壳聚糖修饰植物甾醇脂质体的制备及稳定性研究.docx

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壳聚糖修饰植物甾醇脂质体的制备及稳定性研究

壳聚糖修饰植物甾醇脂质体的制备及稳定性研究

程铭1焦文佳1陶冶1夏廉臣1王雪晖1王春维1,2

（武汉轻工大学食品科学与工程学院1，武汉430023；

国家粮食局粮油资源综合开发工程技术研究中心2，武汉430023）

摘要采用乙醇注入法制备植物甾醇脂质体（PhytosterolLiposome，PLs），并以不同浓度壳聚糖进行修饰优化制备工艺；通过粒径、PdI、电位和稳定性指数，分析评价了壳聚糖修饰植物甾醇脂质体（ChitosanmodifiedPhytosterolLiposome，CS-PLs）在不同环境下的稳定性；并对壳聚糖修饰前后PLs进行了体外胃肠消化环境稳定性试验。

结果表明：

当壳聚糖浓度为0.3mg/mL时可获得粒径小、分布均一的CS-PLs；且pH、温度和离子强度及种类均对CS-PLs稳定性有显著影响；PLs经壳聚糖修饰前后，胃消化稳定性均良好，但在模拟肠消化环境中，经壳聚糖修饰后的PLs表现出更好的稳定性。

关键词植物甾醇脂质体壳聚糖稳定性体外消化

Preparationandstabilitypropertiesofchitosanmodifiedphytosterolliposomes

ChengMing1JiaoWenjia1TaoYe1XiaLianchen1WangXuehui1WangChunwei1,2

（CollegeofFoodscienceandEngineering,WuHanPolytechnicUniversity1,WuHan430023;

GrainandOilResourcesComprehensiveExploitationandEngineeringTechnologyResearchCenterof

StateAdministrationofGrain2,WuHan430023）

AbstractPhytosterolliposomes（PLs）werepreparedbyethanolinjectionmethod,andthepreparationprocesswasoptimizedbychitosanmodifiedwithdifferentconcentration.Thestabilityofchitosanmodifiedphytosterolliposomes（CS-PLs）wasanalyzedandevaluatedbyparticlesize,PdI,ZetapotentialandTSIindifferentenvironments.ItalsocomparedthestabilityofPLswithCS-PLsinvitrogastrointestinaldigestionenvironment.TheresultsindicatedthatthesmallanduniformparticlesizeofCS-PLscanbeobtainedwithchitosanconcentrationof0.3mg/mL.ThepH,temperature,ionicstrengthandtypehavegreateffectonthestabilityofCS-PLs.ThePLswithorwithoutchitosanmodifiedwerestableingastricdigestion;butCS-PLsshowedbetterstabilityinsimulatedintestinaldigestionthanPLs.

KeywordsPhytosterolliposomes,Chitosan,Stability,Invitrodigestion

中图分类号：

（TS201.2）文献标识码：

文章编号：

植物甾醇和胆固醇同属甾醇类，都是以环戊烷全氢菲为骨架的一种醇类化合物，在结构上极其相似，植物甾醇与胆固醇的不同之处在于其支链上的双键和甲基[1]。

植物甾醇较胆固醇支链更长，有更强的疏水性[2]，可降低人体对胆固醇的吸收。

胆固醇是脂质体等药物输送体系的重要组成部分，可嵌入磷脂双分子层，调节磷脂膜的稳定性。

随着现代人健康生活意识的不断提高，胆固醇的应用对于一些高血脂人群受到限制，为此学界开始植物甾醇取代胆固醇制备脂质体的研究。

Marie等[3]发现植物甾醇可以降低大豆磷脂膜的通透性；杨贝贝[4]的研究也表明混合植物甾醇对脂质体形成、膜的稳定性、包埋力作用比胆固醇要大。

且植物甾醇在人体内吸收率较低[5]，过量摄入也不会对人体造成危害，已被证实是一种绿色安全的降胆固醇药物，其取代胆固醇制备脂质体是国内外研究热点。

脂质体是由磷脂分散在水中形成的封闭囊泡结构，是优良的药物运输载体，可用于包埋亲水性和疏水性活性成分，具有靶向、缓释、降低毒性和提高药物稳定性等作用。

但其自身稳定性易受外界环

收稿日期：

2017-12-18

作者简介：

程铭，男，1993年出生，硕士，食品资源开发与利用

通信作者:

王春维，男，1958年出生，教授，粮油、食品、饲料资源开发

境如pH、温度、离子强度等影响。

壳聚糖是一种天然的高分子生物材料，其在酸性溶液中呈现阳离子性质，可通过静电相互作用与带负电的脂质体结合，在脂质体表面形成一层保护膜；此外疏水相互作用、氢键、范德华力等多种相互作用力的存在使壳聚糖修饰脂质体的结构变得更加丰富而复杂[6]。

刘玮琳等[7]发现以壳聚糖修饰的脂质体比未修饰的脂质体稳定，且高浓度壳聚糖修饰脂质体稳定性更好。

帅武平等[8]考察了不同相对分子量的壳聚糖对脂质体性质的影响，得到较高相对分子质量壳聚糖修饰的脂质体具有更好的稳定性和抗血清能力，同时其细胞毒性要小于阳离子脂质体。

