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毕业论文党参提取物的萃取技术研究

 

本科毕业设计(论文)

 

题目党参提取物的萃取技术研究

学生姓名

 

 

摘要

以党参为原料,选用乙醇超声法、石油醚回流法、超临界CO2流体萃取和水蒸气蒸馏法对提取工艺进行研究,并对产物进行GC-MS分析。

选用超声提取法进行正交实验,其最佳工艺条件为:

乙醇浓度50%,提取时间40min,料液比1∶10(g∶ml),党参萃取物的提取率为52.88%;选用超临界CO2流体萃取法进行正交实验,其最佳工艺条件为:

萃取温度50℃,萃取时间90min,萃取压力24Mpa,党参精油的提取率为1.409%。

通过单因素试验确定了石油醚回流法的工艺条件是:

时间6h、料液比1:

10,产率为9.03%;通过单因素试验确定了水蒸气蒸馏法的工艺条件为:

蒸馏时间5h、料液比1:

7.5,产率为0.089%。

对党参的提取物用GC-MS进行分析检测,共分离鉴定出34种有效成分,含量较高的有维生素E、棕榈酸、环酰草胺、肉桂酸、邻苯二甲酸二丁酯、肉豆蔻酸以及别香橙烯。

关键词:

党参;超声提取;回流提取;超临界CO2流体萃取;水蒸气蒸馏;GC/MS

 

Studyonthe extractiontechnology of

RadixCodonopsisextract

ABSTRACT

 

TheCodonopsispilosula asrawmaterial, Selectionoftheultrasonic extraction wasinvestigatedbytheorthogonalexperiment, the optimumprocess conditionswere:

ethanolconcentration50%,extractiontime40min, ratioofmaterialtoliquid1 ∶10 (G:

 ML), the optimalextractingconditions ofCodonopsispilosula extract ratewas52.88%;The method of singlefactorexperiment, theoptimum processconditions are:

distillationtime6h, ratioofsolidtoliquid 1:

10, theyieldis9.03%. ;Selectionoftheultrasonic extraction wasinvestigatedbythesupercriticalCO2 fluidextraction, theoptimum processconditions areasfollows:

extraction temperature50℃,extractiontime90min, extractionpressure 24Mpa, theoptimal conditions ofessentialoil extraction ratewas1.409%.The steamdistillationmethod ofsinglefactor test, the optimumconditions for:

distillationtime5h, ratioofsolidtoliquid 1:

7.5, theyieldis0.089%.Ultrasonic extractof Codonopsispilosula analysis weredetectedbyGC-MS, andidentified 34components wereseparated, vitaminE, palmicacid, ringacylgrassamine,cinnamicacid, myristicacid, dibutylphthalate and alloaromadendrene have highercontent.

KEYWORDSCodonopsispilosula;ultrasonicextraction;Refluxextraction;SupercriticalCO2 fluidextraction;Extractionand steamdistillation;GC/MS

1绪论

香料是一种能被嗅觉嗅出香味或被味觉觉出的香味物质,是用来调制香精的原料[1]。

根据其来源与组成可分为合成香料和天然香料两类。

合成香料是用单离、半合成和全合成方法制成的香料。

用物理或化学的方法从精油中提取出的香料称为单离香料,如从丁香油中得到的丁香酚;利用某种天然成分经化学反应使结构改变后所得到的香料称为半合成香料,如利用松节油中的蒎烯制得的松节醇;利用基本化工原料合成的称全合成香料。

天然香料指的是依靠物理方法从在自然界生长的含有芳香物质的动物或植物的有关部位中分离或萃取出来的芳香物质。

一般情况下,天然香料是多种成分的混合物。

通常是以自然界中存在的芳香植物的含香器官或泌香动物的腺体分泌物为原料,采用粉碎、发酵、蒸馏、压榨、冷磨、萃取以及吸附等物理和生物化学方法进行加工提制而成。

尽管合成香料的数量越来越多,在卷烟加香中越来越重要,但由于天然香料成分复杂,香气丰富,在卷烟香精调配中仍具有不可替代的地位。

1.1天然烟用香料

烟草香料的概念是两种或两种以上的烟用香料,按一定的配比并加入适当的辅料(溶剂、色素、增味剂等)所组成的,专供各种烟草制品加香矫味使用,使之在燃吸时产生优美的香气和舒适的吃味的一类烟草制品添加剂。

