生物工程中游技术实验.docx
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生物工程中游技术实验
实验十50L发酵罐的使用—发酵过程与控制
生物反应器是生物工程的重要组成部分，是生物技术转化为产品的关键设备，在生物工程中处于中心地位。
机械搅拌式生物反应器，又称发酵罐，是进行液体发酵的特殊设备。
实验室使用的小型发酵罐，其容积可从1L至数百升。
发酵罐配备有控制器和各种电极，可以自动地调控试验所需的培养条件，是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需的设备。
一、实验目的
认识全自动生物反应器的安装和准备，反应后的拆卸和清洗等；分别了解pH电极和溶氧电极（DO）的结构和基本原理；掌握pH电极和溶氧电极的校正方法；认识发酵罐培养基的灭菌，认识反应器在位高压灭菌的方法和规程，学会对反应器培养液灭菌过程中的升温、保压、降温和培养温度的设定等的操作；掌握接种的方法及操作，确保发酵液无杂菌污染；pH调节剂、消泡剂以及补料的连接方法；学会从反应器中定时取出样液的方法；学会如何进行参数控制；并掌握正确使用先进反应器发酵生产的方法，从而可对中试及中试以上的发酵生产研究有一个初步的概念和感性认识。
二、实验原理
（一）安装和拆卸：
反应器为碟形，上盖可以自动起降，它与罐体是通过橡皮垫圈和螺栓密封的。
盖上设有搅拌电机、搅拌轴、机械密封及其多个接口（接种口、空气进口、尾气出口、各种检测仪表的插孔、消泡剂和酸碱液注入口、补料口、备用口、压力表等）；罐体设有夹套层，用以加热或冷却，罐内有搅拌桨叶、档板、空气分布器；中部侧面装有温度传感器及溶氧电极和pH电极插口以及取样口。
与罐体连接的部分布有无菌空气系统，并配备一台自动调控装置。
整个装置处于工作状态时，必须保持无菌状态，而操作结束后，必须移走培养液，并进行清洗罐体等。
因此必须进行安装和拆卸步骤。
（二）pH电极的校正
待校正的pH电极是由氯化银参比电极和玻璃电极组合在一起的复合玻璃电极。
复合电极的内层玻璃管与玻璃球泡相通，内充以恒定pH植的标准缓冲溶液，从中引出氯化银电极导线，组成玻璃电极（即指示电极）。
在外层玻璃管引入银丝，其表面覆盖一层AgCl薄膜。
从上部扩大部分边上的注液口加入饱和氯化钾溶液，就形成氯化银电极，在外玻璃管的下部，开有一小口，装有多孔陶瓷芯，使KCl溶液可稍许向外溶液渗漏，即所谓液络部。
复合电极的基本性能参数有电极转换系数（也称Nernst斜率），电极零电位，电极内阻，参比电阻，电极响应时间，耐高温冲击的次数等等，它们都有一定的要求和测试方法，对新使用的电极或已经发酵运行一段时间的电极，其性能参数要发生变化，对某些性能参数要进行测定，决定是否可投入使用。
复合玻璃电极的构造
（三）溶氧电极的校正
电解型电极是由一个阴极（贵重金属如铂或金）、一个阳极（Ag/AgCl）和一种电解质，如中性NaCl溶液组成的。
在某一溶氧浓度一定的溶液系统中，通过电极之间约0.6~0.8的电压，使溶解氧在阴极上被还原，从电极的电流~电压极谱图（图3）可以看出，OA为极谱残余电流；A点为氧的分解电压，当外加电压大于分解电压A，这时电极输出电流Ⅰ随着电压增大而增加，当达B点后，电极电流就不再随着外加电压而增加，即电极电压进入恒
扩散电流与氧浓度的关系
定区，这时称为饱和电流或扩散电流。
当外加电压继续增至C点时，电极输出电流迅速增加，这是由于水被还原成氧所造成的。
从图中也可看出饱和电流与溶氧浓度成正比关系。
因此，只要把外加电压固定在电流电压图中的平坦部分，电极输出电流就可以校正测量溶解氧，这个固定电压常选在0.6～0.8V之间。
反应式为：
阴极：
O2+2H2O+2e-→H2O2+2OH-
H2O2+2e-→2OH-
阳极：
Ag+Cl-→AgCl+e-
总反应：
4Ag+O2+2H2O+4Cl-→4AgCl+4OH-
用NaCl或KCl作为电解质，电解质在使用过程中被消耗，必须在一段时间后补充。
溶氧探头的结构
（四）反应器培养液的灭菌与接种培养
