微生物限度检查方法及其验证报告.docx
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微生物限度检查方法及其验证报告
文件编号：
73021
微生物限度检查方法及其考证报告
1样品有关信息基本信息
2主要仪器设施和试验耗材信息主要使用的仪器设施
试验用培育基试验用试剂
试验用菌种
3试验环境
无菌室
干净工作台生物安全柜
4试验方案考证试验目的
微生物限度检查方法草案
5方法考证试验
菌液制备
计数培育基合用性检查
控制菌检查用培育基使用性检查
供试液制备
方法考证
菌落计数方法考证试验
控制菌检查方法的考证
方法考证结论
6供试品微生物限度检查结果
1样品有关信息基本信息（三批）
品名
规格
多烯酸乙酯软胶囊或蛹油α-亚麻酸乙酯胶丸粒，30粒/瓶或粒，30粒/瓶
批号
2主要仪器设施和试验耗材信息主要使用的仪器设施
仪器名称
型号
编号
HH·BⅡ·360
ZL-025
培育箱
MJX-150
ZL-042
SPX-150B
ZL-046
JJ-5
ZL-026
电子天平
JY1001
ZL-013
超净工作台
JH-DCB
ZL-028
生物安全柜
BSC-1100ⅡA2
ZL-029
试验用培育基
比较培育基
培育基名称
批号
生产厂家
胰酪大豆胨琼脂培育基
中国食品药品检定研究院
胰酪大豆胨液体培育基
沙氏葡萄糖琼脂培育基
沙氏葡萄糖液体培育基
麦康凯液体培育基
麦康凯琼脂培育基
RV沙门增菌液体培育基
试验用培育基
培育基名称
胰酪大豆胨琼脂培育基
胰酪大豆胨液体培育基
沙氏葡萄糖琼脂培育基
沙氏葡萄糖液体培育基
麦康凯液体培育基
麦康凯琼脂培育基
RV沙门增菌液体培育基
配制批号
试验用试剂
试剂名称配制批号
含1%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液
含%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液%氯化钠
1%红四氮唑
试验用菌种
菌种名称
菌种编号
工作用菌种批号及代数信息
大肠埃希菌
CMCC（B）44102
E-02
3
枯草芽孢杆菌
CMCC（B）63501
E3-02
金黄色葡糖球菌
CMCC（B）26003
E-02
3
乙型副伤寒沙门菌
CMCC（B）50094
E3-02
白色念珠菌
CMCC（F）98001
E3-02
黑曲霉
CMCC（F）98003
E-02
3
3试验环境
《中国药典》2015版规定，微生物限度检查应在环境干净度10000级下的局部干净度100级的单向流空气地区内进行。
本企业微生物限度室、阳性比较室、生物安全柜及超净工作台干净度检测无特别状况下每季度进行一次。
无菌室
无菌室按《医药工业干净厂房设计规范》GB50457-2008监测，静态干净度检测结果切合GB50457-2008对10000级干净度要求。
超净工作台
超净工作台按《医药工业干净厂房设计规范》GB50457-2008监测，静态干净度检测结果切合GB50457-2008对100级干净度要求。
超净工作台沉降菌检测记录
左0
中0
右0
沉降菌落数
0
空白比较
生物安全柜
生物安全柜按《生物安全实验室建筑技术规范》GB50346-2011监测，静态干净度检测结果切合GB50457-2008对100级干净度要求。
生物安全柜沉降菌监测记录
左0
中0
右0
沉降菌落数
0
空白比较
4试验方案
按《中国药典》2015年版第四部：
（公则1105）非无菌产品微生物限度检查：
微生物计数法、（公则1106）非无菌产品微生物限度检查：
控制菌检查法、（公则1107）非无菌药品微生物限度标准及（公则1121）抑菌效劳检查法例定，本品微生物限度标准为：
1g供试品中，需氧菌总数不得过1000cfu，霉菌和酵母菌总数不得过100cfu，大肠埃希菌不得检出。
考证试验目的
确认所采纳的方法合适于本品的微生物限度检查。
即确认本品在该检查量
及该查验条件下无抑菌活性或其抑菌活性已被充分除去到能够忽视不计。
保证
查验结果的正确、靠谱及查验方法的完好性。
微生物限度检查方案
对三批产品进行3次独立的平行试验。
取本品10g，加含1%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试品分别均匀，制成1：
10的供试液。
取1：
10的供试液1ml，加含1%聚山梨酯80的无菌氯化