烟用香料可以直接加入烟草组份中,也可以加到过滤嘴、卷烟纸、包装材料中[4,5]。

烟用香精香料是烟草工业的一种辅料材料。

烟用香精香料在卷烟生产中通过加香和加料两道工序,起到如下作用:

(1)清除不同等级烟叶之问的差异。

原来叶组中各烟叶之间的香气通过加香谐调起来;

(2)有目的地增加或增强其他香味使烟味丰满;(3)降低干燥感,消除粗糙感,增加甜润度,改善吸味:

(4)加香赋予卷烟特征香,增加对消费者的吸引力;(5)加香合适,在一定程度上能提高卷烟等级[6],由相对低等级的烟叶组成的叶组配方产生级别较高的卷烟产品。

1.2党参

党参为桔梗科植物党参[Codonopsispilosula(Franch)Nannf]的根。

其性味甘平、无毒,具有生津止咳、补中益气等功效。

可用于治疗气短心悸、脾肺虚弱、食少便溏、内热消渴、虚喘咳嗽等症状,是我国传统的补益药[7]。

传统评价党参的品质以“味甜者”为佳,同时党参中的多糖又具有免疫调节、抗肿瘤等多种药理活性[8-9],故而党参中的多糖含量已成为衡量党参质量的重要指标之一。

另外,有药理试验证明党参炔苷具有抗溃疡活性,是党参发挥胃黏膜保护作用的物质基础[10],且以炔苷作为活性成分指标来评价党参质量的研究也日益增多[11-12]。

目前对党参的研究主要集中于质量评价[13]、化学成分[14]、药理作用[15]等方面,而对有关其提取工艺的研究则较少[16-17]。

1.2.1党参的化学成分

几十年来,在原有研究基础上,国内外对党参化学成分进行了深入研究,并从党参中分离鉴定出了34种挥发油成分,21种糖苷类,10种甾醇类,13种三萜类及其他类成分,5种生物碱类及含氮成分,还有多种人体所必需的无机元素和氨基酸[18-19]。

党参含甾醇类有:

α-菠菜甾醇、豆甾醇、α-菠菜甾醇-β-D-葡萄糖甙、豆甾醇-β-D-葡萄糖甙、α-菠菜甾酮、豆甾酮等。

糖和甙类有:

菊糖、果糖、四种含果糖的杂多糖。

丁香甙、β-D-吡喃葡萄糖己醇甙、α-D-呋喃果糖乙醇甙。

生物碱及含氮成分有:

胆碱、正丁基脲基甲酸酯、党参酸、5-羟基-2-羟甲基吡啶、烟碱。

挥发性成分有:

己酸、庚酸、辛酸、壬酸、十二酸、壬二酸、十四酸、十五酸、十六酸、十八酸、十八碳二烯酸、2,4-壬二烯酸、正十五烷、α-姜黄烯、正十七烷、正十八烷、正十九烷、正廿一烷、正廿二烷、十四酸甲酯、十五酸甲酯、十六酸甲酯、硬脂酸甲酯、十八碳二烯酸甲酯、蒎烯、十六酸乙酯、辛酸甲酯。

尚含三萜类及其他成分:

蒲公英萜醇、乙酰蒲公英萜醇、木栓酮;苍术内酯Ⅱ、Ⅲ;丁香醛、香荚兰酸、2-呋喃羟酸酯、党参内酯、5-羟甲基糠醛、5-甲氧基糠醛。

此外,亦含铁、锌、铜、锰等14种无机元素及天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸等17种氨基酸。

1.2.2党参的药理作用

党参的药理作用十分广泛。

传统医学认为,党参具有生津止渴、补中益气、调理脾胃、健脾益肺、活血化瘀等作用;现代药理研究发现,党参还可以提高人体免疫力,增强体质,具有抗肿瘤、抗衰老、抗疲劳、抗氧化、抗缺氧、增强记忆和提高学习能力等功能。

