生物工程综合实验Word文档下载推荐.docx
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0.5MHCl溶解的5%（w/v）对羟基苯甲酸酰肼（p-hydroxybenzoicacid）200ml，配好后储藏于4℃冰箱
B:
0.5MNaOH1L
使用时，将A与B按1：
4的体积比混合即为PAHBAH显色剂
④Bradford储存液：
100ml95%乙醇，200ml85%磷酸，350mg考马斯亮蓝G-250
可在室温下长期保持稳定
⑤Bradford工作液：
425ml双蒸水，15ml95%乙醇，30ml85%磷酸，30mlBradford储存液
滤纸过滤后保存于室温棕色瓶中
⑥标准蛋白质溶液:
以牛血清白蛋白（BSA）作为标准蛋白，配制成1mg/ml标准溶液，用时可稀释。
4、器材
分光光度计、、电子天平、水浴锅、煮沸电炉、移液管、泡沫浮子若干、pH计、磁力搅拌器冰水
5、实验步骤：
A.木糖标准曲线的制作
木聚糖酶活性的测定是以0.5%燕麦木聚糖为底物，利用对羟基苯甲酸酰肼（PAHBAH）与水解反应产生的还原糖的显色反应进行比色，具体方法是：
反应体系为600µ
l，添加15µ
l酶液到由300µ
l0.5%（w/v）燕麦木聚糖和285µ
l100mMpH5.8的邻苯二甲酸氢钾缓冲液组成的已经在90℃下预热的混合液中，90℃下保温10min后，最后加入1.8mL终止剂/显色剂PAHBAH终止反应。
其混合物在沸水浴中加热10min后，在冰水浴中冷却，用分光光度计在410nm下测其吸收值。
木聚糖酶活性单位定义为每分钟催化产生1µ
mol木糖所需的酶量。
在制作木糖标准曲线时，整个体系组成也应该与实际测定酶活性的条件一致。
具体地说，在配制标准曲线时，整个体系应为：
0.6mL溶液（0.3mL100mMpH5.8的邻苯二甲酸氢钾缓冲液+xmL木糖溶液+（0.3-x）mL无菌水）+1.8mL终止剂/显色剂PAHBAH。
①将适量100mMpH5.8的邻苯二甲酸氢钾缓冲液与标准木糖溶液（0.01%）、无菌水三者混合均匀，保证整个体系的总体积为600µ
l，通过控制加入木糖溶液的体积量来调整混合液中木糖的量。
每次得到的600µ
l混合液与1.8mL的PAHBAH试剂混匀后，在沸水浴中加热10min后，在冰水浴中冷却，用分光光度计在410nm下测定吸光度。
以600µ
l混合液里不含标准木糖溶液的为空白对照。
0.01%木糖（µ
l）
30
50
80
100
120
150
180
200
H2O（µ
270
250
220
缓冲液（µ
300
PAHBAH（mL）
1.8
A410
A410平均值
②以A410为纵坐标，木糖的量（mol）为横坐标（尽量选取吸光度在0.1～0.8之间的点），在Excel上绘制标准曲线，经线性回归后得到A410-木糖（mol）的标准曲线，既：
即A410nm=ax+b,x为木糖（mol），一般相关系数R2值应在0.99以上，至少小数点后两个9。
B．Bradford法测定蛋白质浓度标准曲线的制作
①按下表将标准蛋白质溶液小牛血清白蛋白转移到试管中，补加水至终体积300µ
l，加入3mlBradford工作液并振荡混匀，在2min后测定A595值，测量应在1h内完成。
样品号
标准溶液（0.2mg/mlBSA）/l
H2Ol）
Bradford试剂（ml）
A595
空白对照
3
1
2
4
5
6
②以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在Excel上绘制标准曲线，经线性回归后得到A595-蛋白质含量（g）的标准曲线，既：
