用正交法测定几种因素对酶活力的影响实验报告记录.docx
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用正交法测定几种因素对酶活力的影响实验报告记录
用正交法测定几种因素对酶活力的影响实验报告记录
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用正交法测定几种因素对酶活力的影响
一、前言
正交实验法
正交实验法就是利用排列整齐的表-正交表来对试验进行整体设计、综合比较、统计分析，实现通过少数的实验次数找到较好的生产条件，以达到最高生产工艺效果。
正交表能够在因素变化范围内均衡抽样，使每次试验都具有较强的代表性，由于正交表具备均衡分散的特点，保证了全面实验的某些要求，这些试验往往能够较好或更好的达到实验的目的。
正交实验设计包括两部分内容:
第一，是怎样安排实验;第二，是怎样分析实验结果。
酶活力
酶活力（enzymeactivity）也称为酶活性，是指酶催化一定化学反应的能力。
酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈大，酶活力愈高，反之活力愈低。
测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。
酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。
在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。
二、实验目的
1.学习并掌握正交法应用原理。
2.采用正交法测定多种因素对酶活力的影响。
三、实验原理
酶促反应常常同时受到多种因素（包括激活剂和抑制剂等）的交互影响，可采用正交法进行综合研究，即通过少量试验收到更好的效果：
多快好省。
本实验以正交法同时测定[S]、[E]、温度和pH值对trypsin活性的影响，以求得酶活最大时相应影响因素的最佳值（水平），并借此初步掌握正交法的使用。
四、实验器材和试剂
实验器材：
①试管
②漏斗
③温度计
④吸管
⑤恒温水浴锅
⑥分光光度计
实验试剂：
①2%血红蛋白液（Hb）
②15%三氯醋酸液（TCA）
③trypsin酶液
④0.04mol/L巴比妥缓冲
液（pH7,8,9）
⑤考马斯亮蓝染液
五、实验操作
1.实验设计
本实验为四因素三水平（总试验次数34=81），可选用L9正交表（仅需9次试验），展开后其特性为均衡搭配
（1）每列中水平数1、2、3出现次数相同，均为3次；
（2）每两列的横行数对（1-1/1-2/…/3-2/3-3）各出现一次。
列号
试验号
1
2
3
4
1
1
1
1
1
2
1
2
2
2
3
1
3
3
3
4
2
1
2
3
5
2
2
3
1
6
2
3
1
2
7
3
1
3
2
8
3
2
1
3
9
3
3
2
1
2.将各因素及其相应水平参数依次填入得到实验安排表
试验号
试剂/ml
1
6
8
2
4
9
3
5
7
2%血红蛋白液
0.2
0.5
0.8
0.2
0.5
0.8
0.2
0.5
0.8
缓冲溶液
pH7
2.6
pH8
1.7
pH9
1.7
pH8
2.3
pH9
2.3
pH7
2.0
pH9
2.0
pH7
2.0
pH8
2.0
37℃预温5min
50℃预温5min
60℃预温5min
酶液
0.2
0.8
0.5
0.5
0.2
0.8
0.8
0.5
0.2
37℃反应10min
50℃反应10min
60℃反应10min
（1）各试管编号，分别加入对应容量的底物（2%Hb）和相应pH值的缓冲液，混匀；
（2）同温处理的3支试管同时预温5min；
（3）各试管依序分别加入对应容量的trypsin酶液（统一加样时间间隔），混匀；
（4）同温处理的3支试管置对应恒温水浴中反应10min；
（5）各试管依次加入15%三氯醋酸液2ml，混匀以终止反应；
（6）非酶促对照：
另取一试管，先加入2%血红蛋白液0.5ml及pH8缓冲液2.0ml，再加15%三氯醋酸液2.0ml，混匀静置10min后再加入酶液0.5ml；
（7）上述各管反应液室温静置15min后过滤，取滤液待测酶活；
（8）酶活测定（考马斯亮蓝法，标准曲线制备略）：