现将党参的药理作用综述如下。

1.2.2.1对中枢神经系统的作用

党参对中枢神经系统具有抑制作用。

张晓丹等[20]发现党参的水提物具有延长传统催眠药戊巴比妥钠及麻醉药乙醚引起的睡眠时间,表现出镇静的作用。

此外,党参还具有改善学习记忆障碍、促记忆的作用。

1.2.2.2对心血管系统的作用

李丹明等[21]通过观察党参水煎剂对兔胸主动脉血管平滑肌条舒缩活动的影响,得出党参对离体血管肌条具有舒张作用的结论,且此作用依赖于内皮细胞,可能通过内皮细胞释放NO而产生的。

张晓丹等[22-23]通过实验发现党参可减轻实验性心肌缺血大鼠心电图的T波抬高,并可减慢心率,进而证实了党参对实验性心肌缺血的保护作用。

1.2.1.3对消化系统的作用

党参是调节脾胃功能的有效中药之一,对消化系统具有多重的作用。

党参具有抗胃溃疡和抗粘膜损伤的作用。

党参粗多糖提取物可有效对抗由压力、乙酸及氢氧化钠所致的胃溃疡,并对幽门结扎型和消炎痛引起的胃溃疡也具有一定疗效[24]。

党参水煎剂不仅能够预防和减轻梗阻性黄疸大鼠急性胃粘膜损害的发生[25],对无水乙醇性胃粘膜损伤也有快速的保护作用[26]。

1.2.2.4调节机体免疫功能的作用

贾泰元等[27]通过研究发现党参水提液对鼠J774巨噬细胞的吞噬活性具有明显的增强作用,并推测机体免疫增强是以此作用为基础的。

高丽松等[28]观察认为磁处理党参药液有着促进单核巨噬细胞系统吞噬功能的作用,并对免疫系统也表现出良好作用.王敏等[29]在用D-半乳糖造成的小鼠衰老模型中发现党参及其复方可提高小鼠的IL-2水平,进而增强免疫功能,起到延缓衰老的作用。

1.2.2.5其他作用

研究发现,党参还有抗再灌注损伤作用[30-34]、抗应激作用[35-36]、对血液及造血功能的影响作用[37]、抗肿瘤和抗菌作用[38]等.

1.3天然香料的常用提取方法

天然香料的提取方法包括:

水蒸汽蒸馏法、溶剂浸提法、回流法、压榨法、吸附法、超临济流体萃取法、超声法和同时蒸馏萃取法等。

1.3.1水蒸汽蒸馏法

此法是目前最常用的方法。

它比较简单,设备不贵。

最常用的是水上蒸馏、水中蒸馏、直接蒸汽蒸馏(也称为水汽蒸馏)。

不同的植物原料,采用不同的蒸馏方式。

一般认为:

鲜花类采用水中蒸馏为宜,如玫瑰花、白兰花、橙花等;新鲜枝叶类,整株草本,宜采用直接蒸汽蒸馏;对于含水分较少的植物原料、预处理后的干料和干粉,以水上蒸馏为宜;对含有粘度大、沸点高的重馏份,在蒸馏后期可改为加压直接蒸汽蒸馏。

