超声波辅助提取豌豆分离蛋白的工艺的比较研究课案.docx
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超声波辅助提取豌豆分离蛋白的工艺的比较研究课案
超声波辅助提取豌豆分离蛋白工艺的对比研究
摘要：
本文主要研究了采用碱溶酸沉法提取豌豆分离蛋白的各个影响因素，同时采用超声波改进的提取工艺与传统工艺，进行比较，通过实验得出传统的碱溶酸沉工艺提取豌豆分离蛋白的最佳工艺为：
固液比为_____，pH为____，提取温度为_____，提取时间为_____，在此提取条件下蛋白质的提取率为______，其中蛋白质的含量为_____。
采用超声波改进工艺后，蛋白质的提取率明显要高于传统工艺，其蛋白质的提取率可以达到_____。
其最佳工艺为：
料液比_____，功率为_____，时间为______。
关键词：
豌豆；分离蛋白；提取；超声波
Abstract
Theinfluentialfactorsoftheextractionofpeaproteinisolatewerestudiedusingsodiumhydroxideastheextractingmenstruum,andimprovedultrasonictechnologycomparedwiththetraditionaltechnology.Theoptimalsolid-liquidratio,pH,extractiontemperatureandextractiontimewereshowedtobe____,_____,_____and_____underwhichistheextractionratiowas____,andtheproteincontentwas____.Theextractionratiocouldgetto___,whichwasoverthetraditionaltechnology.Theoptimalsolid-liquidratio,powerandtimewere____,_____,and___.
Keywords:
pea;proteinisolate;extraction;ultrasonic
目录
1前言
1.1豌豆简介
豌豆（学名PisumsativumL英文名pea）原产于欧洲南部以及地中海沿岸，是一种营养性食品，特别是含铜、铬等微量元素较多，铜有利于造血以及骨骼和脑的发育；铬有利于糖和脂肪的代谢，能维持胰岛素的正常功能。
豌豆中所含的胆碱有助于防止动脉硬化；而且豌豆鲜品所含的维生素C在所有鲜豆中名列榜首。
食用豌豆对糖尿病、高血压、冠心病者、老年人、儿童都有好处。
豌豆所含植物血球凝集素与荚豆含凝集素的作用类似，能凝集人体的红细胞，促进有丝分裂；能激活肿瘤病人的淋巴细胞，产生淋巴毒素，对各种动物细胞有非特异性的伤害作用。
因此，豌豆有防治肿瘤的作用。
1.1.1豌豆的生长与繁殖特征
豌豆属1年生攀缘草本植物，是一种常用蔬菜在欧美国家种植比较普遍我国早在汉朝就开始种植。
根据用途可分为粮用豌豆、菜用豌豆（酣豌豆）及食嫩荚菜用豌豆（荷兰豆）。
粮用豌豆和酣豌豆所结的豆荚的内果皮壁有一层透明的革质膜，坚硬不可食用，称为硬荚豌豆；食用嫩荚的豌豆又称作软荚豌豆。
不同豌豆品种的生长周期不同，为95-130d不等，属耐寒性蔬菜，对外部环境条件的要求不是很严格，生长适宣温度为16-23℃；对光照和水分的需要较为强烈，最好在湿润且长日照的条件下栽种植，对土壤适应性较广，对土壤肥力要求不高且自身根瘤还有料氮作用，但仍以疏松且有机质含量丰富的土壤为宜，忌连续4-5轮种作【1-3】。
1.1.2我国豌豆的种植概况
在我国北方大部分省份，豌豆是一种重要的粮用作物，粮、菜、饲兼用，而在广东、广西、四川、云南等南方诸省广泛种植的则是菜用豌豆。
