微生物工程实验指导.docx

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微生物工程实验指导

实验一微生物学实验基本技能训练

一、目的要求

1．学习配制基本培养基。

2．了解并学习高压蒸汽灭菌的基本原理及操作。

3.学习无菌操作技能

二

一、器皿的准备

在配制培养基的过程中，首先要使用一些玻璃器皿，如三角瓶、试管、培养皿、烧杯、吸管等，这些器皿在使用前都要根据不同的情况，经过一定的处理，洗刷干净，进行包装、灭菌后，才能使用。

1.玻璃器皿的清洗

（1）新玻璃器皿 新玻璃器皿含有游离碱，一般先将其浸于2%的盐酸溶液中数小时，然后用自来水清洗干净。

也可将器皿先用热水浸泡，再用去污粉或肥皂粉刷洗，最后经过热水洗刷、自来水清洗，待干燥后，灭菌备用。

（2）用过的玻璃器皿

①试管或三角瓶的洗刷：

盛有废弃物的试管或三角瓶，因其内含大量微生物，洗刷前应先经过高压蒸汽灭菌。

对只带有细菌标本或培养物的试管等玻璃器皿，用过后应立即将其浸于2%的来苏尔消毒水中，经24h后，才可以取出洗刷。

用蜡封口的试管或石油发酵用瓶，清洗前先将其置于高压蒸汽灭菌器中消毒，然后取出，趁热拔去沾有蜡或油的棉花塞，立即倒去培养污物，再将试管投入温水中，稍加洗刷后浸于5%的肥皂水内，煮沸5min，以去除试管上的油污。

也可将倒空的瓶子用汽油浸泡，待油溶解后再刷洗。

加过消泡剂的发酵瓶或做过通气培养的大三角瓶，一般先将倒空的瓶子用碱粉或用10%的火碱水去掉油污后，再行洗刷。

管壁或瓶壁上留有培养物的痕迹，用试管刷难以去除，此时可用一根粗铁丝把顶端弯曲，捆几层纱布，浸湿，沾一点去污粉，或再沾少许细沙，擦磨管壁或瓶壁，就可把器壁的痕迹擦掉。

②培养皿的清洗：

用过的器皿中往往有废弃的培养基，需先经高压蒸汽灭菌或沸水煮沸30min后，倒掉污物，方可清洗。

如果灭菌条件不便，可将皿中培养基刮出来，倒在一起，以便统一处理。

洗刷时，先用热水洗一遍，再用洗衣粉或去污粉擦洗，然后用自来水冲洗干净，将平皿全部向下，一个压着一个，扣于洗涤架上或桌子上。

③吸管的清洗：

吸过菌液的吸管，用完后应放入装有5%石炭酸溶液的高玻璃筒内消毒；未吸过菌液的吸管，用后放入清水中，防止干燥；吸过带油液体的吸管，应先在10%的氢氧化钠溶液中浸泡半小时，去掉油污，方可清洗。