总之在蒸馏前必须了解蒸馏原料所含成分,并决定是否进行预处理,如破碎、“水散”和干燥等。

此外,不是所有原料都越新鲜越好,如鲜叶类,往往经薄层干燥放置一到二天后,其绝对得油率比新鲜的要高10~30%。

这可能是由于干燥过程中一部份甙类化合物在酶的作用下转化;也可能是在蒸馏过程中,半干叶不易粘结,油的扩散和传质不易受阻。

对于含有较多水溶性油分的原料常采用复馏或溶剂萃取的方法,所得“水中油”其质量往往优于同批蒸馏油,而且总得油率也提高5~20%。

另外,要使鲜花头香不受损失,必须采取极缓慢的蒸馏速度。

水蒸气蒸馏是最常用的一种技术,其特点是设备简单,容易操作,成本低、产量大;但是水蒸气蒸馏法不适合用于在沸水中主香成

分容易溶解、水解或分解的植物原料[39]。

基于水蒸汽蒸馏存在的问题,人们开始致力于改进蒸馏设备,出现了加压串

蒸、连续蒸馏、带复馏柱蒸馏等提取形式,从而避免了香味物质与水的长时间接触而被过多水解,提高了提取回收率[40]。

1.3.2溶剂浸提法

浸提法是用挥发性的有机溶剂将植物原料中的芳香成分浸取出来,使之溶解到有机溶剂中,然后蒸去溶剂的方法。

在选择萃取溶剂时,必须了解芳香原料成分和产品质量要求,并按“相似相溶”原则选择最适宜的溶剂,而且要考虑所选溶剂必须无高沸点残留物。

一般认为芳香鲜类、名贵香原料以采用非极性或弱极性溶剂作萃取剂为较佳。

因为所获产品品质好、杂质少、有效香成分含量高。

对于种子类、坚果类及辛香料等,除进行预处理外,可选择极性较强的溶剂或用非极性和极性溶剂,按一定比例组成的混合溶剂,制取油树脂、香树脂也常用此法。

有时对某些植物类原料先用极性强的溶剂进行萃取,然后将所得半成品用非极性溶剂进行复抽,以纯净成品。

王玲等[41]关于龙眼粗多糖提取的研究表明,采用水浸提、Sevage法结合酶法脱蛋白、乙醇醇析提取、离心等方法来提取龙眼粗多糖.结果表明:

料液比和温度是影响多糖提取率的主要因素;最佳工艺为:

料液比1:

40、温度80℃、时间4h,在最佳提取工艺时,龙眼的粗多糖提取率可高达21.94%。

对非芳香鲜花类原料,还常采用回流浸提或加压浸提,以提高萃取效率,缩短萃取时间。

对于芳香鲜花类的萃取,如采用低温浸提,就增强了溶剂选择性,其产品质量大大优于室温浸提所得产品。

为了调香应用方便,鲜花浸膏类还可以用乙醇低温除蜡,以获得净油。

芳香鲜花类浸提,采取花静置,溶剂循环或喷淋为宜。

与其他提取方法相比,浸提法不仅生产周期长,而且溶剂用量大,设备较复杂,密封程度要求较高,溶剂损耗也增加了产品的成本,因此浸提生产多用于较娇嫩高贵的品种(如茉莉、藏红花等)[42]。

1.3.3回流法

回流法系指用乙醇等挥发性有机溶剂浸提药材成分,浸提液被加热,溶剂馏出后又被冷凝流回浸出器中浸提药材,这样周而复始,直至有效成分提取完全的方法。

小量操作时,可在圆底烧瓶上连接回流冷凝器。

瓶内装药材为容量的1/3-1/2,溶剂浸过药材表面1-2cm。

在水浴中加热回流,一般保持沸腾约1小时。

放冷过滤,再在药渣中加溶剂,作第二、三次加热回流分别约半小时,或至有效成分基本提取完为止。

李义平等[43]关于何首乌中大黄素的提取方法研究表明,用80%乙醇加热回流提取,其实用性、时效性均可满足要求。

此法提取效率较冷浸法高,大量生产中多采用连续提取法。

该法由于浸提液受热时间较长,故不适用于受热易破坏的药材成分的浸出。

1.3.4压榨法

此法常用于柑桔类精油的制取,如柠檬、橙子、香柠檬等。

将原料切碎后压榨,而清油则可用离心分离法或其它方法分开。

如从柑桔属植物的果皮中提取香精油,目前大多以压榨或冷压法制得。

利用压榨法产生的精油,因未经热处理以及油中含有天然抗氧化物(如生育酚),比较蒸馏油有较佳的气味。

压榨法的主要设备有螺旋压榨机和整果冷磨机两种,可根据不同的情况具体选用。

冷榨柑桔果皮精油的一般工艺流程如下:

1)选料,鲜皮与干皮均要求无霉烂变质。

2)浸泡,用石灰水浸泡果皮,可使果胶转变为不溶于水的果胶酸钙,可避免因果皮破碎而导致果胶大量榨出,产生乳化作用而使油水分离困难。

3)清洗,用清水洗去浸泡剂。

4)压榨,用螺旋压榨机,调节出渣控制口。

5)沉淀与过滤,残渣可蒸馏回收精油。

6)离心分离,经过滤和沉降后的油水混合液,经高速离心机分离后,才能获得精油。

1.3.5吸附法

吸附技术主要用于捕捉鲜花和食品中的一些挥发性香味成分。

目前,常用的吸附剂有活性炭、氧化铝、硅酸、分子筛、XAD-4树脂和多孔聚合物,如Chromosorb100、Porapak-Q和R、Tenax-GC、TA等,尤其以易脱附的XAD-4树脂和Tenax-GC应用最广。

