植物MS组培实use.docx

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植物MS组培实use

植物MS组培实（use）

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实验一、MS液体成份的配制

一、实验目的：

1、掌握植物组织培养常用MS液体培养基成份的配制；

2、为后续组培实验做好准备工作。

二、实验基本原理

MS培养基是Murashige和Skoog（二人缩写）于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，其养分的数量和比例合适，是较稳定的离子平衡溶液，能满足植物细胞的营养和生理需要，适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。

三、实验仪器与与试剂

1、实验仪器：

1000ml/500ml量筒4个、250ml三角瓶（每人2个）、1000ml烧杯或塑料量杯5个、1000ml试剂瓶5个、10只100mL试剂瓶、微波炉、10ml离心管15个、玻璃棒5个、电子天平、称量纸、卷纸、移液枪（1000µL、100µL）、药勺。

2、实验试剂：

见下述实验方案中所列。

四、实验方案与操作

1、大量元素20X母液配制（贮备液I）

配制20X（倍）浓度大量元素母液1000mL，按顺序充分溶解后再加后一个试剂。

KNO31900mg/L（1.9g/L）

NH4NO31650mg/L（1.65g/L）

KH2PO4170mg/L（0.17g/L）

MgSO4.7H2O370mg/L（0.37g/L）

CaCl2.2H2O440mg/L（0.44g/L）（可单独瓶配制存放）

2、微量元素100X母液（贮备液II）配制：

配制100X（倍）浓度大量元素母液1000mL，按顺序充分溶解后再加后一个试剂。

KI0.83mg/L（先配母液：

0.83gKI溶于8mL水）

H3BO36.2mg/L（先配母液：

0.62g溶于8mL水）

MnSO4.4H2O22.3mg/L（先配母液：

0.22g溶于8mL水）

ZnSO4.7H2O8.6mg/L（先配母液：

0.86g溶于8mL水）

Na2MoO4.2H2O0.25mg/L（先配母液：

0.25g溶于8mL水）

CuSO4.5H2O0.025mg/L（先配母液：

0.25g溶于8mL水）

CoCl2.6H2O0.025mg/L（先配母液：

0.25g溶于8mL水）

3、铁盐100X母液（贮备液III）

配制100X（倍）浓度大量元素母液1000mL，按顺序充分溶解后再加后一个试剂。

Na2EDTA.2H2O37.3mg/L

FeSO4.7H2O27.8mg/L

4、有机成分100X母液（贮备液IV）

配制100X（倍）浓度大量元素母液1000mL，按顺序充分溶解后再加后一个试剂。

肌醇100mg/L

甘氨酸2mg/L（先配母液：

0.2g溶于8mL水）

盐酸硫胺素（VB1）0.1mg/L（先配母液：

0.02g溶于8mL水）

盐酸吡哆醇（VB6）0.5mg/L（先配母液：

0.05g溶于8mL水）

烟酸（VB5）0.5mg/L（先配母液：

0.02g溶于8mL水）

5、植物生长调节剂的配制：

•6-BA（1mg/mL）：

称10mg6-BA先溶于1mL1M盐酸充分溶解，再加9mL以蒸馏水，混匀。

•NAA（1mg/mL）：

称10mgNAA先溶于1mL95%乙醇充分溶解，再加9mL以蒸馏水，混匀。

五、实验注意事项

1、配制贮存母液时，要算好各种成分逐次加入，等第一种成分完全溶解后再加入第二种成分，切忌“一锅煮”。

有机物质配好以后要装入棕色瓶放入电冰箱内保存，其它三种母液可在常温下保存但最多不能超过一个月；

2、pH值对培养基的硬度有影响，pH过高培养基变硬，pH过低培养基不能凝固，所以要调整好培养基的pH值；

六、作业：

认真总结，完成本实验报告。

实验二、MS固体培养基的配制与灭菌

一、实验目的

1、掌握植物组织培养常用MS固体培养基的配制和灭菌方法；

2、为下次组培实验做好准备工作。

二、实验仪器与试剂

1、实验仪器

高压灭菌锅、微波炉、100-200个组培瓶、pH试纸、4个1000mL量筒、4个1000mL塑料量杯、4只玻璃棒、移液枪（1000µL、100µL）、称量纸、卷纸、电子天平、药勺