如果吸管经以上处理仍留有污垢，可再置于洗液中浸泡1h，再进行清洗。

吸管上端的隔离棉花，可用普通钢针制成的小钩钩出，清洗时，将直径为6～7.5mm的橡皮管一端连在自来水龙头上，另一端套在吸管的底端，放水冲洗即可。

洗净的试管顶端向下，下面垫一块干净的厚布或几层纱布，使吸管的水分能迅速被吸干。

附：

洗液配制方法

①浓洗液配方：

重铬酸钾40g，浓硫酸800mL，水160mL。

②稀洗液配方：

重铬酸钾50g，浓硫酸100mL，水850mL。

③配制方法：

将重铬酸钾溶于水中，冷却后，边搅拌边将浓硫酸缓缓加入溶液中。

2. 器皿的包扎

（1）试管和三角瓶 灭菌之前，试管口和瓶口均需先塞好棉花塞，棉花不可塞得过紧，亦不得过松，和管壁和瓶壁紧贴的曲面不可出现裂纹。

待棉塞做好之后，在塞棉塞的瓶口外面包一层牛皮纸，用线绳扎好；试管应10个一捆，也用牛皮纸和线绳扎好，置于烘箱中灭菌备用。

（2）培养皿 洗净的平皿通常用报纸包装，每包10～12套，或将平皿每10套放入一个待制的铁皮圆形平皿筒中，加盖，置烘箱中，灭菌备用。

（3）吸管 包扎前吸管的粗头应先塞少许普通棉花，以避免应用时因不慎而将菌液吸入口中，或将口内物吹入培养液中。

塞入的棉花应与吸管口保持5mm左右的距离，若距离太近，容易被唾液浸湿，造成通气不良。

一般这段棉花全长不得短于10mm。

塞好棉花的吸管要进行包装。

将报纸裁为宽为5～8cm的长纸条，先把试管的尖端放在纸条的一端，呈45°角折叠纸条，包住尖端，一手捏住管身，一手将试管压紧在桌面上，向前滚动，以螺旋式包扎，最后将剩余的纸条打结，灭菌备用。

二、培养基的制备

培养基的制备过程可简单描述为：

配料—溶解—校正pH—加凝固剂—融化—过滤—分装—加棉塞、包扎—灭菌—无菌检查。

（1）溶解配料 制备培养基时，先在烧杯中放入所需水量的一半，按培养基配方称取各项材料，依次加入水中，逐个溶解，最后加足水量。

在加料过程中，各种成分溶解的次序应该是先加缓冲化合物，然后是主要元素、微量元素，最后加维生素等。

（2）调pH 配料溶解完后，并冷却到室温时，用精密pH试纸或酸度计测试溶液的pH，然后根据要求的pH确定需加酸或加碱。

当加入酸或碱液时，要缓慢、少量、多加搅拌，防止局部过碱或过酸而破坏营养成分。

常用10%NaOH或6mol/LHCl调整pH。

（3）加凝固剂 配制固体培养基时，需加入凝固剂（如琼脂、明胶等），若以琼脂为凝固剂时，一般先将琼脂加入煮沸的液体培养基中，不断搅拌至融化为止，最后补足所蒸发的水分。