即A595nm=ax+b,x为蛋白质量（g），一般相关系数R2值应在0.99以上，至少小数点后两个9。
六、注意事项：
①做木糖标准曲线时，要保证所有样品液同批次煮沸显色，以尽量避免不同批次的误差。
②称取各种标准品要准确。
③Bradford法测定后玻璃比色皿容易染上颜色，用后可先用甲醇清洗，然后用水或丙酮清洗，或在浓HCl中浸泡过夜（或者用硫酸清洗）。
实验二、重组菌发酵产酶过程监测
了解重组菌发酵产酶原理和过程，掌握重组菌生长过程监测和无菌取样技术。
通过基因重组技术可以使外源基因在大肠杆菌（Escherichiacoli）中得到大量表达主要是因为：
E.coli携带的表达载体上通常都有一个强的启动子，这样启动子控制下的外源基因能够得到很高的表达量；
同时，表达载体通常在细胞中是多个拷贝，这样使得外源基因在细胞的基因剂量也大大增加，从而也能够是目的基因的表达量增加。
通常一个外源基因在E.coli中表达时，细胞内的大部分物质被用来产生外源基因的产物，这样细胞本身用于自身生长繁殖的营养很大部分被占夺，最终导致E.coli细胞的生长明显受到抑制，表现为最终生长密度不高，目的蛋白产量不高，为了克服这一缺陷，一般的做法是使表达载体上控制外源基因转录的启动子是可以控制的，也就是说在细菌生长的初始阶段，让其积累较多的菌体，此时表达载体上的启动子不表现出转录活性或者活性非常低，当细胞长到一定浓度后，改变一定的外界环境后（如添加某种物质或培养条件改变），启动子的活性抑制被解除，此时外源基因便大量转录表达，最后目的基因编码的产物能够得到很高的产量。
重组大肠杆菌（E.coli）生产木聚糖酶的途径为：
重组E.coli携带有重组质粒pHsh-xynB,xynB基因是来源于极端嗜热厌氧菌海栖热袍菌（thermotogamaritima）的编码木聚糖酶的一个基因，pHsh是一种新型的大肠杆菌表达载体，其上有来源于根据E.coli热休克基因启动子保守序列设计而成的独特新型热激启动子Hshpromoter，当重组菌在30℃生长时，热激启动子Hshpromoter对它下游的目的基因xynB的转录活性非常低，这样重组菌能够快速地生长到一个较高的细胞密度，当细胞生长到对数期（OD600=0.6～1.0）早期时，通过快速提高生长温度到42℃（即热激方式）使得热激启动子Hshpromoter的活性抑制得到解除。
此时编码木聚糖酶的基因xynB就开始大量表达。
同时，该表达载体的复制子使得xynB基因在E.coli中有很高的拷贝数，拷贝数可以达到500～600个∕细胞，这样使得目的基因能在E.coli中达到很高的表达量。
重组菌中木聚糖酶的活性随发酵时间不断发生变化，可以通过定时取样监测它的产酶过程。
定时取样测定重组菌的细胞密度OD600，重组菌的酶活随着细胞密度的增加不断增加，当细胞密度达到比较稳定的值时，由于木聚糖酶对应的mRNA的稳定性很高，所以在以后持续的几个小时，酶活仍然持续的增加，当酶活性开始下降时终止发酵。
3、实验材料和设备
A.菌种
大肠杆菌E.coliJM109（pHsh-xynB）携带有重组质粒pHsh-xynB
B.培养基
重组大肠杆菌的培养基采用LB培养基：
液体培养基：
胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L。
固体培养基：
胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl10g/L，琼脂15g/L。
灭菌前调pH到7.0～7.5左右，两种培养基最后都要加氨苄青霉素至终浓度100g/mL。
C.实验设备
