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提取黄酮
香茅草中黄酮类化合物提取工艺研究
摘要：
香茅草作原料，乙醇浸提的方法浸提其中的黄酮类化合物并计算出其得率，首先进行黄酮类化合物的定性检验，观察提取液与显色剂的显色现象和黄酮类化合物的相吻合，就能确定该提取液中含有实验黄酮类化合物，然后通过多种单因素实验得出每种单因素的最好条件来设计正交实验，就能得到本实验所要提取的物质的一组最好的综合条件。
参照芦丁标准品绘制出的线性回归方程，把得出的数据代入线性方程就能算出黄酮类化合物的量然后计算提取液中黄酮的得率，实验结果表明:
最佳的乙醇的浓度是60%，最好的料液比是1.5:
35（g/mL），最适合的浸泡提取温度为70℃，最有效果的浸泡提取时间是1.0h。
在这种条件下的黄酮的得率可达2.27%。
关键词：
香茅草；提取；黄酮：
正交试验
StudyontheextractionprocessofFlavonoidsfromCymbopogon
Abstract：
WithCymbopogonasrawmaterial,theflavonoidsextractedwiththeuseofethanolextractionandcalculatetherate.First,thequalitativetestofflavonoidswasobservedandshowsthatthesubstancecontainsflavonoids,throughthesinglefactorexperimenttogetthebestconditionandorthogonalexperimenttogetthebestintegratedconditionofextractionofflavonoids.Withrutinasastandardforcontrol,theyieldofflavonoidsintheextractwascalculated.Theexperimentalresultsshowthat,optimumconditions:
Theconcentrationofthebest,was60%,thebestfeedliquidfor1.5:
35（g/mL）,Theheatofthebestis70℃,and1.0histhebestsoakextractiontimer.In this case ,theyieldcanreach2.27%.
Keywords：
Cymbopogon;extract;flavonoids;orthogonaltest
香茅草中黄酮类化合物提取工艺研究
前言
黄酮类化合物绝大多数都是存在于植物体当中的，它们是一种具有治癌症、预防衰老、消炎、降低人体血糖以及血压、调节人体内分泌等多种功能的一类化合物。
黄酮类化合物在植物体内大多数与糖发生相关反应变成苷类，有少数是以游离态（苷元）的形式存在。
据文献报道，香茅（Cymbopogon），禾本科香茅归类于草本植物[1]，大多数香茅都生长在东半球热带及亚热带[2]，醛类、醇类、脂类、酮类等化合物以挥发性几类物质的形式包含在香茅草中，其中它自身体内的黄酮类化合物包含木犀草素、木犀草素-6-C葡萄糖苷、木犀草素-7-O-B等[3]物质。
在园林造景也具有独特的观赏功能[4]。
在我查阅的图书和相关的文献报告中，还未发现乙醇浸提的方法提取香茅草中黄酮类化合物的研究的相关内容。
据文献报道，从植物中提取黄酮类化合物的方法主要有水提法、碱性水或碱性稀醇提取法、有机溶剂提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法、酶辅助提取法等等等等[5]，其中本实验采用有机溶剂提取方法进行。
本课题用乙醇浸提法提取香茅草中黄酮类化合物，并通过探究多种单因素对黄酮得率的影响设计正交试验并得到优化的工艺条件，开发香茅草的多重用途。
1实验部分
1.1原料、试剂和仪器
1.1.1原料
香茅草
1.1.2试剂
具体的使用试剂见附录2
1.1.3仪器
具体使用的仪器见附录3
1.2实验方法
1.2.1原料处理
香茅草→除去水分→粉碎机粉碎→备用
1.2.2香茅草中黄酮的提取