取试管若干支编号，分别加入对应的样品滤液1.0ml及考马斯亮蓝液4.0ml，混匀，室温静置3min，以非酶促对照管为空白，于波长595nm比色测定。
3.数据记录及分析
将各管测定所得光密度值对应填入表格，分别算出各因素一、二及三水平的试验结果总和Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ，并分别取其平均值计算相应的极差（各列中最大与最小值之差）；比较各因素极差的大小以评估各因素对酶活的影响，并对酶活最高时的各因素水平作一直观分析。
六、实验结果及数据处理
1.实验数据：
pH值
温度
pH7
pH8
pH9
测量值
平均值
测量值
平均值
测量值
平均值
37℃
0.003
0.0023
0.068
0.0667
0.185
0.1840
0.002
0.066
0.185
0.002
0.066
0.182
50℃
0.059
0.0560
0.096
0.0967
0.079
0.0810
0.058
0.097
0.082
0.051
0.097
0.082
60℃
0.140
0.1417
0.163
0.1610
0.065
0.0660
0.141
0.159
0.064
0.144
0.161
0.069
2.实验数据处理分析：
列号
试验号
1
[S]/ml
2
[E]/ml
3
温度/（℃）
4
pH
试验结果
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10.2
10.2
10.2
20.5
20.5
20.5
30.8
30.8
30.8
10.2
20.5
30.8
10.2
20.5
30.8
10.2
20.5
30.8
137
250
360
250
360
137
360
137
250
17
28
39
39
17
28
28
39
17
0.0023
0.0560
0.1417
0.0967
0.1610
0.0667
0.0660
0.1840
0.0810
Ⅰ（一水平试验结果总和）
Ⅱ（二水平试验结果总和）
Ⅲ（三水平试验结果总和）
0.2000
0.9247
0.3310
0.1650
0.4010
0.2894
0.2530
0.2337
0.3687
0.2443
0.1887
0.4224
Ⅰ/3
Ⅱ/3
Ⅲ/3
0.0667
0.3082
0.1103
0.0550
0.1337
0.0965
0.0843
0.0779
0.1229
0.0814
0.0629
0.1408
极差
0.2415
0.0787
0.0450
0.0779
由上述表格各因素极差大小可看出，底物浓度对于酶活力影响最大，其次是酶浓度，再次是pH，最后是温度。
根据上表数据，以吸光度值（Ⅰ/3、Ⅱ/3、Ⅲ/3）为纵坐标，因素的水平数为横坐标作图
图一底物浓度对酶活力的影响
从图一可看出，在一定浓度范围内，随着底物浓度的增大，酶活力是逐渐降低的，约在底物浓度为0.5mol/ml时酶活力达到最低。
图二酶浓度对酶活力的影响
从图二可看出，在一定浓度范围内，随着酶浓度升高，酶活力是逐渐降低的，约在酶浓度为0.55mol/ml时酶活力达到最低。
图三温度对酶活力的影响
从图三可看出，在一定浓度范围内，随着温度升高，反应速率是逐渐升高的，即酶活力是逐渐升高的，约在温度为50℃时酶活力达到最高。
图四pH对酶活力的影响
从图四可看出，在一定浓度范围内，随着pH升高，反应速率是逐渐升高的，即酶活力是逐渐升高的，约在pH为8时酶活力达到最高。
七、实验注意事项
1.每加入一种试剂都需要充分混匀。
2.应确保酶促反应的温度及反应时间的准确性。
八、思考题
1.正交法有何优点？
答：
通过少数的实验次数找到较好的生产条件，能够在因素变化范围内均衡抽样，使每次试验都具有较强的代表性，保证了全面实验的某些要求，这些试验往往能够较好或更好的达到实验的目的。
2.各管温育后为何要加入三氯醋酸液？
答：
三氯醋酸液可作为蛋白质沉淀剂，使反应停止，进而保证变量的统一。
3.非酶促空白对照的作用是什么？
其处理为何与其他各管不同？
答：
非酶促空白对照的作用是为了保证实验变量的统一。
因为其理论上讲并不会发生任何反应，因此不需经过加热，剩下其余条件都要和实验组相一致。
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