2、实验试剂：

10％NaOH、1MHCl、蔗糖，琼脂

三、实验操作步骤

1、在1000mL塑料量杯中，先加入800mL双蒸水，再按比例依次加入下列MS成份：

大量元素20X母液：

微量元素100X母液、铁盐100X母液、有机成份100X母液

50mL10mL10mL10mL

最后再用约双蒸水（约120mL）定容到1000mL，充分混匀。

静置30min，观察无沉淀方可用。

2、称取并继续加入蔗糖30g，琼脂粉7.5g，混匀。

3、用10％NaOH调节pH至5.8（用pH试纸或pH计测试），混匀。

4、在微波炉中加热至溶液均一、稳定（要补充蒸发的水）。

5、将配好的MS培养基趁热迅速分装至三角瓶或广口组培瓶中，每瓶倾倒30ml即可，盖上瓶盖（盖要松点），装入灭菌筐。

6、放入高压灭菌锅121℃，灭菌20min（整个过程约1h左右）。

7、灭菌结束后，立即拿出瓶子，趁热拧紧每个瓶盖。

8、置于组培室架子上观察3-7天，无菌落长出说明良好，供下步组培用。

四、作业：

认真总结，完成本实验报告。

实验三、外植体的消毒、接种与培养

一、实验目的

掌握外植体材料化学消毒和在固体培养基上接种的方法。

二、实验仪器与试剂

1、实验材料：

新鲜胡萝卜

2、实验仪器

超净工作台、酒精灯、三角瓶、培养皿、镊子、刀片、剪刀、烧杯、灭菌滤纸、纱布

3、实验试剂

配制好的MS固体培养基、10%次氯酸钠、无菌水、酒精、NAA，6-BA，NaOH

三、实验操作方法

（一）外植体的消毒

1、准备工作：

提前40min打开超净工作台紫外灯杀菌20min，关闭后再打开风机吹20min。

坐到超净台前，将装有经湿热灭菌MS固体培养基的三角瓶、配好的消毒液、洗净沥干的植物材料置于超净工作台上，用70%酒精棉球擦手与器具外壁。

2、外植体的消毒：

选取胡萝卜的韧皮部，用水洗净。

先用70％酒精浸泡15-30s，然后放入6％的次氯酸钠溶液浸泡20min，进行材料脱毒，然后用无菌水冲洗5次。

（二）外植体的切片与接种

用刀片切取红色韧皮部（不含中央黄色部位）成1cm2大小方块，厚度约0.2cm。

将消毒好的胡萝卜韧皮部切片，在超净工作台上用镊子接种于已灭菌的含MS固体培养基的三角瓶中，封口。

注意规范操作，防止污染。

（三）外植体的初步培养

将接种后的培养基三角瓶置于组培室光照培养架上，先弱光培养1周，再1000-2000lux光照培养数周，光周期为每天光照14～16h/黑暗8～10h。

期间经常来观察，及时清除有污染者和观察外植体的变化。

四、实验注意事项

1、实验所使用的器材要严格灭菌，注意无菌操作，避免因染菌导致实验失败；

2、材料脱毒时不要在酒精中停留过长时间，以免材料被杀死；

3、接种后进行培养时，为确保实验成功，可以首先进行7-10d的暗培养，然后再进行光照培养。

五、作业：

认真总结，完成本实验报告。

实验四、胡萝卜韧皮部的继代培养培养与观察

一、实验目的

学习并掌握外植体在固体培养基上继代培养方法和不同阶段的培养方案与技术区别。

二、实验仪器与试剂

1、实验材料：

前期培养的外植体

2、实验器具

超净工作台、高压灭菌锅、酒精灯、三角瓶、培养皿、镊子、刀片、剪刀、烧杯、灭菌滤纸、纱布

3、培养基方案

分化培养基：

基本MS培养基（含30g/L蔗糖、7.2g/L琼脂，pH5.8）＋3mg/L2,4-D+1mg/LKT+300mg/LCef。

生根培养基：

1/2MS（含28g/L蔗糖、7g/L琼脂，pH5.8）+1mg/L2,4-D+200mg/LCef。

三、实验操作方法

1、外植体的继代与愈伤组织培养

将暗培养1周后的胡萝卜外植体在无菌条件下转移到含500mg/LCef的抑菌与愈伤培养基上，在26℃光照培养箱中继续培养，以促进愈伤细胞的增殖。

2、分化培养

将愈伤培养后的胡萝卜外植体在无菌操作下转入分化培养基上，在组培室中（25℃，光照，RH75～85%）进行继代培养，以诱导不定芽或胚状体的发生。

光周期为每天光照14～16h/黑暗8～10h，继代培养周期为8～16天（取决于有无污染情况），这是一个漫长且极其重要的过程，约需5-8周。

每2天观察统计有无污染、不定芽发生数量及生长情况，并及时拍照。

对于有污染的外植体应及时消毒处理并隔离培养观察或者清除。

3、芽苗的生根培养

　　当分化培养中产生的芽苗生长到2-3cm时，用手术刀切下插入到1/2MS生根培养基浅层，在组培室中继续进行继代培养（适当增加光照强度和光照时间），约在2～4周内可生长出大量白色的毛发状根。

