完整版基于基因组重排技术的角蛋白酶高产菌株的筛选毕业设计.docx

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完整版基于基因组重排技术的角蛋白酶高产菌株的筛选毕业设计

本科生毕业论文

题目基于基因组重排技术的角蛋白酶

高产菌株的筛选

学院轻纺与食品学院　

专业轻工生物技术

学生姓名程双　

指导教师吴重德

二Ο一四年六月四日

基于基因组重排技术的角蛋白酶高产菌株的筛选

专业：

轻工生物技术

学生：

程双指导老师：

吴重德

摘要

角蛋白酶以其特异性分解角蛋白的特性，在废弃羽毛的处理，清洁制革技术等领域中得到广泛应用。

本论文以实验室保存的地衣芽孢杆菌（BacilluslicheniformisX-47）作为亲本菌株，利用基因组重排技术，筛选高产角蛋白酶的菌株。

对基因组重组的条件进行了优化，得到BacilluslicheniformisX-4的最佳基因组重排条件为：

菌龄8h，溶菌酶酶浓度1.0mg/mL，酶解时间30min，酶解温度40℃，融合时间15min，融合温度35℃，融合pH9.0，融合PEG浓度400g/mL。

通过筛选得到第一代融合子Y1-28和Y1-31，Y1-28角蛋白酶活力为240.9±7.2U/mL，Y1-31角蛋白酶活力为257.5±17.5U/mL，较原始菌株分别提高了68.4%和80.0%。

以Y1-28和Y1-31为亲本，筛选的第二代融合子Y2-33角蛋白酶活力为318.2±31.2U/mL，与较原始菌株相比提高了122.4%。

关键词：

基因组重排技术角蛋白酶地衣芽孢杆菌

Screeningofhighkeratinase-producingstrains

bygenomeshuffling

Major:

BiotechnologyforLightIndustry

Student:

ChengShuangSupervisor:

WuChongde

Abstract

Keratinase,specializedindegradationofkeratin,isusedextensivelyinthetreatmentofwastefeatherandthetechnologyofcleanproductioninleatherindustry.Thismanuscriptaimedtoscreenhighkeratinase-producingstrainthroughgenomeshufflingbyusingBacilluslicheniformisX-47asparentalstrain.Theconditionsforgenomeshufflingwereoptimized.theoptimalcellagewas9h,andtheoptimallysozymeconcentration,enzymatictime,andtemperaturewere1.0mg/mL,30min,and40℃,respectively.Thefusiontime,fusiontemperature,pH,andPEFconcentrationwere15min,35℃,pH9.0and400g/mL,respectively.Undertheoptimalconditions,thefirstgenerationoffusantsY1-28andY1-31werescreened,andthekeratinaseactivitieswere240.9±7.2U/mLand257.5±17.5U/mL,whichincreased68.4%,and80.0%,respectively,comparedtotheparentalstrain.ThesecondgenerationoffusantY2-33wasisolatedbyusingY1-28andY1-31aspartentalstrains.TheactivityofY2-33was318.2±31.2U/mlwhichincreased122.4%comparedwiththeoriginalstrain.

Keywords：

GenomeshufflingKeratinaseBacilluslicheniformis

第一章前言

1.1角蛋白酶概述

1.1.1角蛋白及其利用

角蛋白是自然界中最丰富的蛋白质之一，人的毛发，动物的羽毛、爪子等都存在大量角蛋白[1]。

角蛋白由于其构型的不同，我们把它分为α和β两个类型的角蛋白，人类和动物的毛发就是主要由α-角蛋白构成。

β-角蛋白多见于羽毛中，来自α-角蛋白的可逆转变，以氢键连接而堆叠成多层结构组织。

因角蛋白含硫量的不同，故又把它分为硬角蛋白和软角蛋白。

硬角蛋白也被称为真角蛋白，它拥有含脂类少、结构牢固、含硫量高、组织紧密等特点；而软角蛋白又被称为假角蛋白，它的含硫量不超过3%，脂类较多，组织结构柔软而疏松，不耐热，但其伸缩性比硬角蛋白要好[2-4]。

高度交联的胱氨酸残基二硫键、氢键以及分子间疏水的相互作用使得角蛋白化学性质稳定，机械强度高，导致角蛋白难以被胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶等我们常见的一般蛋白酶所水解[5]。

角蛋白不能被畜禽直接吸收利用，必须经过高温、高压处理或者酸、碱、酶作用，变成短肽或游离氨基酸，才可以被畜禽利用。

羽毛是家禽经过一定处理后废弃的产物，每年废弃羽毛的数量相当巨大，全球达到了几百万吨。

作为角蛋白的主要来源，羽毛拥有极高的蛋白质含量，在作为优质蛋白质使用上具有巨大潜力[6-7]。

同时，羽毛角蛋白还可以作为优质的饲料或者饲料添加剂[8-9]。

角蛋白的应用十分广泛，它还可以用于生产氨基酸微量元素鳌合剂,与微量金属离子反应，生成稳定安全的环形结构化合物，从而可以提高微量元素的利用率。

反应生成的鳌合物易于吸收利用，能够有效改善动物体内的生理机能[10]。

由于全球鸡养殖的数量巨大，基于简单的生产工艺，使得鸡羽毛制复合型氨基酸铁成本低廉，有助于推广[11]。

1.1.2角蛋白酶的研究

Nickerson等[12]在1963年第一次提出了拥有降解角蛋白活性的酶称为角蛋白酶。

角蛋白酶能够特异性降解角蛋白，将角蛋白水解成较短的肽链或者游离的氨基酸。

自然界中能够分泌角蛋白酶的微生物主要有细菌、真菌、放线菌等。

角蛋白酶是一种诱导酶，需要羊毛等角蛋白外部诱导才能生成。

Wawrzkiewica等[13]发现羽毛角蛋白可诱导Trichophytongallinae的角蛋白酶的表达。

再比如链霉菌分泌的角蛋白酶，如果没有诱导物进行培养，角蛋白酶产量只有原来的1/5.71[14]。

微生物分泌的角蛋白既有胞内酶又有胞外酶，但大多数分泌胞外酶，然而霉菌却会既分泌胞外酶又分泌胞内酶。

因角蛋白来源的不同，使得酶拥有不同的特性,以及其适宜底物也各不相同,部分角蛋白酶水解能力较强，能水解多数蛋白质,而有些则只能水解角蛋白,不能酶解胰蛋白、牛血清白蛋白等[15-16]。