近一二十年来，菜用豌豆作为一种新兴特种蔬菜在我国各地发展迅速，栽培面积逐年扩大。
因为具有品质脆嫩、清酣芳香、色泽鲜绿、营养丰富等优点，菜用豌豆不仅受到宾馆、饭店的欢迎，而且受到广大普通消费者的青睐，国内市场需求前景看好。
同时，高品质的豌豆产品近几年更成为一种出口创汇的重要速冻、保鲜蔬菜。
1.1.3豌豆的营养价值
豌豆是一种优良的植物蛋白资源。
豌豆籽粒中营养比较齐全，含量丰富。
其基本的组成成分如下：
淀粉含量为52％-55％、蛋白质的含量为23％-25％、粗纤维含量为8％-10％，另外还含有丰富的矿物质元素和维生素等。
豌豆蛋白质占干豌豆的23％-25％。
作为一种食用蛋白添加剂，其蛋白质的营养价值主要取决于其中必需氨基酸的含量和比例以及其生物体的生物利用率。
如表1中指出了豌豆和绿豆、蚕豆以及大豆蛋白质的必需氨基酸的组成和FAO/WHO所推荐的标准模婆堕盔堂堡主堂垡丝塞式通过比较可以发现，豌豆蛋白是一种较好的必需氨基酸源，其组成比较平衡，与FAO/WHO推荐的标准模式较为接近。
它富含赖氨酸，缺乏含硫氨基酸，并与其它的植物蛋白一样，蛋氨酸和胱氨酸是限制氨基酸【4-5】。
表1几种豆类必须氨基酸含量表
Table1Essentialaminoacidsofseveralbeans
必需氨基酸
豌豆
蚕豆
大豆
FAO/WHO
（g/16g）
标准模式
胱氨酸
0.9
0.8
1.3
3.5
蛋氨酸
0.7
0.5
1.3
3.5
赖氨酸
7.2
6.4
6.4
5.5
异亮氨酸
5.0
5.0
4.5
4.0
亮氨酸
8.0
8.4
7.8
7.0
苯丙氨酸
4.9
4.4
4.9
7.0
酪氨酸
3.2
2.3
3.1
6.0
苏氨酸
4.0
3.7
3.9
4.0
色氨酸
1.1
0.9
1.3
1.0
缬氨酸
5.4
5.3
4.8
5.6
豌豆中维生素和矿物质含量也很丰富。
见表2
表2每100g豌豆中所含维生素和矿物质的量
Table2Thecontentofvitaminandmineralcompositionof100gpea
成分
含量
成分
含量
成分
含量
维生素A（mg）
42
硒（mg）
1.69
镁（mg）
118
胡萝卜素（mg）
2.4
维生素E（mg）
8.47
铁（mg）
4.9
视黄醇当量（mg）
10.4
磷（mg）
259
锰（mg）
1.15
硫胺素（mg）
49
钾（mg）
823
锌（mg）
2.35
核黄素（mg）
14
钠（mg）
9.7
铜（mg）
47
烟酸（mg）
2.4
钙（mg）
97
1.1.4豌豆的应用现状
目前国内外对于豌豆的利用主要是以下几种方式：
（1）食用豌豆籽粒磨成粉是制作糕点、豆馅、粉丝、凉粉、面条、风味小吃及多种食品工业的原料。
豌豆的嫩荚和鲜豆可制作罐头。
豌豆及其加工制品是换取外汇的传统出口商品之一。
豌豆的鲜嫩茎悄、豆荚和青豆含有250／旷30％的糖分、多种维生素和矿特质，是优质蔬菜。
（2）饲用和肥用豌豆的鲜嫩茎悄含可消化蛋白质21.2%、氮0.53%、磷0.11%、钾0.25%、产草量高，是家畜的优质饲料，做绿肥翻压入土，其茎叶易腐解发挥肥效。
此外，豌豆的棣系吸肥力强，能吸收土壤深层养分，也是轮作中的优良的农作物，是非常好的绿色肥料。
（3）药用豌豆性味甘平，有利小便、解疮毒的功效。
豌豆煮食能生津止渴、消
肿胀。
鲜豌豆榨汁饮服可治糖尿病。
豌豆研成粉末涂患处，可治痈肿、痔疮。
目前国内对于豌豆的深加工和综合利用还处于起步阶段。
有许多做粉丝的厂家主要
是将豌豆中的淀粉加工成粉丝，而将剩下的蛋白及膳食纤维等用作饲料。
1.2小结