钠-蛋白胨缓冲液至9ml，即为1：
100的供试液。
微生物计数法，取1：
10的供试液1ml，注入平皿中，依法检查（中国药典2015年版四部公则1105）；控制菌
检查法，取1：
10的供试液10ml，置胰酪大豆胨液体培育基100ml中，依法检
查（中国药典2015年版四部公则1106）。
5方法考证试验
对上述非无菌产品微生物限度检查方法方案进行考证。
菌液制备
（1）接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、沙门菌的新鲜培育物至胰酪大豆胨液体培育基中，30～35℃培育18～24小时；接种白色念珠菌的
新鲜培育物至沙氏葡萄糖液体培育基中，20～25℃培育2～3天。
上述培育物用无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
（2）接种黑曲霉的新鲜培育物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培育基上，20～25℃培育5～7天，加入3ml%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
而后，过滤菌丝吸出孢子悬液至无菌试管内，用%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。
计数培育基合用性检查
（实验时间：
）
取上述制备好的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液各1ml（小
于100cfu），分别注入无菌平皿中，立刻倾注胰酪大豆胨琼脂培育基，每株试验
菌平行制备2个平板，混匀，凝结，置30～35℃培育3～5天，计数；取上述制
备好的白色念珠菌、黑曲霉菌液各1ml（小于100cfu），分别注入无菌平皿中，
立刻倾注沙氏葡萄糖琼脂培育基，每株试验菌平行制备2个平板，混匀，凝结，
置20～25℃培育5～7天，计数；同时，用相应的比较培育基代替被检培育基进行上述试验。
若被检培育基上的菌落均匀数不小于比较培育基上的菌落均匀数的
70%，且菌落形态大小与比较培育基的菌落一致，判该培育基的合用性检查切合
规定。
试验结果如表1：
表1
金黄色葡萄球
菌
培育基合用性检查结果
枯草芽孢大肠埃希
杆菌菌
黑曲霉
白色念珠
菌
比较培1
养基2
均匀
被检培1
养基2
均匀
回收率%
菌落形态大小
能否一致
结果判断
控制菌检查用培育基合用性检查
（实验时间：
）
控制菌（大肠埃希菌）检查用培育基合用性检查
麦康凯液体培育基促生长能力和克制能力检查：
接种不大于100cfu的大肠
埃希菌于被检培育基和比较培育基中，在
42～44℃培育
24～48小时，结果见表
2。
接种许多于
100cfu
的金黄色葡萄球菌于麦康凯液体培育基中，在
42～44℃
培育
24～48小时，结果见表
2。
麦康凯琼脂培育基促生长能力和指示特征检查：
接种不大于100cfu的大肠
埃希菌与被检培育基和比较培育基中，在30～35℃培育18～72小时，结果见表
2。
表
2
控制菌检查用培育基合用性检查结果
检测项
目
培育基
试验用菌
促生长能力
比较培被检培
养基养基
克制能力比较培育基
被检培育基
指示特征比较培育基
被检培
养基
大肠埃
麦康凯
大肠
希菌
液体培
+
+
/
/
/
/
养基
麦康凯
金葡
大肠
/
/
+
+
/
/
琼脂培
+
+
/
/
+
+
养基
结论
注：
表中“+”标示有能力，“-”标示没有能力，“/”标示不要求做
供试液制备
（实验时间：
）
取本品10g，加含1%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试品分别均匀，制成1：
10的供试液。
取1：
10的供试液1ml，加含1%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml，即为1：
100的供试液。
方法考证
（实验时间：
）
菌落计数方法考证试验
（1）菌液组：
分别取菌液1ml，采纳平皿计数法，测定上述备好的菌液中每毫升的活菌数，测定结果见表3。
（2）供试品比较组：
取1：
10的供试液1ml，注入平皿中，测定供试品本底
的需氧菌总数，测定结果见表4。
取1：
10的供试液1ml，注入平皿中，测定供
试液品本底的霉菌和酵母菌总数，测定结果见表4.