用分析天平准确称取一定质量的香茅草粉末，在相应温度相应料液比用一定量一定浓度的乙醇浸提一定时间，然后过滤，用相应浓度的乙醇将滤液定容至50mL容量瓶中，即得到黄酮提取液。
1.2.3提取液中总黄酮的定性检验[6]
对从香茅草中提取出来的溶液中是否含的有黄酮进行定性检验实验，具体内容见附录4。
1.2.4提取液中黄酮的定量分析
1.2.4.1芦丁标准溶液的配制得
将芦丁标准品置于120℃条件下进行干燥直至恒重，然后用分析天平称10.0mg于容器中，用乙醇的水溶液溶解，将溶液转移至50mL的容量瓶里，洗涤容器，将洗涤液一并转移至容量瓶中，并定容至刻度线振荡摇匀，得到它的标准溶液浓度为0.20mg/mL。
1.2.4.2测定方法依据
以芦丁标准品为对照进行提取液中黄酮得率的测定，向提取液中加入亚硝酸钠溶液、硝酸铝溶液、氢氧化钠溶液，因为如果在碱性条件下黄酮类物质与铝溶液形成一种络合物，这种络合物能在可见光区获得比较稳定的具有明显特征的吸收峰。
1.2.4.3测定波长的选择
具体的试验方法、步骤见附录5。
1.2.4.4标准曲线的绘制
具体的实验步骤与方法见附录6。
1.2.4.5测定提取液中黄酮得率的方法
用一定规格的吸量管准确地移出2.00mL样品液于25mL得比色管之中，往里面加人0.30mL5%的亚硝酸钠溶液，摇匀，放置6min之后；再往里面加入0.30mL10%硝酸铝溶液，振荡，摇匀，放置6min之后；继续向里面加入4.00mL4%的氢氧化钠溶液，振荡，摇匀，立刻使用60%的乙醇溶液定容至25mL，振荡，摇匀，放置10min之后，用试剂空白当作是参比液，在最大吸收波长的地方测定它的吸光度A，将它到代人回归方程中，得出提取液中黄酮类化合物的浓度C，再根据黄酮类化合物的绿的计算公式计算出黄酮类化合物的得率，平行实验三次，取用相应的平均值
1.2.5提取黄酮的单因素实验
1.2.5.1乙醇浓度对黄酮得率影响的研究
在原料与溶剂比是1.5:
30（g/mL）、温度是50℃的情况下，分别使用不同浓度的乙醇溶液为浸提剂浸泡提取1.0h，然后将提取液过滤再用相应浓度的乙醇溶液洗涤并用相应浓度的乙醇溶液将它的体积增加到50mL容量瓶的刻度线处，按照1.2.4.5操作方法进行显色反应后，在1.2.4.3中测出的最大吸收波长处测定溶液的吸光度然后平行实验三次。
将测出的数据代入回归方程和黄酮得率的公式里计算提取液中黄酮得率并且求出平均数据。
选择出比较适宜的乙醇浓度。
1.2.5.2浸提温度对黄酮得率影响的研究
在料液比为1.5:
30（g/mL）的情况下，使用1.2.5.1实验中选取的乙醇溶液为提取剂，不同的温度浸提1.0h，然后将提取出来的溶液过滤和洗涤，合并滤液，并分别的用1.2.5.1得出的较适宜浓度的乙醇溶液定容于50mL容量瓶中，按1.2.4.5操作方法显色反应后，于最大吸收波长的地方进行测定得出它的吸光度，然后进行平行的实验三次。
套用1.2.4.4中求出的回归方程，求它的浓度算出提取液中的得率下一步就取用平均的值找出比较适宜的浸提温度。
1.2.5.3浸提时间对黄酮得率影响的研究
在料液比为1.5:
30（g/mL）的情况下，用1.2.5.1实验中得出的最佳浓度的乙醇溶液为提取剂，用1.2.5.2实验中得出的最佳浸提温度，分别用不同的时间浸提，然后将提取液进行过滤和醇洗，合并滤液，再用相应浓度的乙醇的溶液增加体积到50mL容量瓶的刻度线处，按1.2.4.5操作的方法进行显色的反应之后，放在最大的吸收波长处进行测定测出其吸光度，之后平行的实验三次。
代入于1.2.4.4得出来的回归方程接着根据公式算出得率并取用平均的值。
选择出比较适宜的浸提时间。
1.2.5.4料液比对黄酮得率影响的研究
用1.2.5.1实验中得出的最佳浓度的乙醇溶液为提取剂，用1.2.5.2实验中得出的较佳浸提温度，用1.2.5.3实验中得出的较佳浸提时间，使用不同的料液比（g/mL）分别用1.5克的原料与20毫升、25毫升、30毫升、35毫升、40毫升的乙醇混合而成的溶液，把它们在同样的条件下进行浸提，然后将提取液过滤，洗涤，合并滤液，用相对应的乙醇溶液定容到50mL容量瓶的刻度线处，按1.2.4.5操作方法进行显色反应后，在最大吸收波长的地方进行测定测到其吸光度，之后再平行的实验三次。