鉴于豌豆分离蛋白的广泛应用，而对豌豆分离蛋白提取工艺的研究有待进一步的提高。
本次实验设计了针对豌豆分离蛋白的提取工艺的不同方法进行研究比较，进一步优化豌豆分离蛋白的提取工艺，利用微波辅助进行提取，首次运用考马斯亮蓝法进行蛋白质定量测定。
从而比较传统工艺和改进工艺在微波辅助的条件下，豌豆分离蛋白的提取率。
2实验部分
2.1材料与设备
原材料：
豌豆（市售，购于华联超市，呈球状、粒饱满、绿皮）
试剂：
乙醇（分析纯，天津市北方天医化学试剂厂）
85%磷酸（分析纯，天津市红岩化学试剂厂）
氢氧化钠（分析纯，天津市光复科技发展有限公司）
磷酸氢二钠（分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）
磷酸二氢钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）
牛血清蛋白（生物纯，北京奥博星生物技术有限责任公司）
考马斯亮蓝G-250（国药集团化学试剂有限公司）
盐酸（分析纯，北京化工厂）
设备：
紫外可见分光光度计（TU—1810，北京普析通用仪器有限责任公司）
石英亚沸高纯水蒸馏器（SYZ—550型，江苏省金坛市恒丰仪器厂）
微型植物粉碎机（FZ102，天津市泰斯特仪器有限公司）
电子天平（FA1104型，上海良平仪器仪表有限公司）
酸度计（PB—10，赛多利斯科学仪器有限公司）
旋转蒸发器（RE—52，上海亚荣生化仪器厂）
台式离心机（80—2B，上海安亭科学仪器厂）
架盘天平（JP型，上海力能电子仪器公司）
电热恒温水浴锅（DK-93-11，天津市泰斯特仪器有限公司）
超声波清洗器（KH3200B，昆山禾创超声仪器有限公司）
2.2实验方法
2.2.1豌豆分离蛋白的提取[6-8]
2.2.1.1碱溶酸沉工艺
将市售的干豌豆用粉碎机磨制成100目的干豌豆粉，称取5.00g豌豆粉，放入250mL锥形瓶中，用一定料液比的磷酸缓冲溶液，在一定的pH、温度下浸提一定的时间。
然后以3000r/min，离心30min，收集上清液，用0.05mol/L盐酸调节其pH到4.5进行酸沉，再以3500r/min，离心30min，收集沉淀，用20mL蒸馏水清洗2～3次，用0.05mol/L氢氧化钠调节其pH到7.0，然后进行旋转蒸发，得到豌豆分离蛋白。
在最大吸收波长下，采用考马斯亮蓝法测定其吸光度值。
2.2.1.2超声波辅助工艺
将市售的干豌豆用粉碎机磨制成100目的干豌豆粉，称取5.00g豌豆粉，放入250mL锥形瓶中，用一定料液比的磷酸缓冲溶液，在一定的pH、一定的功率下超声波提取一定时间。
然后以3000r/min离心30min，收集上清液，用0.05mol/L盐酸调节其pH到4.5进行酸沉，再以3500r/min离心30min，收集沉淀，用蒸馏水清洗2~3次，用0.05mol/L氢氧化钠调节其pH到7.0，然后进行旋转蒸发，得到豌豆分离蛋白。
在最大吸收波长下，采用考马斯亮蓝法测定其吸光度值。
2.2.2豌豆分离蛋白的测定
2.2.2.1主要试剂配制
标准蛋白（100μg/mL牛血清蛋白）：
称取25mg牛血清蛋白，加蒸馏水溶解并定容至100mL，吸取上述溶液40mL，用蒸馏水稀释并定容至100mL即可。
考马斯亮蓝G-250：
称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml90%乙醇溶液，再加入100mL85%磷酸，混合摇溶，将混合液转移到1000mL容量瓶中，加入蒸馏水稀释并定容至刻度，于棕色瓶中放置备用。
2.2.2.2豌豆分离蛋白含量的测定
将上述提取的分离粗提液进行测定，根据试验得出的标准曲线算出浓度C，再根据公式算出豌豆中分离蛋白含量。
计算公式：
（1）