分光光度计，台式离心机，离心机，离心管若干（50-100mL/支），超净工作台，可以控温的摇床，无菌移液管，三角瓶（需要1L、100mL、500mL各若干），1.5mL小塑料管，无菌水
4、实验步骤
①种子培养
实验前一天用重组质粒pHsh-xynB新鲜转化大肠杆菌E.coliJM109获得重组菌，晚上待菌落肉眼可见后，挑取单菌落接种于30ml加有氨苄青霉素的LB培养基，在30℃下200rpm振荡培养过夜。
②发酵流程
次日以1%～2%接种量接入到新鲜的含氨苄青霉素的LB培养基中，于30℃下培养至细胞到达对数期早期（OD600值大概为0.7~0.8）时，将装有重组菌的三角瓶移入42℃摇床中，以此时为0时刻计时，分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h使用无菌操作取样测OD600值，并各保留1ml样品离心收集细胞，用无菌水洗细胞一次，用1ml的无菌水重新悬浮后保存于-20℃用于次日酶活性测定。
10h发酵结束后，将剩下的发酵液全部离心收集细胞，用无菌水洗涤一次，再次离心细胞后放置于-70℃用于重组酶的纯化。
实验三、重组菌细胞破碎及酶活检测
掌握超声波细胞破碎方法及木聚糖酶活性测定方法
超声波是指频率超过人耳可听范围（16~21kHz）的波，即频率为20kHz以上的波。
微生物细胞在超声波的作用下，细胞结构受到破坏，而使细胞破碎。
超声波进行细胞破碎的效果与微生物的种类、浓度、超声波频率、输出功率和破碎时间有密切关系。
使用超声波必须注意的是控制强度在一定限度，即刚好低于溶液产生泡沫的水平。
A.试剂
①测定酶活用试剂：
在实验一已配制
②0.5%燕麦木聚糖：
0.5木聚糖溶于100mL无菌水中，在磁力搅拌器上搅拌使之呈均一的悬浮液，加终浓度0.02%的叠氮化钠防止微生物生长。
③8XBindingbuffer：
40mmol/L咪唑，4mol/LNaCl,160mmol/LpH7.9Tris-HCl，最终pH调到7.9
B．实验设备
分光光度计、水浴锅、pH计、冰、烧杯、煮沸电炉、煮沸用的浮漂、移液管、磁力搅拌器、超声破碎仪、高速离心机、离心管
①取前日分别在0h、2h、4h、6h、8h、10h所取的1mL样品及用适量1XBindingbuffer悬浮的10h发酵结束后的细胞（由100ml发酵液离心来的细胞用4ml1XBindingbuffer重悬），室温溶化后，用超声波破碎仪破碎细胞。
1mL样品的超声条件为：
50Hz超声15s,间隔10秒，如此多次即可。
用1XBindingbuffer悬浮的细胞次数应该适当延长，当溶液变清即可停止。
②破碎后的样品在120**g，4℃离心20min，弃沉淀。
1mL的样品用来检测酶活性，用1XBindingbuffer悬浮的细胞样品次日用于酶的纯化，此时放置于-70℃保存。
③0h、1h、4h、6h、8h、9h、10h时的样品中木聚糖酶活性的测定：
记录好各个取样点时测得的数据，将其代入实验一所得标准曲线方程中后算出每ml发酵液的酶活性。
注意：
每个时刻的样品需做三次平行，所有平行样品应该一批次同时做完，以减小不同批次实验引起的误差；
酶液可能要适当经过稀释，以使最后读出的A405值在0.1～1之间，正式实验前应该做预实验摸索好稀释倍数。
实验四、重组木聚糖酶的纯化
1、实验目的
掌握His-tag亲和层析柱纯化蛋白的方法
2、实验原理
由xynB基因编码的木聚糖酶有很高的热稳定性，在90℃下保温2h，仍然有90%的活性，基于这一点，我们可以先用加热的方法除去酶液中的大部分不耐热的杂蛋白。
蛋白质表面的某些氨基酸残基如：
组氨酸的咪唑基团，半胱氨酸的巯基，色氨酸的吲哚基团（后两种与金属离子的作用要小得多），可与金属离子亲和结合。