生物反应器的灭菌是采用夹套层蒸汽预热后直接或间接通入饱和蒸汽灭菌的方式进行的，可将反应器内培养液的温度升至121℃，以达到灭菌的效果，灭菌后的培养基冷却至培养温度后，即可接种培养。
接种时，严格按照无菌操作进行，避免杂菌污染。
（五）补料、取样
生物反应器的补料（酸碱、消泡剂及其它营养液）可通过蠕动泵进行补加，可自动也可手动；取样是了解发酵过程的重要手段，取样时，严格按照无菌操作进行，避免杂菌污染。
三、实验步骤：
（一）首先拧下螺栓，启动自动升降机打开上盖，检查培养罐内部是否清洗干净。
插入校正完毕的pH电极和氧电极于罐侧面相关位置，并与控制柜连接。
加入配置好的培养液，加盖并对称地拧紧螺母，直至上盖被密封固定。
安装安全阀、泡沫传感器、观察灯、压力计、取样管，以及空气过滤器等，剩余的孔洞须用硅胶塞和瞎塞拧紧备用。
使用完毕后拆卸时与以上步骤相反，并彻底清洗罐体及零件。
（二）PH校正:
此步骤必须于发酵罐灭菌前先行校正。
再将电极插入罐内。
（1）先将电极置入零点标准液里（7.00）,看PH值稳定后按7.00键（ZERO下方）。
此时PH之PV会显示7.00。
（2）之后再将电极用纯水洗涤后，置入标准液里（4.00）,看PH值稳定后按4.00键（SPAN下方）。
此时PH之PV会显示4.00。
（3）之后再将感电极置入标准液里（7.00），看PH之量测值是否显示正确。
如尚有误差,请重复
（1）
（2）步骤。
注意:
用于发酵过程中经取样量测如发现与显示值有偏差请调整使显示值正确。
此数值乃将取样量测值减显示值之误差量输入。
（三）DO校正:
此步骤必须于发酵罐灭菌后罐内温度稳定后校正。
（1）先将电极讯号线接头拆开,看DO之量测值稳定后按0键（ZERO下方）。
DO之PV会显示0.0。
（2）之后再将电极讯号线接头接上，槽内通气至饱和后看DO之量测值稳定后100键（SPAN下方）。
此时DO之PV会显示99.9。
（3）之后再将电极讯号线接头拆开，看DO量测值是否显示正确.如尚有误差。
请重复
（1）
（2）步骤。
注意:
用于发酵过程中经取样量测如发现与显示值有偏差请调整使显示值正确。
此数值乃将取样量测值减显示值之误差量输入。
（四）反应器的灭菌与发酵
1．灭菌：
此系统在灭菌状态前需将灭菌条件之前置作业准备妥当：
（A）罐体洗干净后将顶板降下并锁紧。
（切记此步骤完成后始可将控制启动）
（B）再次确定是否顶板盖已完全紧密、各接口是否已装上并锁紧。
（C）PH是先行校正完成并插入槽内、DO电极插入槽内（DO灭完菌后温度至发酵温度后再校正）。
且空气过滤器是否已安装或确定可用。
（D）将培养基装入罐内。
并确定容量足够高于各感测电极。
（E）加料液及管件是否已事先灭菌准备完成。
（F）顶板不用的接口是否已栓紧。
（G）电极孔及取样口是否已定位锁紧。
（H）各供应源是否已准备好（空气、冷却水、蒸气）。
完成上述所有步骤后即可开始灭菌。
并确定所设定之灭菌条件正确后。
将搅拌、温度、流量控制开关启动后开启灭菌开关开始灭菌。
灭菌完成后系统会自动冷却。
待冷却程序完成后系统会警报警示。
之后将系统切至发酵即可开始发酵。
2．发酵：
通人反应器的空气是从空压机经空气过滤器而成无菌空气，再由空气分布管送入灭过菌的培养罐内。
在控制台上，设定所需的搅拌转速、发酵温度、pH值，并将空气流量计的流量调至确定值，DO校正。
3．接种与培养：
将事先培养好的培养液（在三角瓶中进行摇床培养，处于对数生长期的细胞，以无菌操作方式倒入已灭过菌的带有插在保险管套筒内的注射针及软管的三角瓶内；或直接倒入三角瓶种子）由接种口接入罐内，接种时，要在接种口的隔膜周围放上浸有酒精的棉花或用1~3ml乙醇覆盖，点燃，以产生上升的气流来防止杂菌污染。
接种塞从无菌筒内取出，然后将接种针穿过火焰和隔膜，慢慢插入中心部位，拧紧连接螺帽，直至插入部分固定。
接种量大体上是培养液的百分之几。
（五）补料、取样
如调节pH值和泡沫时，可将酸液和碱液及消泡剂装入三角瓶，灭菌后，分别经蠕动泵与反应器连接，补料与之相同。
这样，通过控制台的自动控制，就可以自动地连接流加。