M1————豌豆分离蛋白含量，mg/100g
C————蛋白粗提液浓度，μg/mL
Vc————用缓冲液洗沉淀所得体积，mL
V————第一次离心后上清液的体积，mL
V0————移取样品溶液的体积，mL
m————豌豆粉的质量，g
将剩下的粗提液进行浓缩、旋转蒸发得到豌豆分离蛋白粉末，计算所得豌豆分离蛋白的含量。
公式
（2）：
（2）
m0————豌豆分离蛋白粉末质量，g
2.2.2.3最大吸收波长的确定
取三支试管，分别加入1ml牛血清蛋白和5ml考马斯亮蓝溶液，1ml蛋白粗提液和5ml考马斯亮蓝溶液，1ml蒸馏水和5ml考马斯亮蓝溶液，在分光光度计下扫描，根据扫描的曲线，确定最大吸收波长。
2.2.2.4标准曲线的制作
取六支试管，在各试管中依次加入0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml牛血清蛋白（蛋白含量100μg/mL），1.0ml、0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml、0ml蒸馏水，每个试管加5ml考马斯亮蓝溶液，将各试管摇匀，放置20min，用分光光度计测定吸光度值，以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
2.3碱溶酸沉提取工艺的单因素实验
2.3.1料液比对蛋白含量的影响
称取五份5.0g干豌豆粉，加入pH8.5的磷酸盐缓冲溶液，分别为1:
15、1:
20、1:
25、1:
30、1:
35的料液比，温度为45℃，浸提55min，将粗提液用四层纱布过滤，以3000r/min离心30min，量取上清液体积，用0.05mol/L盐酸调节其pH到4.5进行酸沉，再以3500r/min，离心30min，收集沉淀，用20mL一定量的蒸馏水清洗2~3次，即得豌豆分离蛋白。
在最大吸收波长下测其吸光度值，计算蛋白含量。
2.3.2浸提pH对蛋白含量的影响
称取五份5.0g干豌豆粉，料液比为2.3.1确定的条件下，加入pH分别为8.0、8.5、9.0、9.5、10的磷酸缓冲溶液，温度为45℃、时间为55min，将粗提液用四层纱布过滤，以3000r/min离心30min，量取上清液体积，用0.05mol/L盐酸调节其pH到4.5进行酸沉，再以3500r/min，离心30min，收集沉淀，用一定量的蒸馏水清洗2～3次，即得豌豆分离蛋白。
在最大吸收波长下测其吸光度值，计算蛋白含量。
2.3.3浸提温度对蛋白含量的影响
称取五份5.0g干豌豆粉，按2.3.1及2.3.2确定的料液比及pH的条件下，时间为55min，温度分别在30、40、50、60℃下浸提，将粗提液用四层纱布过滤，以3000r/min离心30min，量取上清液体积，用0.05mol/L盐酸调节其pH到4.5进行酸沉，再以3500r/min，离心30min，收集沉淀，用一定量的蒸馏水清洗2～3次，即得豌豆分离蛋白。
在最大吸收波长下测其吸光度值，计算蛋白含量。
2.3.4浸提时间对蛋白含量的影响
称取五份5.0g干豌豆粉，按以上三步确定的浸提条件，时间分别为20、30、40、50、60min下浸提，将粗提液用四层纱布过滤，以3000r/min离心30min，量取上清液体积，用0.05mol/L盐酸调节其pH到4.5进行酸沉，再以3500r/min，离心30min，收集沉淀，用一定量的蒸馏水清洗2～3次，即得豌豆分离蛋白。
在最大吸收波长下测其吸光度值，计算蛋白含量。
2.4碱溶酸沉提取工艺的正交实验
通过单因素试验，利用正交分析法，选取水平显著的几个单因素，各取三个水平，通过方差分析可得出各因素的显著程度，通过直观分析和验证实验确定最佳提取条件。
