集。

第三步：

将DO电极取出，用蒸馏水洗净擦干后放入二号标准液里，观察屏幕右上角的反馈数据，当数值基本稳定后，点击二号采集电压后面的开关进行电压采集。

第四步：

点击计算后的开关，则DO电极离线校正完毕。

2.DO电极的在线校正：

将DO满度值后的数值改为您习惯使用的DO满度值（如100），点击确定按钮。

至此，DO电极校正完毕。

3.如果长期不用请将电极从罐上取下，清洗后放入电极盒中即可。

如果敏感膜脏了，请用干净的水冲洗干净。

如果冲洗不掉，可放入开水中浸泡一下再冲洗。

切不要用坚硬物体刮擦，以免刮伤敏感膜。

勿用水等液体浸泡。

防止蒸汽等潮湿空气侵蚀电缆线接头和电极接头。

勿用利器刮擦敏感膜，以免损伤。

九.接种操作规程

1.用75%消毒酒精对双手进行消毒。

然后板酒精灯放在罐接种帽下端，点燃，然后慢慢旋开接种帽。

2.用火焰封住接种口，将接种瓶上硅胶管处包着的纱布取下，将硅胶管迅速套到接种口上并绑住固定。

熄灭酒精灯。

3.将罐侧接种隔离阀打开，罐内压力升高，然后关闭接种瓶上阀门。

将罐内压力降低，然后打开接种瓶上阀门，利用压差法将接种瓶内菌种液压入罐内。

4.关闭罐侧接种隔离阀，酒精灯放在罐接种口下端，点燃，在火焰上拔下硅胶管，然后旋上接种帽。

种子罐接种完毕。

十.移种操作规程

1.对移种管路灭菌。

灭菌时间为30分钟。

2.打开移种管路上所有相关隔离阀，打开放料阀利用压力差将种子液从种子罐移至发酵罐。

3.移种后，关闭移种管路上所有相关阀门。

根据工艺要求对种子罐及管路空消或清洗。

十一.取样操作规程

1.微开取样进蒸汽阀、取样出蒸汽阀，对取样阀灭菌15分钟左右，先后关闭取样出蒸汽阀、取样进蒸汽阀。

拧下取样阀帽，用火焰封住取样口，打开取样阀排放少许培养液，把预先灭菌的取样瓶置于火焰上，拔去瓶塞取样。

2.取样后，关闭取样阀；再打开取样进蒸汽阀进行短时灭菌，待取样阀内的残液放尽后，关闭取样出蒸汽阀，拧好取样阀帽。