（4）过滤 在二层纱布中间夹入脱脂棉，趁热过滤。

（5）分装 按照试验要求进行分装，装入试管中的固体培养基不宜超过试管高度的1/5，装入三角瓶中的培养基以烧瓶总体积的一半为限。

在分装过程中，应注意勿使培养基沾污管口、瓶口，以免弄湿棉塞造成污染。

培养基分装装置见图1。

（6）包扎 在分装好的试管、三角瓶上加棉塞，若需通气培养时，可用6～8层纱布代替棉塞，然后于其上包一层油纸。

（7）灭菌 根据要求，将包扎好的培养基灭菌。

灭菌完后，斜面试管摆放时，斜面长度不得超过试管长的一半。

（8）无菌检查 将经灭菌的培养基放入培养箱中做无菌检查。

三、实验内容

1.MC培养基的制备

（1）实验目的

①了解半合成培养基的配制原理。

②掌握肉汤培养基的配制方法。

（2）原理 

半合成培养基是在天然培养基中加入适量的化学药品而制成。

肉汤培养基以牛肉膏、蛋白胨两种天然成分提供微生物的碳源、氮源和维生素等，而以NaCl来供给微生物生长所需的矿物质元素之一———钠离子。

此培养基用于细菌的培养。

（3）实验材料

①培养基组成：

大豆蛋白胨5g，牛肉膏粉5g，酵母膏粉5g，葡萄糖20g，乳糖20g，碳酸钙10g，琼脂15g，中性红0.05g，最终pH6.0±0.2

②试剂：

6mol/LHCl，10%NaOH。

③其它：

台秤，量筒，试管，三角瓶，烧杯，分装架等。

（4）方法与步骤

①先取所需水量的一半放于烧杯中，然后称取蛋白胨加入水中，加热溶解。

②取一载玻片放于台秤上，将牛肉膏放于其上，称所需量，然后把牛肉膏和酵母膏粉一同放入烧杯中，加热溶解。

③称葡萄糖等，加入上述溶液中溶解，补足水量。

④待溶液冷至室温时，测pH，用NaOH调pH至6.2（加热杀菌以后，pH下降0.2）。

⑤做固体培养基时，加2%琼脂，加热溶解，补足蒸发水量。

⑥灭菌。

条件为121℃，15～20min。

⑦无菌检查。

将灭完菌的培养基放于37℃的恒温箱中保温培养24～48h，无杂菌长出时，证明合格。

四、灭菌

（1）培养基的高压蒸汽灭菌

①需灭菌的物品（分装在试管、三角烧瓶中的固、液体培养基），棉塞、硅胶泡沫塞等用防潮纸包好（防止锅内水汽把棉塞淋湿），放入灭菌锅内的套筒中。

摆放要疏松，不可太挤，否则阻碍蒸汽流通，影响灭菌效果。

②将灭菌锅盖的排气管插入套筒侧壁的凹槽内，关闭灭菌锅盖旋紧螺栓，切勿漏气。

 ③打开放气阀，加热，热蒸汽上升，以排除锅内冷空气，排气约5～10分钟，关闭放气阀。

④关闭放气阀后，整个灭菌锅成为密闭状态，而蒸汽又不断增多，这时压力和温度都上升，当温度升至121℃，压力达0.1MPa时，保持20～30min，即达到灭菌目的。

⑤灭菌完毕，待压力自然降至“0”时，打开放气阀，注意不能打开过早，否则突然降压致使培养基冲腾，使棉塞、硅胶泡沫塞沾污，甚至冲出容器以外。

⑥打开灭菌锅盖，取出已灭菌的器皿及培养基。

（2）干热灭菌法

常用于空玻璃器皿的灭菌，但凡带有橡胶或塑料的物品、液体及固体培养基等都不能用于干热法灭菌，进行灭菌时，先将要灭菌器皿（培养皿，吸管的包装方法见示范）包好，放入电热烘箱内，调节温度至160～170℃，维持1～2h（当温度升至80℃以上切勿打开烤箱，以免引起玻璃器皿破裂和火灾），灭菌后，当温度降至30～40℃时，打开箱门，取出灭菌器皿。

五、实验内容

（1）按教师指定的小组，每一小组制一种培养基300ml，其中200ml分装于2～3个锥形瓶中，另外100ml分装于试管每管5～7ml，灭菌后制成斜面。

（2）每一小组制备无菌水1瓶（100ml三角烧瓶中加水99ml），制备无菌水试管4支（每支加水9ml）灭菌。

（3）每一小组准备培养皿12套，吸管5支

六思考题

1.实验室常用的灭菌和消毒方法?

2.无菌操作有哪些注意事项?

实验二平菇的栽培

一、实验目的：

1.学习食用菌的基本栽培技术

2.掌握食用菌—平菇的栽培方法

二、实验原理：

平菇为较常见的食用菌，属好气性腐生真菌，在分类上属担子菌纲、伞菌目、侧耳科类。

目前栽培的有高温型、中温型、低温型三类，最普通的为低温型菇类。

菌丝在一定的营养物质（C、N、无机盐、维生素等）、温度、湿度、空气、pH等条件下生长。

待菌丝生长到一定阶段，改变温度、通气良好并给一定的散射光（日光灯照射也可）可刺激形成子实体原基，增大空气中的相对湿度进而形成菌托、菌柄、菌盖的大型子实体，即可供食用。