为了了解培养过程中反应物的变化情况，必须定时地进行取样，取样前，要对取样口进行灭菌再取样；取样时关闭排气口，使罐内处于正压状态，打开取样口，培养液即可自动流出；但是，在下次取样时，必须注意将残液放净后再取样。
四、思考题
1、为什么pH电极在生物反应之前要进行校正？
因为要对PH电极的零电位和斜率标定后测量才准确。
校正其电极，保持其反应灵敏度，之后的测量更加准确。
pH电极使用一段时间后，不对称电位将会发生很大改变，故必须定期校准。
在下列情况下，必须重新校准：
a、长期使用的电极基新换的电极。
b、测量浓酸（pH＜2）以后，或测量浓碱（pH＞12）以后。
c、测量含有氟化物的溶液或较浓的有机溶液后。
d、被测溶液温度与标准溶液温度（或室温）相差过大时。
2、在pH电极的校正操作过程中应注意哪些事项？
对pH电极进行准备工作时，测量前后都要用蒸馏水对电极进行漂洗。
用不含麻的拭布将电极头上多余的水吸去，不要擦，否则会产生静电，干扰pH的精确测量。
储存pH电极时，要保持湿润。
用购买的存储液或按pH4缓冲液和4MKCl以1:
1配制的溶液储存电极。
不能将电极放在蒸馏水或去离子水内存储这会导致离子通过球泡被滤走而导致电极失效。
储存后会发现白色氯化钾晶体积聚在电极上，这一盐态的物质不会影响测量，只需用蒸馏水漂洗电极去除晶体后吸干再用即可。
电极pH校正：
在正常情况下，每天使用前校正电极1次。
在电极的使用频率高时，可对电极进行pH校正2-3次。
校正的所用的pH缓冲液必须新鲜配制，所用的pH校正缓冲液应避免校正时的污染，重复应用的次数不应超过5次。
样品和pH校正缓冲液的温差不应大于5℃，建议样品和pH校正缓冲液置于同一室温下。
在每次使用后，均应用蒸馏水彻底冲洗干净。
如果每天均使用，可将电极浸泡于3MKCl溶液中。
如果长期不用，应将电极填充孔封闭，并在电极保护套中填塞一小块浸润过3MKCl溶液的海绵，然后将电极轻轻装入电极套中，以防止电极头干燥。
3、为什么在生物反应之前要对DO电极进行校正？
是否每次反应都必须校正？
为什么？
因为漂移和膜堵塞是DO电极在使用中面临的主要问题。
经过消毒后，电极输出很难做重现。
因此，电极在生物反应之前要校正。
不是每次反应都必须校正DO电极，经过一次校准后可连续使用二周甚至更长时间。
通常2～3月应重新校验一次溶氧仪电极的零点和量程。
只要测量显示DO值是准确的就完全没必要频繁对电极进行标定。
实验十一应用溶氧电极测定KLa
一．实验目的
学习运用溶氧电极法测量计数获得kLa值。
二．基本原理
单位体积发酵的氧传递系数kLa可称为“通气效率”，可以用来表征发酵罐的通气情况。
由于各发酵罐设备情况不同以及整个发酵过程中培养液物性的变化，kLa不是常数，通过kLa的测定，就可以了解发酵过程中氧的传递效果的好坏，对提高氧的利用率和增产节能都有着重要意义。
三．实验方法
（1）根据电极显示值求C值：
如果温度为T时，水被空气所饱和，可得到氧分压式：
Po2=（P–PH2O）Yo2空气
P――总压PH2O――水蒸气压=f（T）
Yo2空气――空气中氧的分子分数=0.21
当总压为1bar，温度为30℃时
Po2=（1–2.34×10-2）×0.21=0.205（bar）
相应的浓度可根据Henry定律计算：
H=Po2/Xo2*
Xo2*――液相中氧的分子分数=
≈水的克分子浓度=
=55.55
温度T=30OC时水中的亨利常数：
H（T=30OC）=4.81×104bar
C*α=0.205×55.55/4.81×104
空气氧饱和浓度值C*α=2.37×10-4Mol/L
将电极显示值E（%饱和）换算成氧浓度为：
C=E/100×C*α=E/100×2.37×10-4Mol/L
（2）KLa的获得：
可以运用动态测定法获得KLa值，此法就是在非稳定时用下列衡算式：
=kLa（C*－C）－Qo2X………………………
（1）
首先观察暂停通气后C值随是的下降速度率求得Qo2X（r值，即为摄氧率）值，其次再观察重新通气时的C值（图5）。
A停止通气
B开始通气
图7动态电极法测定kLa的曲线