用螯合剂可以将金属离子（Cu2+、Zn2+、Ni2+、Co2+）螯合到母体。
洗脱时，可以通过改变盐的浓度等降低金属离子与蛋白质的亲和力将其洗脱。
经典的如组氨酸标签-镍离子亲和柱子（His-tag）：
组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲和配体（也就是填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作用。
洗脱的时候用高浓度的咪唑将蛋白洗下。
组氨酸标签是原核表达载体上6个组氨酸的区段。
在xynB基因编码的C端，我们引物的编码六个组氨酸的CAC密码子，使得重组酶带上组氨酸标签。
Ni-NTA亲和层析介质5ml
8XBindingbuffer：
40mmol/L咪唑，4mol/LNaCl,160mmol/LpH7.9Tris-HCl，最终pH调到7.9
4XElutebuffer：
4mol/L咪唑，2mol/LNaCl,80mmol/LpH7.9Tris-HCl，最终pH调到7.9
8XChargebuffer：
400mmol/LNiSO4
8XWashbuffer：
80mmol/L咪唑，4mol/LNaCl,160mmol/LpH7.9Tris-HCl，最终pH调到7.9
4XStripbuffer：
400mmol/LEDTA，2mol/LNaCl,80mmol/LpH7.9Tris-HCl，最终pH调到7.9
B.实验设备
移液管、试管、分光光度计、pH计、控温水浴锅、煮沸电炉、煮沸用的浮漂、铁架台
①热处理：
将样品装入洗干净的玻璃试管中，在70℃水浴锅中保温30min，然后18000g离心4℃离心30min除去杂蛋白。
①his-tag亲和柱处理
取1mLNi-NTA亲和层析介质填料装柱（根据说明书上填料的吸附能力和样品的多少使用适当体积的填料），接着用3倍柱体积的无菌水洗柱子，再用5柱体积的1XChargebuffer洗柱子，再用3柱体积的1XBindingbuffer洗柱子。
②上样
样品上样前，取出少量样品作为后面的SDS-PAGE实验用。
把样品加入柱子，用10柱体积的1XBindingbuffer洗柱子，接着用6柱体积的1XWashbuffer洗柱子，然后用6柱体积的1XElutebuffer洗脱柱子，此时注意用干净的EP管分部收集洗脱液。
洗脱完后用1XStripbuffer洗柱子。
③对上述收集的洗脱液测定木聚糖酶活，得到较高酶活的部分合并，并留出少量样品作为后面的SDS-PAGE实验用，余下样品在-20℃保存备用。
实验五、纯化酶的电泳检测及比酶活测定
学会采用SDS-PAGE（SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳）分析基因工程产物和蛋白质的纯度鉴定及测定酶的比酶活
SDS-PAGE电泳是主要用来测定蛋白质分子量大小及纯度分析的技术。
如果在PAGE系统中加入十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质的迁移率主要取决于其分子量的大小，而与蛋白质所带的电荷和形状无关。
SDS是阴离子去污剂，它能与蛋白质的疏水部分结合，并能把大多数的蛋白质分子拆分成亚基形式。
由于大多数蛋白质与SDS结合的摩尔比为1.4：
1，结合量很大，因此，加人SDS增加了蛋白质表面的负电荷，屏蔽了没有SDS时正常存在的任何一种电荷。
SDS与蛋白质结合后，引起了蛋白质构象的变化，使得雪茄形状的蛋白质分子的轴比发生改变。