三、实验内容：

1.实验材料

1.1菌种：

平菇原种

1.2培养基原料：

木屑、棉籽壳、稻草、麦杆、甘蔗渣、粉碎过的玉米芯、花生壳等。

以上原料必须新鲜，无霉变。

（任选一种,本试验用棉籽壳做培养基原料）

1.3石膏粉、过磷酸钙、糖。

1.4培养瓶、接种铲、镊子、酒精灯、防水纸、绳子、5%石炭酸、75%酒精棉花、2%石灰水等。

2.实验方法

实验程序Ⅰ

母种的培养母种可由菇（耳）的孢子萌发而成，也可从子实体组织或菇（耳）中菌丝分离获得。

大体归为：

1.孢子分离法

2.组织分离法

3.菇木分离法

实验程序Ⅱ

原种和栽培种的制作

1.原种的制作，接种培养（略）

2.栽培种的制作和培养由试管母种初步扩大繁殖到固体种（原种），由原种再扩大繁殖应用于生产，叫生产种或栽培种。

其制作过程是：

拌料（含水量60%左右）装瓶2/3压实打洞洗瓶用防水纸包扎瓶口灭菌冷却接种培养。

实验程序Ⅲ（栽培种的制作和培养）

培养基配方：

棉籽壳50kg

石膏粉1kg

玉米粉5kg

水约60kg

pH5.5—6.5

拌料：

培养基的各成分按定量充分拌匀，边拌边加料,加水，再充分混匀。

静止4h后，测含水量（需达60%）（注：

简单的用手抓一把培养料。

稍微用力握紧，指缝间有水滴出现，但不下跌，这就是含水量在60-65%左右。

是比较合适的。

如果有水滴下，那就含水量偏大了。

如果指缝间看不见水滴。

那就是含水量偏低了）。

调pH5.5—6.5左右。

实验程序Ⅳ（栽培种的制作和培养）

装瓶：

将配制好的培养料装入培养袋瓶中（四周紧，中间松），在中心挖一小洞，以利接种。

洗瓶，用防水纸包扎：

用清洁湿布把装好料的袋瓶子的四周及瓶口擦洗干净（以免杂菌污染），用防水纸将瓶口扎好。

灭菌：

装瓶后应立即灭菌，不能隔日。

1.高压灭菌锅灭菌压力1.5kg/cm2，温度128℃，维持1.5—2h。

灭菌时间到后自动降压，放气后，利用余热，再闷蒸1h。

2.接种：

接种方法有点接、层接、混接。

本实验采用点接的方法。

实验程序Ⅴ（栽培种的制作和培养）

培养和管理

1.温度：

25-28℃。

菌丝生长最适温度为25—28℃，子实体形成的最适温度为15-20℃。

2.湿度：

空气相对湿度为70-90%，前期湿度70%，后期湿度为90-95%。

3.光照：

前期菌丝体生长以黑暗为主，子实体形成开始后要有足够的光线和空气，此时应打开袋口（注：

当袋口出现流黄色，长出小子实体一定要将袋子打开）。

4.杂菌处理：

接种10天后，可用75%的酒精局部杀除杂菌；若局部菌丝不萌发，用无菌接种铲打几个洞通气，也可喷洒10%糖和20%的酒精混合液，促进菌丝萌发。

5.出菇期管理：

此时要立即除去覆盖物，充分透光通气，创造昼夜温差，保持空气相对湿度90-95%。

当菌盖不再长大，颜色由深变浅，边缘未反卷尚未弹射孢子（注：

弹出单孢子，平菇偏轻）时就应及时采摘。

3思考题

1.平菇子实体发育有几个时期有何特点？

2.平菇的主要栽培方式有哪几种各有什么优缺点？

3.如何选择平菇菌种？

4.试述生料栽培平菇的关键技术？

5.试述发酵料栽培平菇的关键技术？

四、实验实例效果图

拌料

装袋

菌丝体

子实体

五、实验进度安排

时间

进度

需准备内容

第6周周三

准备实验器材

棉籽壳50kg；石膏粉1kg；过磷酸钙250g；糖500g；聚丙烯酰胺袋子50只（包括袋环，袋圈，报纸）；铁锹两把，水桶一只

第6周周四

正式实验

拌料，装袋，一人一组

第6周周五-六

灭菌

每锅灭菌8袋

第6周周一

接种

每人接种自己的一袋

第6-10周

菌丝体生长

进行菌丝体管理和杂菌处理

第11-13周

出菇期管理

浇水和杂菌处理

第12-14周

采摘平菇

采摘平菇并品尝自己的劳动果实

六、实验报告：