2.5碱溶酸沉提取工艺的响应面分析
利用响应面分析法，对数据进行处理和分析，通过方差分析可以得到各因素对豌豆分离蛋白函数的影响的显著程度，根据图像中曲线的走势及斜率可直观的看出优化区域，进而确定最佳提取工艺。
2.6超声波辅助提取工艺的单因素实验
2.6.1料液比对蛋白含量的影响
称取五份5.0g干豌豆粉，加入pH8.0的磷酸盐缓冲溶液，分别为1:
10、1:
15、1:
20、1:
25、1:
30的料液比，温度为45℃，功率为800W的超声波条件下浸提30min，将粗提液用四层纱布过滤，以3000r/min离心30min，量取上清液体积，用0.05mol/L盐酸调节其pH到4.5进行酸沉，再以3500r/min，离心30min，收集沉淀，用一定量的蒸馏水清洗2~3次，即得豌豆分离蛋白。
在最大吸收波长下测其吸光度值，计算蛋白含量。
2.6.2功率对蛋白质提取率的影响
称取五份5.0g干豌豆粉，料液比为2.6.1确定的条件下，加入pH分别为7.0、7.5、8.0、8.5、9.0的磷酸缓冲溶液，温度为45℃，功率为800W的超声波条件下浸提30min，将粗提液用四层纱布过滤，以3000r/min离心30min，量取上清液体积，用0.05mol/L盐酸调节其pH到4.5进行酸沉，再以3500r/min，离心30min，收集沉淀，用一定量的蒸馏水清洗2～3次，即得豌豆分离蛋白。
在最大吸收波长下测其吸光度值，计算蛋白含量。
2.6.3时间对蛋白质提取率的影响
称取五份5.0g干豌豆粉，按以上两步确定的浸提条件，时间分别为10、20、30、40、50min，温度为45℃，功率为800W的超声波条件下浸提，将粗提液用四层纱布过滤，以3000r/min离心30min，量取上清液体积，用0.05mol/L盐酸调节其pH到4.5进行酸沉，再以3500r/min，离心30min，收集沉淀，用一定量的蒸馏水清洗2～3次，即得豌豆分离蛋白。
在最大吸收波长下测其吸光度值，计算蛋白含量。
2.7超声波辅助提取工艺的正交实验
通过单因素试验，利用正交分析法，选取水平显著的几个单因素，各取三个水平，通过方差分析可得出各因素的显著程度，通过直观分析和验证实验确定最佳提取条件。
2.8超声波辅助提取工艺的响应面分析
利用响应面分析法，对数据进行处理和分析，通过方差分析可以得到各因素对豌豆分离蛋白函数的影响的显著程度，根据图像中曲线的走势及斜率可直观的看出优化区域，进而确定最佳提取工艺。
3结果与分析
3.1最大吸收波长的确定
表1最大吸收波长
Table1Themaximumabsorptionwavelength
波长
（nm）
吸光值
（A）
520
540
560
580
600
620
640
660
680
700
720
740
标准蛋白
0
0.1873
0.3652
0.5087
0.5660
0.5130
0.4222
0.3226
0.2463
0.1658
0.1063
0.0687
豌豆蛋白
0
0.1478
0.2642
0.3401
0.3660
0.3390
0.2989
0.2447
0.1967
0.1459
0.0956
0.0549
图1最大吸收波长
Figure1Themaximumabsorptionwavelength
3.2标准曲线
表2牛血清蛋白标准曲线
Table2Standardcurveofbovinealbumin
标准蛋白浓度（μg/mL）
0
20
40
60
80
100
吸光值（A）
0
0.062
0.129
0.197
0.277
0.362
图2牛血清蛋白标准曲线
Figure2standardcurveofbovinealbumin
由图2可得到回归方程为：