为了加速植物挥发性成分的扩散,可用微波加热的方法使植物腺胞及维管束系统破裂,还可以用惰性气体(如氮气)吹入试料瓶,以逐出香气成分。

被吸附剂吸附的成分,可用少量溶剂或加热脱附方式,将香气成分与吸附剂分开来,再加以分析。

现在已开发出了以微波加热放出吸附于活性炭的香气成分的装置,叫热脱仪。

同理,由于某些新鲜香花或食品香味的挥发性成分具有强扩散性,可采用冷捕法进行收集。

此法常用氮气作载气将挥发性成分带入冷捕管中进行冷凝,然后在常温下脱附。

吸附法的不足之处在于吸附剂的吸附容积小,当处理量大时,需耗用大量吸附剂,而且吸附剂需要再生,这也给生产过程的连续化和自动化操作带来一定的困难。

1.3.6超临界流体萃取法

超临界流体萃取又称超临界萃取、压力流体萃取、超临界气体萃取,它是把气体压缩到临界点以上,使之成为临界状态,使气体对溶质的溶解能力增强,利用处于临界压力和临界温度以上的流体具有的这种性质而分离的技术。

它以高压、高密度的超临界流体为溶剂,从液体或固体中萃取所需的组分,然后采用升温、降压或二者兼用和吸收(吸附)等手段将溶剂与所萃取的组分分离。

对于一般物质,当液相和气相在常压下达到平衡时,两相的物理性质如粘度、密度、导电性能和介电常数等相差很显著。

随着压力的提高,这种差别逐渐缩小,当物质的温度和压力高于其固有的临界温度(Tc)和临界压力(Pc)时,气相和液相无明显界限,而且仅有一相,物质便处于超临界状态。

这种状态下,既不完全与一般气体相同,又不是液体,称为超临界流体。

最常见的是超临界CO

超临界CO

萃取技术萃取与分离温度低、不破坏有效成分的活性、CO

无毒无害不污染产品,萃取物中重金属含量远低于国家标准阳[44-45],因此在健康产品的制备中广受欢迎。

吴桢等[46]关于超临界CO

萃取何首乌中二苯乙烯苷的工艺考察表明,应用超临界萃取法是当前中草药有效成分提取方法的发展方向,超临界CO

萃取技术以其萃取效率高、纯度好、节约能耗、生产成本低的特点,在中医药领域有着广泛的应用前景。

何首乌中二苯乙烯苷见光易分解,在高温、强碱性条件下不稳定,而采用超临界萃取法提取二苯乙烯苷可避免以上问题。

超临界流体萃取技术在烟草行业也有一定的应用前景。

由于超临界流体萃取基本不破坏被萃取物的形态。

可以利用超临界流体萃取对烟丝进行预处理,提取出部分烟碱或其他物质,改善烟丝的燃吸品质。

这对降低卷烟有害成分及低等级烟叶的处理都有一定的意义,此外,超临济流体萃取技术在烟草香味成分分析和有害物质分析方面也具有相当高的应用价值[47]。

目前,这项技术不仅用于天然香料、色素、药品等生物活性物质的提取,而且还用于精油、蔬菜、酒的浓缩及药物分析。

但是超临界流体萃取的原料并不适合于含水量过大的水果类天然香精的制备,且设备投资大,技术要求高用[48]。

1.3.7同时蒸馏萃取法

同时蒸馏萃取的操作原理是根据道尔顿分压定律,利用样品蒸汽和萃取溶剂的蒸汽在密闭的装置中充分混合,各组分在低于各自沸点时能被蒸馏出来,蒸馏时混合物的沸点将保持不变,当其中某一组分被完全蒸出后,温度才上升到留在瓶中组分的沸点。

挥发性成分首先被蒸馏出来,然后和萃取剂在螺旋形冷凝管上完成萃取,根据萃取剂与水比重的差异将两者分开,最后回收萃取液。

SDE法的优点为操作简单、精油可直接进行GC-MS分析,能把mg/L级挥发性成分从脂质或水质介质中浓缩数千倍,对微量成分萃取率较高,但是操作温度高,所得精油的香气有明显的失真现象。