1、姓名、班级、学号、小组编号、试验开始日期/时间

2、实验报告包括实验目的、实验原理、实验步骤、注意事项、试验结果、误差分析、思考题等。

实验三乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物检验

一、实验目的

1.了解酸乳中乳酸菌分离原理

2. 学习并掌握乳酸菌饮料中乳酸菌菌数的检测方法。

二、实验 原理

活性酸奶需要控制各种乳酸菌的比例，有些国家将乳酸菌的活菌数含量作为区分产品品种和质量的依据。

由于乳酸菌对营养有复杂的要求，生长需要碳水化合物、氨基酸、肽类、脂肪酸、酯类、核酸衍生物、维生素和矿物质等，一般的肉汤培养基难以满足其要求。

测定乳酸菌时必须尽量将试样中所有活的乳酸菌检测出来。

要提高检出率，关键是选用特定良好的培养基。

采用稀释平板菌落计数法，检测酸奶中的各种乳酸菌可获得满意的结果。

三、实验材料

1.培养基

改良MC培养基（ModifiedChalmers培养基）

2.仪器和器具

无菌移液管（25ml,1ml），无菌水（225ml带玻璃珠三角瓶，9ml试管），无菌培养皿，旋涡均匀器。

恒温培养箱。

四、实验方法

流程：

酸奶→稀释→制平板→培养→检查计数

1.样品稀释

先将酸奶样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品25ml加入盛有225ml无菌水的三角瓶中，在旋涡均匀器上充分振摇，务必使样品均匀分散，即为10-1的样品稀释液，然后根据对样品含菌量的估计，将样品稀释至适当的稀释度。

2.制平板

选用2~3个适合的稀释度，培养皿贴上相应的标签，分别吸取不同稀释度的稀释液1ml置于平皿内，每个稀释度作2个重复。

然后用溶化冷却至46℃左右的 改良MC培养基倒平皿，迅速转动平皿使之混合均匀，冷却成平板。

3.培养和计数

将平皿倒置于40℃恒温箱内培养24~48h，观察长出的细小菌落，计菌落数目，按常规方法选择30~300个菌落平皿进行计算。

五、结果

1.指示剂显色反应

乳酸菌的菌落很小，1~3mm，园形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色。

由于产酸菌落周围能使CaCO3产生溶解圈，酸碱指示剂呈酸性显色反应。

2.镜检形态

必要时，可挑取不同形态菌落制片镜检确定是乳杆菌或乳链球菌。

保加利亚乳杆菌呈杆状，成单杆、或双杆菌或长丝状。

嗜热链球菌，呈球状，成对、或短链、或长链状。

3.计数结果

公式：

平均菌落数×稀释倍数

八、思考

1.为什么乳酸菌的检测关键是选用特定良好的培养基？

2.培养基中为什么要加CaCO3？

实验四酸奶的制作

实验目的：

1.通过酸奶的制作，了解乳酸发酵的基本原理。

2.掌握酸奶的制作技术

实验原理：

酸奶是鲜奶经过乳酸菌发酵而制成的乳制品，具备鲜奶的全部营养成分。

酸奶含有人体必需的蛋白质、脂肪、维生素、矿物质、乳糖酶和活性乳酸菌等。

:

酸奶是采用优质纯鲜牛奶加入白糖均质,经超高温灭菌后接入乳酸菌发酵后制成的一种发酵型乳制品。

在发酵过程中,鲜牛奶中的酪蛋白遇酸凝固,成为有弹性的凝块,颜色乳白、气味清香、酸甜可口,别具一番风味。

乳酸菌具有把奶类中的乳糖，分解成乳酸的功能，称为乳酸发酵。

在形成乳酸的同时也产生其他一些酸类物质，从而导致了PH值的下降，当达到乳类蛋白质的等电点时（如牛奶蛋白质的等电点约在PH4.5左右），引起蛋白质的沉淀，使原来流动性较大的乳类，因凝固作用而变成类似果冻的胶状物，称之为“凝乳”。

实验内容：

1.材料

1.1菌种：

嗜热乳酸链球菌（Streptococcusthermophilus）、保加利亚乳酸杆菌（Lactobacillusbulgaricus），乳酸菌种也可以从市场销售的各种新鲜酸乳或酸乳饮料中分离；