（3）试验组：
取1：
10的供试液1ml和上述控制菌菌液1ml（小于100cfu试
验菌）分别注入同一平皿中，测定结果见表5，回收率见表6。
另取1：
10的供
试液的供试液1ml和上述真菌菌液1ml（不大于100cfu试验菌），分别注入同一平皿中，测定结果见表5，回收率见表6。
（4）稀释剂比较组：
取1%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml、无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1ml分别注入平皿中，测定结果见表7。
上述已注入供试液的平皿（此中试验组在注入供试液和控制菌菌液后应立刻倾注
培育基），需氧菌总数，倾注胰酪大豆胨琼脂培育基，待凝结后，置30～35℃培
养3～5天每日察看结果，霉菌和酵母菌总数，倾注沙氏葡萄糖琼脂培育基，待凝结后，置20～25℃培育5～7天每日察看结果。
表3菌液组菌落计数（cfu/皿）
大肠埃希菌
金黄色葡萄
枯草芽孢杆
白色念珠菌
黑曲霉
球菌
菌
1
2
平
均
表4供试品比较组菌落计数（cfu）
试验次数
需氧菌总数
霉菌和酵母菌总数
1ml
均匀
1ml
均匀
1
2
3
表5
试验组菌落计数（cfu）
试验
大肠埃希菌金
黄色葡萄
枯草芽孢
白色念珠
次数
球菌
杆菌
黑曲霉
菌
1
12
均匀
1
22
均匀
1
32
均匀
表6试验组回收率测定结果回收率%
试验次数
大肠埃希菌
金色葡萄球
枯草芽孢杆
白色念
黑曲霉
菌
菌
珠菌
1
2
3
表7稀释液比较组
试验次数
无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液
1%聚山梨酯80的无菌氯化
钠-蛋白胨缓冲液
1
2
3
均匀
经上述实验考证，采纳上述方法方案进行本品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数可使用回收率达到要求。
控制菌检查方法的考证
（实验时间：
）
菌液制备
接种大肠埃希菌的新鲜培育物至10ml胰酪大豆胨液体培育基中，33℃培育24小时。
用%无菌氯化钠溶液9ml制成每1ml含菌数为10cfu~100cfu菌悬液。
大肠埃希菌检查方法的考证
（1）供试品组：
取1：
10的供试液10ml，加至胰酪大豆胨液体培育基100ml
中，置33℃培育24小时。
（2）阴性比较组：
取稀释液10ml，加至胰酪大豆胨液体培育基100ml中，置
33℃培育24小时。
（3）取上述培育物1ml接种至100ml麦康凯液体培育基中，置43℃培育24
小时，察看结果，见表7。
表8大肠埃希菌检查结果
大肠埃希菌
胰酪大豆胨液体培育基麦康凯液体培育基
供试品组
阴性比较组
表8结果显示，表示本品在该条件下对大肠埃希菌无抑菌作用或其抑菌作用能够忽视不计。
说明采纳该法进行本品的大肠埃希菌检查可行。
方法考证结论
上述考证试验结果证明，非无菌产品微生物限度检查方法方案可行。
依照考证结果，拟订非无菌产品微生物限度检查方法以下：
微生物限度取本品10g，加含1%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白
胨缓冲液至100ml，使供试品分别均匀，制成1：
10的供试液。
必需时，取1：
10的供试液1ml，置含1%聚山梨酯80的无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至9ml
中，即为1：
100的供试液。
需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数，分别取1：
10的
供试液1ml，注皿，微生物计数法，取1：
10的供试液1ml，注入平皿中，依法
检查（中国药典2015年版四部公则1105）；控制菌检查法，取1：
10的供试液
10ml，置胰酪大豆胨液体培育基100ml中，依法检查（中国药典2015年版四部
公则1106）。
1g供试品中，需氧菌总数不得过100cfu，霉菌和酵母菌总数不得过10cfu；
不得检出大肠埃希菌。
6供试品微生物限度检查结果
依照上述确立的非无菌产品微生物限度检查方法查验三批供试品，结果切合
规定，结果见下表。
批号
需氧菌总数
（cfu/g）
霉菌和酵母菌总数
（cfu/g）
控制菌检查
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