应经常观察拍照。

4、污染率、成苗率的统计

污染率＝污染的外植体个数/接种时外植体总个数×100%

成苗率＝不定芽分化成小苗的个数/接种时外植体总个数×100%

五、作业：

认真总结，完成本实验报告，将培养结果照片附在报告中。

实验五PEG介导的细胞融合

一、实验目的

1、理解PEG介导细胞融合的原理，掌握实验方法与技能。

2、了解影响细胞PEG介导融合的因素。

二、实验原理

2个或以上的细胞合并为1个细胞的现象，称为细胞融合。

细胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇（PEG）法和电融合方法。

PEG是乙二醇的多聚化合物，一般常用分子质量为MW4000—6000的50%PEG溶液，首先引起细胞的集聚与粘连，然后改变各类细胞膜的结构，使两细胞接触点处脂分子双层发生疏松和重排，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲合以及彼此的表面张力作用，使细胞发生融合，胞质流通，最后形成融合细胞。

细胞融合频率和活力与所用PEG的分子质量、浓度、作用时间、细胞的生理状态与密度等有关。

三、实验器材

1、材料：

新鲜鸡血红细胞

2、器具：

光学显微镜，离心机，恒温培养箱或恒温水浴锅，电磁炉、离心管、烧杯、容量瓶、木夹子、载玻片，盖玻片等。

3、试剂与配制：

1．0.85%NaCl溶液

2．GKN液：

8.0gNaCl，0.4gKCl，3.56gNa2HPO4·12H2O，0.78gNaH2PO4·2H2O，2.0g葡萄糖，0.01g酚红，溶于1000ml重蒸水中。

3．33%（W/V）PEG溶液

1.取10gPEG（分子质量=4000）放入50ml瓶中，在电磁炉水浴锅中加热熔化后，再边搅拌继续加热6min。

2.让PEG冷却至50℃，勿让其凝固。

3.边搅拌边加入15ml预热至50℃的GKN液，再充分混匀，置37℃水浴锅中待用。

4．肝素钠：

100ml0.85%生理盐水中溶解0.04g肝素钠（125U/mg），加入40ml全血。

可先配100倍母液：

用0.85%生理氯化钠盐水配成1%肝素溶液（200mg/10ml）。

再稀释：

按1：

40，用0.85%氯化钠溶液将母液稀释好，再采鸡血。

四、实验方法

1.鸡血的获得：

从在烧杯中事先加入配好的肝素钠（100U肝素/5ml全血），到菜市场采集鸡血，按1：

4体积比制成抗凝全血，置于4℃冰箱内可供一周内使用。

2.鸡血红细胞悬液的制备：

（1）取鸡血储备液1ml，加入4ml（4倍体积）0.85%NaCl溶液，上下颠倒轻柔充分混匀后，1500rpm离心5min，轻轻弃去上清液留沉淀。

（2）加入4ml0.85%NaCl溶液,混匀，1500rpm离心5min，轻轻弃去上清液留沉淀。

（3）给沉淀中再加入4ml0.85%NaCl溶液,混匀，1500rpm离心4min，轻轻弃去上清液留沉淀。

（4）给沉淀中再加入4mlGKN溶液,混匀，1500rpm离心4min，轻轻弃去上清液留沉淀。

（5）细胞沉淀中再加入2mlGKN稀释充分混匀使细胞悬浮，37℃温浴静置5min。

3.33%PEG溶液的制备:

称取10克PEG（MW=4,000）放入烧杯内，在微波炉上融化之，冷却至50℃,加入2倍体积（15ml）预热至50℃的GKN液，迅速混匀，制成33％PEG溶液，放入37℃水浴中待用。

4.PEG诱导细胞融合：

（5）吸取0.5ml纯化后的鸡血，沿着离心管壁逐滴加入1.0ml33%PEG溶液，边加边轻摇离心管，加完后轻弹使PEG与细胞充分混匀；

（6）然后在37℃水浴中静置15-20min；期间洗好载玻、盖玻片，待镜检。

（7）再给管中加入2mlGKN终止反应，充分混匀，37℃保温处理5min。

（8）1500r/min离心5min，去除上清，取沉淀涂片，镜检观察。

5.镜检：

在载玻片上滴1滴细胞融合悬液，加盖玻片，在显微镜下观察细胞融合情况。

统计细胞融合率：

在显微镜的视野内，已发生融合的细胞其细胞核总数与该视野内所有细胞（包括已融合细胞）的细胞核总数之比，通常以百分比表示，而且要进行多个视野测定，进行统计分析。

五、完成实验报告：

1、用手机拍摄实验结果，黑白打印后粘贴。

2、对结果进行讨论，指出影响因素和注意事项。

图1：

鸡血红细胞融合现象光镜观察（10×40）