y=0.0036x-0.0090，相关系数为R2=0.9962。
3.3碱溶酸沉提取工艺的单因素实验
3.3.1料液比的确定
表4料液比的确定
Table4Thedeterminationofsolid-liquidratio
料液比（m/v）
1:
15
1:
20
1:
25
1:
30
1:
35
吸光度值（A）
0.348
0.358
0.394
0.338
0.298
蛋白含量（mg/100g）
30.50
41.78
57.22
59.33
61.44
图3料液比的确定
Figure3Thedeterminationofsolid-liquidratio
由图3可知，随着料液比的增大，豌豆分离蛋白提取量逐渐增大，当料液比为1:
25时，即缓冲液为125mL时蛋白质的提取量达最大，继续增大料液比，蛋白质提取量继续增大，但增加量不明显，可能由于稀释作用大于蛋白质溶出；低料液比条件下不利于蛋白质充分溶出。
故确定提取蛋白最佳料液比为1:
25。
3.3.2缓冲溶液pH的确定
表5缓冲溶液pH的确定
Table5ThedeterminationofbufferwiththepH
pH
8.0
8.5
9.0
9.5
10.0
吸光度值（A）
0.342
0.384
0.468
0.477
0.484
蛋白含量（mg/100g）
48.75
54.58
66.25
67.50
68.47
图4缓冲溶液pH的确定
Figure4ThedeterminationofbufferwiththepH
由图4可知，随着pH的增大，蛋白质含量逐渐增大。
在pH大于9.0时，曲线增加不明显，可能由于碱性增强，增加了部分蛋白质的水溶性，同时，当碱性过强时，容易发生蛋白质脱羧、脱氨等，引起胱赖反应，产生有毒物质，同时还会产生异味[36][36]钱芳,邓岩,玉凤翼,等.蛋白酶及其大豆蛋白水解物苦味的研究[J]．大连轻工业学报,2000,19（3）,182-185，造成蛋白质的损失，故蛋白质的提取含量增加不大，综合考虑，最佳提取pH为9.0。
3.3.3提取温度的确定
表6提取温度的确定
Table6Thedeterminationofextractiontemperature
提取温度（℃）
25
35
45
55
65
吸光度值（A）
0.358
0.375
0.427
0.425
0.418
蛋白含量（mg/100g）
50.97
53.33
60.56
60.28
59.31
图5提取温度的确定
Figure5Thedeterminationofextractiontemperature
由图5可知，当温度低于45℃时，蛋白质含量增加；当温度高于45℃时，蛋白质含量有所下降。
因此确定最佳提取温度为45℃。
3.3.4提取时间的确定
表7提取时间的确定
Table7Thedeterminationofextractiontime
提取时间（min）
35
45
55
65
75
吸光度值（A）
0.338
0.366
0.411
0.418
0.424
蛋白含量（mg/100g）
48.91
52.08
58.33
59.31
60.14
图6提取时间的确定
Figure6Thedeterminationofextractiontime
由图6可知，在提取时间小于55min时，蛋白含量随着时间的延长而增大，变化较为明显；当提取时间大于55min时，蛋白质溶出率达到动态平衡，所以蛋白质的提取率基本没有什么变化。
因此，确定最佳提取时间为55min。
3.4碱溶酸沉提取工艺的正交实验
表8正交实验结果直观分析表L9（34）
Table7Orthogonal
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