已报道的多数角蛋白酶最适反应温度主要集中在30℃-75℃之间，多数为45℃-55℃，也有极少数的最适温度可以高达100℃，如Fervidobacteriumislandicum分泌的角蛋白酶[17-18]。

角蛋白酶的最适pH在酸性、中性和碱性均有分布，在4~13[19]之间，主要集中在7到10之间。

角蛋白酶一般有着比较广泛底物范围，包括多种可溶性和不溶性蛋白质，如牛血清蛋白、酪蛋白、胶原蛋白和卵蛋白等[20-21]，一种角蛋白酶仅对单一底物有较高的降解能力[22]。

1.2基因重排技术（Genomeshuffling）

1.2.1基因组重排技术原理

基因组重排（Genomeshuffling）技术在近几年飞速发展起来，是一种极其高效的微生物育种方法。

菌株诱变改良，再杂交育种，让不同的突变菌株的基因组能够充分重组，增加不同正向突变整合到一个重组子中的机会，从而大幅度提高了正变率，得到我们想要的表现型[23-24]。

基因重排技术被Stephanopoulos认为是菌种选育上的里程碑[25]。

亲本基因库在多位置发生交换和重组，大大的促进了正突变融合子的产生[26]。

1.2.2基因组重排技术方法

Zhang等[27]于2002年在Nature上首次提出将基因重组技术结合传统育种技术，通过多亲本基因重组交换，得到优良表型。

基因组重排技术是一种新型的育种技术，它是建立在原生质体融合技术之上的，让不同基因组重排的过程[28]。

基因组重排技术主要有三个步骤：

1）亲本基因库的建立；2）原生质体递归融合；3）融合子的筛选。

1.2.2.1亲本基因库的建立

建立亲本基因库是基因重组技术的基础，以原始菌株为基础，通过不同手段得到更多基因型，收集目的性状的菌株，从而形成所需的亲本基因库。

亲本菌株的筛选一般是菌株必须具备理想目的表型，如耐高温、高产或高生长率等。

亲本基因库的建立主要还是通过经典育种方法，诱变育种和直接筛选。

采用组合的经典育种方法能够保证基因库的多样性，很大程度上丰富亲本基因组库。

1.2.2.2原生质体递归融合

原生质体融合技术是基因组重拍技术的基础。

随着科技的发展，细胞基因重组的手段有很多，然而原生质体融合因为具有高频率的基因转移和重组效率被广泛使用。

但是多亲本的融合仍会发生较低的重组效率[27]，这个问题现在通过原生质体递归融合得到有效的解决。

多轮递归融合确保了基因的高转移频率，基因组重排的高效性也得到了保持。

原生质体的制备是递归融合的首要过程。

不同微生物的细胞壁结构会有很大差别，随意在原生质体的制备中，主要需要考虑到菌株的最适菌龄、最佳酶解浓度、最佳酶解时间、最佳温度的选择，以及再生培养基的设计等。

原生质体融合技术应用得最广泛的主要是化学助融和电处理融合法[29]。

然而随着科技的不断发展，越来越多的新技术产生，提高了原生质体融合的制备率和再生率。

红发夫酵母使用激光诱导融合来提高融合率[30]，微流体芯片技术也被用作诱导细胞融合[31]，镭射光镊子也作为一种新新技术被应用于细胞工程[32]。

图1-1原生质体融合过程示意图

Fig.1-1Theprocessofprotoplastfusion

1.2.2.3融合子的筛选

融合子的筛选是整个基因组重排过程中最为关键的步骤。

传统的菌株工程把基因多样性的产生和目的形状的筛选作为中心内容，基因多样性的方法已经有一些深入的研究，然而目的形状筛选方法仍然有待发展。

对于融合子的筛选，目前主要还是采用对目的菌产物的物理和化学性质分析判定。

如John等[33]利用能直接水解淀粉的乳酸融合菌在培养基上产生的透明圈的大小来筛选高产融合菌。

近年来，灭活标记、抗药性标记、光谱学标记和其他标记等方法也被应用于融合子的筛选，为基因组重排技术提供了一个新的方向。

1.2.3基因组重排技术的优点

基因组重排技术，与经典育种相比，有其独特优势。

（1）相比传统诱变选育更快更高效。

传统诱变育种通常把每一轮的突变体中筛选出的最优的一株菌作为下一轮诱变的出发菌株，而基因组重排技术则是将一次诱变获得许多正突变菌株共同作为亲本菌株，经过递归多轮融合实现大范围内的基因重组，以更高更快的效率获得目的菌[34]。

（2）能提高子代菌株的遗传多样性。

基因组重排技术以原生质体融合技术为基础，但基因组重排技术在于使用多亲本，而不是像原生质体融合一样使用双亲本。

进行多轮递归融合，能产生多样的突变组合，这将大大增