代入到1.2.4.4求出来的回归方程中，算出提取液中所要提取的物质的得率，取用平均的值。
选出比较适宜的浸提的料液比。
1.2.6提取黄酮的正交实验
通过以上的单因素的实验得出的最好的条件来选择因素进行四因得素三水平的正交实验，得出得综合的最佳得浸提条件。
2结果与讨论
2.1提取液中黄酮的定性检验
按照1.2.3步骤操作，对从香茅草得中提取出来的溶液进行的该化合物的定性检验，所得结果见下表。
表2-1黄酮类化合物定性检验结果
显色试剂10%Al（NO3）35%FeCl34%NaOH氨水
现象淡黄色墨绿色亮黄色淡黄色
从表2-1明显看出，原料提取液与各显色剂反应产生的现象与黄酮类化合物的特征性颜色相吻合，说明香茅草提取液中含有黄酮类化合物。
2.2测定提取液中黄酮得率的步骤
2.2.1测定波长的确定
按照1.2.4.3步骤操作进行吸光度扫描，所得吸光度随波长变化关系见图2-1。
由图2-1可见，芦丁的标准溶液与显色剂显色之后的吸光度在不同波长处有着不同的数值，波长增大，吸光度数值随着增大，很明显，在510nm处有最大值，所以在本实验的过程中以510nm为测定波长。
2.2.2标准曲线的绘制
按照1.2.4.4步骤操作，将测出来的数据绘制成图2-2。
在所确定的测定波长处以空白为参照测定得到不同的数值，用所测出的数值绘制曲线，实验结果如上面所显示，得到线性回归方程为：
A=9.01C-0.0013，R=0.9993。
2.2.3提取液中总黄酮得率的计算
黄酮得率=
式中：
V1是第二次定容后提取液的体积（25mL）；V2是母液中量取的提取液体积（2.00mL）；C是算出的提取液中黄酮浓度；M是确定的原料的质量。
2.3提取黄酮的单因素实验
2.3.1乙醇浓度对香茅草中黄酮得率的影响
按1.2.5.1步骤操作，不同的乙醇浓度对香茅草植物体中黄酮类化合物得率的相应影响，根据数据计算相应得率绘制出的结果如下面的图2-3所表显示的结果。
由图2-3可知，当乙醇浓度为60%以下时，黄酮的得率随乙醇浓度升高而增大；当乙醇浓度为60%时，黄酮的得率达到最大，随着乙醇浓度进一步升高，黄酮得率逐渐减小，原因可能是乙醇浓度过低使得香茅草中的黄酮类物质未被浸提出来导致得率较低，而乙醇浓度过高，使得香茅草中脂溶性物质、糖类等物质逐渐渗出，进而影响了黄酮的提取率。
因此采用浓度为60%的乙醇溶液为提取剂可获得较好效果，可作为正交试验的因素及水平选择的依据。
2.3.2浸提温度对香茅草中黄酮得率的影响
按1.2.5.2的步骤进行操作，不一样的浸泡提取温度对香茅草体中黄酮类化合物得率的相应影响，并绘制得率随温度变化的关系，如图2-4所示。
如图2-4所示，温度在30℃-60℃之间从左到右呈上升的趋势可能是因为温度增加加速了黄酮类化合物的溶解致使它的得率逐渐增加，但当超过60℃后得率有所降低，原因可能是温度过高加速了溶剂的挥发进而影响了该植物中黄酮类化合物的提取效果，当温度为60℃时得率变为最大。
所以可认定温度为60℃时是该种植物中黄酮提取的较适宜温度，可选作正交试样的选择点。
2.3.3浸提时间对香茅草中黄酮得率的影响
按1.2.5.3步骤进行操作，不同的浸泡提取的时间对香茅草体中黄酮类化合物得率的相应影响，根据测得的吸光度数据和公式计算出得率，可以得到得率与浸泡时间的关系，其变化如下图所示的。
由图2-5可知，浸泡提取的时间在0.5h-1.5h之间的时候，黄酮类化合物的得率不断地随浸泡提取的时间的升高而不断地增大，当浸泡提取的时间为1.5h时就可以得到最大的得率，如果浸泡提取的时间的再接着增加的话，被提取出来的黄酮类化合物可能因不稳定而分解导致提取得率一点点减小。
因此就可以认定是浸泡提取时间为1.5h时浸泡提取可获得的结果比较好，我们就可以把1.5h的浸提时间选作后面的正交试验的选择的一个依据。
2.3.4料液比对香茅草中黄酮得率的影响
按1.2.5.4操作，不同的料液的比例对香茅草植物体中的黄酮类化合物的得率的相应的影响，将测出的吸光度代入回归方程然后再代入黄酮得率的计算公式得到的结果绘制成图：
料液比/（g/mL）
图2-6黄铜得率随料液比变化关系图
由图2-6明显指出，料液比在1.5:
20（g/mL）-1.5:
35（g/mL）区间时，香茅草提取液中黄酮类化合物的得率呈现出上升的趋势，当原料与溶液比值达1.5:
35（g/mL）时纵坐标数值就能达到最大，也就是图中的峰值，但是当料液比达到1.5:
35（g/mL）时，提取液中的黄酮类化合物的得率明显降低，原因应该是随着料液比的增加，香茅草中提取液中的黄酮类化合物已经全部都溶解析出，如果继续增大料液比的话，会由于溶剂加入量过多，可能会使香茅草中的其他物质也跟着渗出，使溶液的黏度不断地增加，进而就影响了香茅草中黄酮类化合物的提取。
所以我们根据此图就可以认定料液比为1.5:
35（g/mL）时，其他条件不变是从香茅草这种植物提取黄酮类化合物的最好的料液比，就可以把这个条件选作是正交试验的一个选择点。
2.4提取黄酮的正交实验[8]
通过2.3得出的数据来进行正交而因素和水平见表2-2正交的结果见表2-3
表2-2因素水平表
水平
CDEF
浓度/%温度/℃浸提时间/h料液比/g·mL-1
1
50
50
1.0
1.5:
30
2
60
60
1.5
1.5:
35
3
70
70
2.0
1.5:
40
表2-3正交试验结果
实验序号
水平
CDEF
黄酮得率/%
1
50%
50℃
1.0h
1.5:
30
1.52
2
50%
60℃
1.5h
1.5:
35
1.49
3
50%
70℃
2.0h
1.5:
40
1.63
4
60%
50℃
1.5h
1.5:
40
1.49
5
60%
60℃
2.0
1.5:
30
1.71
6
60%
70℃
1.0h
1.5:
35
2.21
7
70%
50℃
2.0h
1.5:
35
1.38
8
70%
60℃
1.0h
1.5:
40
1.37
9
70%
70℃
1.5h
1.5:
30
1.46
K1
4.62
4.37
5.08
4.67
最佳组合
C2D3E1F2
K2
5.41
4.58
4.44
5.08
K3
4.21
5.30
4.72
4.49
R=Kmax-Kmin
1.20
0.930
0.640
0.590
从表2-3中我们可以得出一个结果，就是极差最大的是乙醇浓度（%）最小的是料液比（g·mL-1）。
极差值如果越是小那么它对提取黄酮的得率的影响就越小，极差如果越大也就是说对提取黄酮的得率的影响就越大。
因此我们就可以得出一个结论：
各个因素对黄酮得率的影响程度为:
F（料液比）＞D（浸提温度）＞E（浸提时间）＞C（乙醇浓度）[9]。
最佳提取条件为C2D3E1F2即乙醇浓度最好的是60%、浸提温度最好的是70℃、浸提时间最好的是1.0h，料液比最好的是1.5:
35（g/mL）。
从正交的实验的结论可以确定的最佳的提取条件是：
60%是最佳的乙醇的浓度，1.5:
35（g/mL）是最好的原料与溶液的比例，70℃是最好的浸泡提取的温度，1.0h是最好的浸泡提取的时间接下来我们为了检验正交试验的准确性要进行一次验证性的实验[10]，就是平行的实验三次，计算出香茅草的提取液中的黄酮类化合物的得率。
本次实验的最后的结果见下表2-4。
表2-4最佳条件下提取液中黄酮的得率
序号
吸光度
总黄酮得率/%
总黄酮平均得率/%
1
0.486
2.25
2.27
2
0.488
2.26
3
0.494
2.29
表2-4表明，在佳条的情况下进行的实验重现性比较好，看得出来平均的得率可达2.27%。
3结论
本次实验是利用乙醇提法从香茅草中提取黄酮类化合物，也就是先进行对提取温度、料液比、提取时间、提取剂浓度等几种因素对黄酮类化合物提取率的影响的研究得出单因素的最好的条件，然后再用单因素的最佳提取条件进行正交试验最终得到的综合最优提取条件为：
60%是最佳的乙醇的浓度，1.5:
35（g/mL）为最好的原料与溶液的比比例，70℃是最好的浸泡提取温度，1.0h是最佳的浸泡提取时间，在各种因素都是最好的情况下，我的实验的最后的黄酮的得率为2.27%。
参考文献
主要参考资料：
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科学出版社，1997：
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[10]尤晓琳.YOUXiao-lin正交试验研究紫荆果总黄酮提取工艺及对羟自由基清除活性[J]．粮食与油脂，2014（3）.