（a）停止通气——再通气实施的溶解氧浓度变化
（b）利用动态过程的数据求
将
（1）式加以整理：
C=—
（
+Qo2X）+C*……………
（2）
将重新通气后的过渡阶段C值对应于（
+Qo2X）值作图，应当得到一直线，这条直线的斜率就表示（－
）值。
四．实验器材
溶氧电极、发酵罐、培养液、控制台等。
五．实验步骤
kLa的测定
1.将培养基加入至发酵罐，插入调整好的氧电极，设定好相应的温度、通风量及搅拌转速。
2.连接氧电极输出端。
3.接入适量的种子液，开始培养。
4.培养一定时间，此时DO值为一定，停止通气，每隔1分钟记录饱和溶氧值E。
5.当DO值下降至一较低点时，通气，DO值迅速回升，渐渐恢复至原值，每隔1分钟记录饱和溶氧值E。
六．实验结果
时间t（s）
E
Cmol/L
dC/dt+r
0
74.8
0.000181016
20
72.3
0.000174966
40
60.3
0.000145926
60
50.1
0.000121242
80
36.2
0.000087604
100
26.6
0.000064372
120
18.7
0.000045254
140
11.5
0.00002783
160
6.1
0.000014762
180
1.9
0.000004598
200
0
0
220
0.7
0.000001694
-9.153E-07
240
19.9
0.000048158
1.3232E-06
260
35
0.0000847
8.271E-07
280
50.7
0.000122694
8.997E-07
300
59.7
0.000144474
8.9E-08
320
64.5
0.00015609
-4.192E-07
340
68.1
0.000164802
-5.644E-07
360
69.9
0.000169158
-7.822E-07
380
71.1
0.000172062
-8.548E-07
400
71.7
0.000173514
-9.274E-07
由上图可得在通气前的斜率k=-0.000001，即r=-0.000001
由上图可得在通气前的斜率k=-48.154，从而可算得KLa=-1/-48.154=0.0208
七．思考题
1、为什么要测定kLa？
本实验是用何种方法测定kLa值的？
因为单位体积发酵的氧传递系数kLa可称为"通气效率",可以用来表征发酵罐的通气情况。
由于各发酵罐设备情况不同以及整个发酵过程中培养液物性的变化,kLa不是常数,通过kLa的测定,就可以了解发酵过程中氧的传递效果的好坏,对提高氧的利用率和增产节能都有着重要意义。
本实验是用溶氧电极法测量计数获得kLa值
2、测定kLa值有没有其他方法？
采用不同的方法测得的kLa值能否进行比较，为什么？
（1）、亚硫酸盐法（冷膜）
原理：
亚硫酸根在铜或镁离子作为触媒时，被迅速氧化而消耗溶液中的氧，使溶液中的氧浓度为零；再用碘量法测定未经氧化的亚硫酸钠，从而根据亚硫酸钠的消耗量求得氧的溶解量。
优点：
氧溶解速度与亚硫酸盐浓度无关；反应速度快；不需特殊仪器；
缺点：
准确性不如极谱法；不能在真实发酵条件下进行测定；只适合于表示4~80L发酵设备的通气效率的优劣。
（2）、取样极谱法
原理：
当电解电压为0.6~1.0V时，极谱仪扩散电流的大小与液体中溶解氧的浓度成正比。
优点：
可直接测定发酵条件下的溶解氧；
缺点：
不能完全真实反映发酵罐中的实际情况。
（3）、复膜电极法——动态法
原理：
--氧透过性薄膜将电极系统与被测定溶液分隔开；
--测定的是氧从液相主体到阴极的扩散速率，即氧从被测介质主体经过电极膜外侧的滞留液膜、电极膜和电解质到达阴极表面；
--氧从液相主体到阴极的推动力为氧分压差。
特点：
--此法避免了外界溶液性质及通风搅拌所引起的湍动对测定产生的影响。
--应用此法时应维持氧的总传递系数K值不变，即影响液膜厚度的搅拌速度和影响液膜传递系数的温度都不变。
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