严佳蕾等[9]研究了不同浓度壳聚糖修饰脂质体对包载姜黄素的效果，发现0.4%的壳聚糖对姜黄素脂质体保护效果最佳。

壳聚糖修饰脂质体对于提高体系稳定性，降低药物的泄漏率具有重要意义，但目前对植物甾醇脂质体的研究较少，壳聚糖修饰植物甾醇脂质体的研究亦未见报道。

本实验首先通过乙醇注入法制备植物甾醇脂质体，并以不同浓度壳聚糖对其进行修饰、优化配比。

考察了pH、温度、离子强度等对CS-PLs稳定性的影响，并通过模拟人体胃肠环境探究了脂质体的消化稳定性。

1材料与方法

1.1材料与试剂

植物甾醇（＞95%）：

武汉远成共创科技有限公司；大豆卵磷脂（70%）、壳聚糖（脱乙酰度≥95%）：

aladdin试剂公司；胃蛋白酶、胰酶：

Sigma-Aldrich公司；无水乙醇、盐酸、氢氧化钠、胆盐等试剂均为分析纯：

国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

AL204分析天平：

上海梅特勒-托利多仪器有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：

巩义市予华仪器有限责任公司；T18高速分散机：

IKA公司；R-3旋转蒸发仪：

瑞士Buchi公司；pH计：

上海奥豪斯仪器有限公司；Nano-ZS粒度仪：

英国Malvern公司；TurbiscanLab稳定性分析仪：

法国Formulaction公司；JEM-2100透射电镜：

日本电子株式会社。

1.3方法

1.3.1CS-PLs的制备

1.3.1.1PLs的制备

采用乙醇注入法[10]制备PLs，将大豆卵磷脂与植物甾醇按4:

1的比例溶于无水乙醇中，使磷脂浓度为40mg/mL，超声溶解。

在高速分散（10000r/min）条件下，按有机相与水相比例为1:

5，将卵磷脂植物甾醇混合液缓慢注入水中，继续分散2min，旋转蒸发去除乙醇，加水稀释至原水相含量，得到PLs。

1.3.1.2CS-PLs的制备

壳聚糖溶液的制备：

称取0.2g壳聚糖粉末溶于100mL1%乙酸水溶液中，40℃水浴搅拌溶解，过滤除去不溶物，置于4℃冰箱中水化过夜，取出后稀释备用。

分别将PLs加入等体积不同浓度的壳聚糖溶液中，调节pH至3.5，在10000r/min下高速分散2min，得到CS-PLs。

1.3.2CS-PLs理化性质表征

1.3.2.1粒径与Zata电位测定

样品用去离子水稀释至一定浓度后，采用动态光散射技术测定植物甾醇脂质体平均粒径、多分散系数（Polydispersityindex，PdI）和Zeta电位。

1.3.2.2CS-PLs稳定性分析

采用多重光散射技术（扫描波长880nm），分析不同环境下脂质体的稳定性。

将制备好的样品振荡摇匀，倒入样品池中，测定脂质体的稳定性指数TSI（TurbiscanStabilityIndex）。

测试样品加入量为15～20mL，测定温度为25℃，测定时间为1h，扫描间隔为25s。

1.3.2.3CS-PLs形态观察

取制备好的CS-PLs样品1mL，用去离子水稀释至磷脂浓度为0.8mg/mL，滴至专用铜网上，滤纸吸干多余脂质体；用3%磷钨酸进行负染色，并用滤纸轻轻吸干多余染液，自然挥干，透射电镜下观察脂质体微观结构。

1.3.3CS-PLs体外消化稳定性

1.3.3.1消化液配制

参照Liu等[11]报道的模拟胃肠消化液的配制方法并加以改进。

胃液储备液（Simulatedgastricfluid,SGF）的配制：

取2gNaCl溶于800mL去离子水中，用0.1mol/LHCl调节其pH至2.0，定容至1L，4℃储藏备用。

肠液储备液（Simulatedintestinalfluid,SIF）的配制：

取6.8gKH2PO4溶于800mL去离子水中，用0.1mol/LNaOH调节pH至7.0，定容至1L，4℃储藏备用。

胃蛋白酶和胰酶分别用胃肠储备液溶解，3000r/min离心取上清液。

1.3.3.2体外模拟胃肠消化

胃消化：

将10mL脂质体与9mLSGF混合于50mL离心管，调节pH至2.0，在37℃恒温水浴摇床上，以95r/min转速平衡10min，加入1mL胃蛋白酶（80mg/mL），开始消化。

肠消化：

将胆盐溶于SIF（20mg/mL）中，搅拌溶解。

取10mL脂质体与9mlSIF胆盐混合液于50mL调节pH至7.0，在37℃恒温水浴摇床上，以95r/min转速平衡10min，加入1mL胰酶（160mg/mL），开始消化。

分别在15、30、60、120、180min取样测定消化后脂质体粒径、电位大小。

2结果与分析

2.1不同浓度壳聚糖修饰PLs的制备

以不同浓度的壳聚糖溶液修饰PLs，所得CS-PLs中壳聚糖浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8mg/mL。

如表1所示，当pH为3.5时，低浓度的壳聚糖对脂质体粒径和PdI影响较小；当壳聚糖浓度达到0.3mg/mL以上时，脂质体中会出现较大颗粒，且多分散性变差。

未添加壳聚糖脂质体粒径较小，由于磷脂带负电，脂质体也呈负电位。

而壳聚糖表面带正电荷，随着壳聚糖的加入，壳聚糖吸附在磷脂膜上，使脂质体电位由负转正，且壳聚糖浓度越高，脂质体电位越大。

当壳聚糖浓度达到0.3mg/mL时，壳聚糖吸附达到饱和，继续提高壳聚糖浓度会增加脂质体修饰层厚度，导致粒径增加，而电位变化不显著。

因此，选择0.3mg/mL壳聚糖为最佳浓度修饰PLs，分析CS-PLs的稳定性影响因素。

表1不同浓度壳聚糖修饰LPs的平均粒径、PdI和Zeta电位

壳聚糖浓度/mg/mL

平均粒径/nm

PdI

Zeta电位/mv

0

77.63±4.34

0.281±0.007

-33.5±0.9

0