附录2
无水乙醇（99.7%）；亚硝酸钠；硝酸铝；氢氧化钠；三氯化铁；前面的试剂都属分析纯，芦丁标准品（中国药品生物制品检定所）；蒸馏水。
附件3
HH-S2电热恒温水浴锅由金坛市大地自动化仪器厂制造的；CP214C电子天平由奥豪斯仪器有限制造生产的；722S型紫外分光光度计由上海菁华科技仪器有限公司生产的；实验室里的植物粉碎机。
附件4
和硝酸铝的反应：
用一定规格的吸量管吸取取1.0mL的提取溶液放入到小试管当中，接着往里面加入几滴Al（NO3）3的溶液，用手振荡。
观察小试管里面的溶液的颜色变化。
如果说小试管里面的溶液变成了黄色，那么就说明我们从香茅草这种植物提取的提取液中含有黄酮类化合物。
和三氯化铁的反应：
用一定规格的吸量管吸取1.0mL的提取溶液放入到小试管当中，接着往里面加入几滴5%的三氯化铁溶液，手拿着振荡。
观察小试管里面溶液的颜色变化。
如果说小试管里面的溶液变成了墨绿色，则说明我们从香茅草这种植物提取的提取液中含有黄酮类化合物。
和氨水的反应：
用滴管取几滴提取液滴在于滤纸上等着它自然晾干之后，再将滤纸放在氨水上用氨气熏0.5min左右，观察滤纸的颜色变化。
如果说滤纸滴有提取液的那部分变成淡黄色，那么就说明我们从香茅草这种植物提取的提取液中含有黄酮类化合物。
和氢氧化钠反应：
用一定规格的吸量管取1.0mL的提取溶液放入到小试管当中，接着往小试管里面加入几滴4%氢氧化钠溶液，用手振荡。
观察小试管里面溶液颜色的变化。
如果说小试管中的溶液变成了亮黄色，那么就说明我们从香茅草这种植物提取的提取液中含有黄酮类化合物。
附件5
用一定规格的吸量管确切的吸取芦丁得标准溶液2.00mL，把2.00mL的芦丁标准溶液放入25mL的比色管中，接着就往里面加人0.30mL5%的亚硝酸钠溶液，振荡，摇匀，把它放置6min之后；再往里面加入10%硝酸铝溶液0.30mL,摇匀，把它放置6min；再往里面加入4.00mL4%的氢氧化钠溶液,振荡，摇匀，最后使用70%的乙醇溶液把比色管里的溶液定容至10mL，振荡，摇匀，再把它放置10min[7]；用不添加芦丁标准溶液的作为空白参比，把它们放在波长440～540nm处进行测定得到不同波长处的吸光度，最后进行选择选出最大的吸收波长。
附件6
用一定规格的吸量管确切的移出浓度为0.20mg/mL的芦丁标准溶液于9支25mL的比色管中，它们的体积分别为0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00mL等，往比色管里面加人0.30mL5%的亚硝酸钠溶液，振荡，摇匀，把它放置6min；之后再往里面加入0.30mL10%硝酸铝溶液，振荡，摇匀，再把它放置6min；之后再往里面加入4.00mL4%的氢氧化钠溶液，振荡，摇匀，最后使用70%的乙醇溶液将比色管里的溶液定容至10mL的刻度线处，振荡，摇匀，把它放置10min后，用试剂空白当作是参比液，把它放在最大吸收波长处进行测定等到其吸光度A，接下来以它的吸光度为纵坐标，芦丁标准溶液的浓度当横坐标来绘制标准曲线，就可以得到一条线性回归方程。
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