1.3.8微波提取法

在传统的萃取过程中,能量首先无规则的传递给萃取剂,然后萃取剂扩散进入基体物质,再从基体溶解或夹带多种成分扩散出来,即遵循加热、渗透进基体、溶解或夹带、渗透出来的模式。

微波萃取法则是利用微波能来提高萃取效率的一种新技术。

不同物质的介电常数不同,其吸收微波能的程度不同,在微波场中,吸收微波能力的差异使得基体物质的某些区域或萃取体系中的某些组分被选择性加热,从而使得被萃取物质从基体或体系中分离出来,进入介电常数较小,微波吸收能力相对较差的萃取剂中。

与传统萃取方法比较,微波萃取法的主要特点是快速、节能、节省溶剂、污染小、可实行多份试样同时处理,而且有利于萃取出热不稳定的物质,可以避免长时间的高温引起的样品分解,有助于被萃取物质从样品基体上解吸,特别是适合于处理大量样品。

由于微波萃取法能对萃取体系中的不同组分进行选择性加热,因而成为至今唯一能使目标组分直接从基体分离的萃取过程,具有较好的选择性。

1.3.9超声提取法

超声提取法是利用超声波的空化作用、机械效应和热效应等加速胞内有效物质的释放、扩散和溶解,显著提高提取效率的提取方法。

其原理为:

超声提取的主要理论依据是超声的空化效应、热效应和机械作用。

当大能量的超声波作用于介质时,介质被撕裂成许多小空穴,这些小空穴瞬时闭合,并产生高达几千个大气压的瞬间压力,即空化现象。

超声空化中微小气泡的爆裂会产生极大的压力,使植物细胞壁及整个生物体的破裂在瞬间完成,缩短了破碎时间,同时超声波产生的振动作用加强了胞内物质的释放、扩散和溶解,从而显著提高提取效率。

贤景春等[49]关于超声提取龙眼核总黄酮量的工艺研究表明,采用超声方法对龙眼核总黄酮量进行提取,工艺设备简单,操作方便,提取时间短,温度、浓度适中。

此外超声波提取具有提取效率高,提取时间短,提取温度低,提取适应性广,提取的药液杂质少、有效成份易于分离、纯化,提取简单易行、设备的维护和保养方便的优点。

1.4本课题研究的目的

党参精油是烟用香料的一种,烟用香料与卷烟产品之间是相辅相成的关系,是烟草制品添香矫味的重要添加剂,即可调和使用也可单独使用,可以改善卷烟的理化特性、改善吸味、修饰烟香味、圆润香气、确立产品的风格,在一定程度上影响吸食者的感觉,其配方是烟草工业企业的核心技术。

研究其制备工艺,优化其制备条件,对于卷烟的配方和实际生产,具有重要的意义。

2实验方法

2.1实验原料与试剂

党参(福瑞大药房)

石油醚(AR,天津市凯通化学试剂有限公司);

无水硫酸钠(AR,烟台市双双化工有限公司);

二氯甲烷(CH

Cl

AR,天津市凯通化学试剂有限公司);

无水乙醇(CH

CH

OH,AR,天津市凯通化学试剂有限公司);

2.2主要实验仪器

水蒸气蒸馏装置;

超临界流体(CO

)萃取装置;

HP589OⅡ气相色谱仪(美国惠普公司);

HP5988气相色谱质谱联用仪(美国惠普公司);

调温电热套(北京中兴伟业仪器有限公司);

旋转蒸发器RE—52AA(上海亚荣生化仪器厂);

电热鼓风干燥箱(上海—恒科学仪器有限公司);

KQ2200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);

HP6890GC/5973MS型气相色谱-质谱联用仪(美国惠普公司);

流水式高速中药粉碎机(浙江省温岭市大德中药机械有限公司);

KQ5200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);

SHZ—D(III)循环水式多用真空泵(西安波意尔精密仪器有限公司);

HA230-50-03型超临界萃取设备(杭州华黎泵业有限公司);

另外,还有烧杯、锥形瓶、漏斗、圆底烧瓶、平底烧瓶、电子天平、量筒、冷凝管、布氏漏斗、抽滤器、吸耳球、玻璃棒、分液漏斗等仪器。

2.3党参的超声提取法

原料的预处理:

将每一党参根剪成小碎块,装于袋

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