1.2培养基：

BCG牛乳培养基、乳酸菌培养基、脱脂乳试管（见注）、脱脂乳粉或全脂乳粉、鲜牛奶、蔗糖、碳酸钙；

1.3恒温水溶锅、酸度计、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、培养箱、酸乳瓶（200～280mL,）、培养皿、试管、300mL三角瓶。

2.乳酸菌饮料的制作

2.1．将脱脂乳和水以1:

7～10（WW）的比例，同时加入5%--6%蔗糖，充分混合，于80～85℃灭菌10～5min，然后冷却至35～40℃，作为制作饮料的培养基质。

2.2．将纯种嗜热乳酸链球菌、保加利亚乳酸杆菌及两种菌的等量混合菌液作为发酵剂，均以2%～5%的接种量分别接入以上培养基质中即为饮料发酵液，亦可以市售鲜酸乳为发酵剂。

接种后摇匀，分装到已灭菌的酸乳瓶中，每一种菌的饮料发酵液重复分装3～5瓶，随后将瓶盖拧紧密封。

2.3．把接种后的酸乳瓶置于40--42℃恒温箱中培养3～4h。

培养时注意观察，在出现凝乳后停止培养。

然后转入4～5℃的低温下冷藏24h以上。

经此后熟阶段，达到酸乳酸度适中（pH4～4.5），凝块均匀致密，无乳清析出，无气泡，获得较好的口感和特有风味。

2.4．以品尝为标准评定酸乳质量采用乳酸球菌和乳酸杆菌等量混合发酵的酸乳与单菌株发酵的酸乳相比较，前者的香味和口感更佳。

品尝时若出现异味，表明酸乳污染了杂菌。

比较项目按表22-1。

3.注意事项

3.1.采用BCG牛乳培养基琼脂平板筛选乳酸菌时，注意挑取典型特征的黄色菌落，结合镜检观察，有利高效分离筛选乳酸菌。

3.2．制作乳酸菌饮料，应选用优良的乳酸菌，采用乳酸球菌与乳酸杆菌等量混合发酵，使其具有独特风味和良好口感。

3.3．牛乳的消毒应掌握适宜温度和时间，防止长时间采用过高温度消毒而破坏酸乳风味。

3.4．作为卫生合格标准还应按卫生部规定进行检测，如大肠菌群检测等。

经品尝和检验，合格的酸乳应在4℃条件下冷藏，可保存6～7d。

实验报告：

4.1．乳酸发酵过程、检测结果及结果分析。

表1乳酸菌单菌及混合菌发酵的酸乳品评结果

品评项目

凝乳情况

口感

香味

异味

pH值

球菌杆菌混合（1：

1）

4.2．将发酵的酸乳品评结果记录于表1中；

5.问题和思考

1、发酵酸乳为什么能引起凝乳？

2．为什么采用乳酸菌混合发酵的酸乳比单菌发酵的酸乳口感和风味更佳？

一、实验实例效果图

乳酸菌菌落

乳酸菌镜检形态

酸奶

二、实验进度安排

时间

进度

需准备内容

第7周周三上午

配置培养基，准备实验器材

配置1000ml的MC培养基：

大豆蛋白胨5g，牛肉膏粉5g，酵母膏粉5g，葡萄糖20g，乳糖20g，碳酸钙10g，琼脂15g，将前面7种成分加人蒸馏水中，加热溶解，校正pH6.0，加人中性红溶液0.05g（1％中性红溶液5.0ml）。

分装到8个锥形瓶中，灭菌。

第7周周三下午

MC培养基灭菌，准备实验器材

培养皿50只，每组8只，包扎灭菌

第7周周四

正式实验

乳酸菌的分离，一人一组

第7周周五

结果观察和转接

饮料的培养基质（牛奶液体培养基）

观察分离得到的乳酸菌单菌落，并转接入牛奶液体培养基中，42℃

第7周周六

结果观察和酸奶的品尝

三、实验报告：

1、姓名、班级、学号、小组编号、试验开始日期/时间