在巯基乙醇的作用下，二硫键还原为巯基，不同蛋白质组成的短轴趋于一致，长轴与分子量成正比。
因此，它们的电泳速度不取决于电荷和形状，仅与蛋白质的分子量有关。
目前较流行的SDS-PAGE使用的都是线性垂直薄板状胶，这种胶是指在两层支持的玻璃板之间形成的薄片状凝胶。
由于薄片胶可在同一胶上跑很多样品，使聚合、染色脱色具有一致性，所以薄片胶比管状胶的应用更广泛，本实验是按照Bio-rad的小凝胶系统来设计的，这些步骤也适用于其他系统。
经过亲和层析和加热纯化后，重组木聚糖酶应该在SDS胶片上显示出一个单一的条带，分子量应该与预期的一样，为40kDa左右。
同一个酶在相同的测定条件下，如果比酶活越高，则表示该酶的纯度越大，本实验中的木聚糖酶经过了亲和层析和加热两步纯化后，比酶活应该逐渐升高，且经过亲和层析后和加热后的比酶活相差不大。
丙烯酰胺（电泳级）
双丙烯酰胺（N,N-甲叉双丙烯酰胺）
Tris碱
SDS（十二烷基磺酸钠，分析纯）
TEMED
过硫酸铵
甘氨酸
B.工作液：
A液:
丙烯酰胺储存液，100ml
30%（w/v）丙烯酰胺，0.8%（w/v）双丙烯酰胺
未聚合的丙烯酰胺是一种皮肤刺激物和神经毒剂，操作时必须戴手套
29.2g丙烯酰胺
0.8g双丙烯酰胺
加蒸馏水溶至100ml，棕色瓶4℃保存
B液：
4ｘ分离胶缓冲液，100ml
75ml2mol/lTris-HCl（pH8.8）
4ml10%SDS
21ml蒸馏水
可在4℃存放数月
C液：
4ｘ堆积胶（浓缩胶）缓冲液，100ml
50ml1mol/lTris-HCl（pH6.8）
46ml蒸馏水
10%过硫酸铵，5ml
0.5g过硫酸铵
5ml蒸馏水
可在密封的管内，4℃存放数月
电泳缓冲液：
1L
3gTris碱
14.4g甘氨酸
1gSDS
加蒸馏水至1L
pH应该在8.3左右，在室温下长期保存
5ｘ样品缓冲液，10ml
0.6ml1mol/lTris-HCl（pH6.8）
5ml50%甘油
2ml10%SDS
0.5ml2-巯基乙醇
1ml1%溴酚蓝
0.9ml的蒸馏水
可在-20℃保存数月
蛋白质电泳装置（垂直板蛋白电泳仪和电源）
电源（电压200V，电流500mA）
100℃沸水浴
移液枪
摇床
1.5mL小所料管
待检测的蛋白质分子量的大小决定了所使用的分离胶的浓度，下面为不同浓度的分离胶的分离范围：
丙烯酰胺在凝胶中的百分比分离胶的范围
15%15～45kDa
12.5%15～60kDa
10%18～75kDa
7.5%30～120kDa
5%60～212kDa
制胶所需时间：
制分离胶60min
制堆积胶30min
上样15min
电泳45min
染色（考马斯亮蓝染色）1h
完全脱色8～12h
X%分离胶的计算：
A液x/3ml
B液2.5ml
蒸馏水（7.5-x/3）ml
10%过硫酸铵50l
TEMED5l
总量10ml
①灌制分离胶
A.将玻璃板洗干净，烘干或者自然风干，装配好灌胶的模具，关键是确保凝胶玻璃板和垫片的表面紧密接触，有细微的不匹配就会导致凝胶的渗漏。
B.将A液、B液在一个小烧杯中混合，丙烯酰胺是神经毒素，操作时必须戴手套。
C.加入过硫酸铵和TEMED后，轻轻搅拌使其混匀，凝胶很快会凝固，所以操作要迅速。
D.小心将凝胶液用吸管或移液枪沿隔片缓慢加入模具内，避免在凝胶内产生气泡。
E.当加入适量的分离胶溶液时（凝胶液加至约距前玻璃板顶端1.5cm或距梳子齿约0.5cm）,轻轻在分离胶溶液上覆盖一层1～5mm的水层或异丙醇，这使凝胶表面变得平整。
F.等待30～60min,使凝胶聚合。
当凝
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